正交法篩選超聲提取銀杏果中黃酮及多糖的工藝

蘇曉丹，李延霞，艾 琰，張 莉*，黃建軍*

（山東大學(xué)威海校區(qū)，海洋學(xué)院藥學(xué)專(zhuān)業(yè)·山東威?！?64209）

銀杏果，又名白果，系銀杏科植物銀杏（Ginkgo biloba L.）的干燥成熟種子，《中華本草》中記載銀杏果具有斂肺定喘，止帶濁，縮小便的作用?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究又發(fā)現(xiàn)銀杏果對(duì)肥胖具有緩解作用[1]，還有抑制癌細(xì)胞擴(kuò)散的作用，并且在抗自由基、抗血栓、改善微循環(huán)[2]等方面具有顯著作用，因此在心腦血管疾病、老年癡呆、精神分裂癥等方面有獨(dú)特療效。

銀杏果中的有效成分是其藥理作用和臨床應(yīng)用的物質(zhì)基礎(chǔ)，銀杏種子中化學(xué)成分主要含有黃酮類(lèi)、萜類(lèi)、生物堿、多糖、氨基酸、蛋白質(zhì)和微量元素等，還含有氫化白果酸、銀杏內(nèi)酯等成分[3]。除此之外，銀杏中還含有具有一定毒性的白果酸、氫化白果酸等物質(zhì)，必須經(jīng)過(guò)加熱處理除去這類(lèi)物質(zhì)方能食用。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)銀杏葉提取物尤其是銀杏黃酮的研究較多，銀杏果方面的研究較少，使得銀杏果資源得不到重視，而我國(guó)2015年全國(guó)銀杏果總產(chǎn)量已超過(guò)18000噸，銀杏果有效成分的提取仍為當(dāng)今時(shí)代一大熱點(diǎn)問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)采用正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)黃酮和多糖進(jìn)行優(yōu)化提取，為銀杏果的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 原料

干燥銀杏果。

1.2 試劑

濃硫酸（H2SO4，AR）；苯酚（C6H5OH，AR）；葡萄糖（C6H1206·H2O，AR)； 蘆丁 （C27H30O16，AR）；三氯化鋁（AlCl3·6H2O，AR）；乙酸鉀（C2H3O2K，AR）。

1.3 儀器

超聲波清洗器（SK8210LHC，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；低速離心機(jī)（SC3610，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；752型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）；電熱恒溫水浴鍋，分析天平，稱(chēng)量瓶，容量瓶，燒杯，膠頭滴管，洗耳球，移液管，20目藥典篩。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 多糖含量測(cè)定方法

2.1.1 溶液的配制

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（0.1 mg/mL）的配制：精密稱(chēng)取10 mg葡萄糖，用純水溶解，定容至100 mL，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

5%苯酚溶液（w/v）的配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取5.0 g苯酚固體，溶于純水中，水浴加熱至65℃輔助溶解，100 mL容量瓶定容，注意避光密閉保存。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.0（校正液）、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，各以水補(bǔ)至 2 mL，再加入1.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%苯酚溶液，搖勻，使其充分反應(yīng)，再加入5.0 mL濃硫酸，靜置10 min后再次搖勻，室溫下放置20 min后，在490 nm處測(cè)定吸光度，每組平行測(cè)定三次[4]。以葡萄糖質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度平均值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.1.3 多糖含量測(cè)定

取5 mL提取液稀釋定容于 100 mL容量瓶中，準(zhǔn)確稱(chēng)取 1 mL多糖待測(cè)液，加入 1 mL純水，再加入5%的苯酚溶液1.0mL，先搖勻，再加入5.0 mL濃硫酸，靜置 10 min，再次搖勻，室溫下放置 20 min，于490 nm處測(cè)定吸光度，將其代入回歸方程，計(jì)算待測(cè)液中多糖濃度。

2.2 黃酮含量測(cè)定方法

2.2.1 溶液的配制

0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液：精密稱(chēng)取0.0200 g蘆丁，加入70%甲醇80℃水浴輔助溶解，定容到100 mL容量瓶中。

0.1 mol/L AlCl3溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取 AlCl3·6 H2O 固體2.4 g，用蒸餾水溶解，100 mL容量瓶定容。

1 mol/L乙酸鉀溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取乙酸鉀固體9.8g，溶于蒸餾水中，100 mL容量瓶定容。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確移取0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0.00（校正液）、0.25、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL 分別 置 于 10 mL容量瓶中；加入0.1 mol/L AlCl3溶液2 mL、1 mol/L乙酸鉀溶液3 mL，用體積分?jǐn)?shù)70%甲醇定容至10 mL，室溫放置30 min。在波長(zhǎng)420 nm處測(cè)定溶液吸光度。每組平行測(cè)定三次[5～7]。

以蘆丁質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，以吸光度平均值( )為縱坐標(biāo)，繪制黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.3 樣品含量的測(cè)定

精確移取1 mL提取液，加入0.1 mol/L AlCl3溶液2 mL、1 mol/L乙酸鉀溶液3 mL，用體積分?jǐn)?shù)70%甲醇定容至10 mL，搖勻，室溫放置30 min。測(cè)定420 nm處吸光度，將其代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算提取液中黃酮濃度。

2.3 提取工藝流程

銀杏果去皮磨粉→過(guò)篩→稱(chēng)取一定質(zhì)量銀杏果粉→水浴加熱→超聲預(yù)熱→超聲提取一定時(shí)間→3000 r/min，10min離心→上清液→混勻→按上述步驟測(cè)定吸光度[4，8]

2.4 提取率的計(jì)算

根據(jù)所測(cè)吸光度，計(jì)算相應(yīng)提取液中多糖及黃酮的含量，按下列公式計(jì)算提取率：

總提取率=多糖提取率+黃酮提取率

2.5 單因素實(shí)驗(yàn)

選取料液比、溫度、超聲時(shí)間三個(gè)主要因素，分別設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)水平的單因素實(shí)驗(yàn)。

2.5.1 料液比

固定超聲溫度為40℃，超聲時(shí)間為20 min，選取料液比分別為 1∶10，1∶20，1∶30，1∶40、1∶50 各平行提取三次，測(cè)定吸光度并計(jì)算提取率平均值。

2.5.2 超聲溫度

固定料液比為1∶20，超聲時(shí)間為20 min，選取超聲溫度分別為30℃，40℃，50℃，60℃各平行提取三次，測(cè)定吸光度并計(jì)算提取率平均值。

2.5.3 超聲時(shí)間

固定料液比為1：20，超聲溫度為40℃，選取超聲時(shí)間分別為 10，20，30，40，50 min 各平行提取三次，測(cè)定吸光度并計(jì)算提取率平均值。

2.6 正交實(shí)驗(yàn)

綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取A=料液比、B=超聲溫度、C=超聲時(shí)間三個(gè)因素設(shè)立3因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)（各因素間無(wú)交互作用）[9～11]。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因子水平

3 結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.1.1 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

以葡萄糖質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度平均值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。擬得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=13.857x-0.0399，R2=0.9999.

3.1.2 黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線

以蘆丁質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，以吸光度平均值為縱坐標(biāo)，繪制黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線。擬得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 y=13.865x-0.0025，R2=0.9999.

3.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 料液比

離心后取上清液按標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟分別測(cè)定吸光度值，平行測(cè)定三次取平均值，計(jì)算提取率，繪制料液比對(duì)提取率的影響圖如下。由圖像易知：多糖和黃酮的提取率均呈先增后減的趨勢(shì)，分析原因應(yīng)是在達(dá)到最佳料液比之前時(shí)，溶劑越多，所能容納物質(zhì)越多，越有利于多糖和黃酮的析出，但溶劑過(guò)多時(shí)，會(huì)造成雜質(zhì)析出增多，干擾物質(zhì)含量的測(cè)定。在其他因素確定的情況下，多糖提取的最佳料液比為1∶30，黃酮提取的最佳料液比為1∶40由于黃酮量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于多糖提取量，故總提取率的最佳料液比主要受多糖影響，同為1∶30。

圖1 料液比對(duì)多糖提取率的影響

圖2 料液比對(duì)黃酮提取率的影響

圖3 料液比對(duì)總提取率的影響

3.2.2 超聲溫度

離心后取上清液按標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟測(cè)定吸光度值，平行測(cè)定三次取平均值，計(jì)算提取率，繪制超聲溫度對(duì)提取率的影響圖如下。在一定溫度范圍內(nèi)，溫度越高，提取率越高；當(dāng)達(dá)到最佳溫度后，提取率隨溫度的升高而降低。黃酮和多糖的最佳溫度均為40℃，總提取率的最佳溫度也為40℃。分析原因：低于40℃時(shí)，隨溫度升高破壁率升高，但溫度過(guò)高時(shí)，一方面雜質(zhì)析出增多，導(dǎo)致測(cè)得提取率下降；另外在超聲波的作用下，可能會(huì)造成物質(zhì)空間構(gòu)型的改變失活，導(dǎo)致提取率下降。

圖4 超聲溫度對(duì)多糖提取率的影響

圖5 超聲溫度對(duì)黃酮提取率的影響

圖6 超聲溫度對(duì)總提取率的影響

3.2.3 超聲時(shí)間

離心后取上清液按標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟測(cè)定吸光度值，平行測(cè)定三次取平均值，計(jì)算提取率，繪制超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響如下。由圖易知：在20 min之前多糖提取率呈上升趨勢(shì)，而超過(guò)20 min后提取率呈下降趨勢(shì)，最佳提取時(shí)間即為20 min；黃酮的最佳提取時(shí)間為30 min；總的最佳提取時(shí)間為20 min。提取時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞壁破碎越完全，但超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，同樣可能會(huì)導(dǎo)致空間構(gòu)型的改變、雜質(zhì)的溶出，提取率下降。

圖7 超聲時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

圖8 超聲時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響

3.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖9 超聲時(shí)間對(duì)總提取率的影響

表2 正交實(shí)驗(yàn)表L9（33）

表3 方差分析

由正交試驗(yàn)結(jié)果可知，各因素對(duì)總提取率的影響按大小次序依次為A（料液比）＞C（超聲時(shí)間）＞B（超聲溫度），各因素均無(wú)顯著性差異；最優(yōu)實(shí)驗(yàn)方案應(yīng)為A2C3B2，即：

A2：料液比，第 2 水平，1：30

C3：超聲時(shí)間，第 3 水平，30 min

B2：超聲溫度，第 2 水平，40℃

對(duì)應(yīng)為實(shí)驗(yàn)5，提取率也為9次實(shí)驗(yàn)中最高，說(shuō)明我們找出的最優(yōu)方案符合實(shí)際。

4 結(jié)果

本次實(shí)驗(yàn)采用硫酸-苯酚法和三氯化鋁顯色法分別測(cè)定銀杏果提取液中多糖和黃酮含量，最終確定銀杏果多糖和黃酮的超聲波輔助提取法的最佳條件為：料液比：1：30，超聲時(shí)間：30 min，溫度：40 ℃，總提取率可達(dá)12.27%.其中各因素對(duì)總提取率的影響按大小次序依次為料液比＞超聲時(shí)間＞超聲溫度。

5 討論與展望

在實(shí)驗(yàn)中，由于溶劑為水以及黃酮與多糖分子量差距較大，總提取率與多糖提取率十分相近?？筛鶕?jù)待測(cè)性質(zhì)重新構(gòu)建總提取率的模型，例如添加系數(shù)等，使總提取率更有參考價(jià)值。

提取液中多糖和黃酮均有顯著的抗氧化性，可作為抗氧化劑清除外來(lái)或內(nèi)源自由基，防止其引起多不飽和脂肪酸等物質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的物質(zhì)。因此可用于預(yù)防或治療多種ROS（活性氧簇）誘導(dǎo)疾病，例如癌癥和各類(lèi)心血管疾病，也可用于抗炎、抗衰老。除此之外，銀杏種仁中還含有多種人體必需氨基酸，有助于改善健康狀況，提高免疫力；還含有較多的鉀、鎂、鈣、磷、鐵、錳、銅等微量元素，對(duì)于維持人體生命活動(dòng)有著極其重要的意義。據(jù)此，我們可利用提取液開(kāi)發(fā)保健藥品、保健食品等。此外，銀杏果中還含有某些殺菌物質(zhì)，可用于緩解酒糟鼻、粉刺、手足皸裂等皮膚疾病，還可以應(yīng)用到護(hù)膚品中，從而更充分的利用我國(guó)現(xiàn)有的銀杏果資源[12]。