穴位注射溫敏水凝膠對坐骨神經痛大鼠的效果及應用

衛(wèi)彎，姚勇，楊華元

（上海中醫(yī)藥大學，上海 201203）

羊腸線是臨床上最常用的穴位埋線材料之一，具有一定的治療作用，但存在功能單一、埋植工具成本高、部分患者對其過敏等問題［1-2］。具有三維網絡結構的水凝膠材料因其良好的生物相容性、生物可降解性、可注射性以及藥物緩釋作用，已逐漸成為穴位埋植材料的首選之一［3-4］。本研究從生物相容性良好的可注射CS/GP 水凝膠在室溫下呈液態(tài)、37 ℃下可固化的特點出發(fā)，同時裝載地塞米松（DXM），不僅可以通過使藥物緩釋以減少直接給藥的副作用，注射后還可以通過溶膠-凝膠轉變的方式粘附于穴位進行持久刺激?；诖?，本研究通過比較其與羊腸線埋線法對坐骨神經痛大鼠的治療效果，挖掘其鎮(zhèn)痛機制，并探索其是否可作為穴位埋線的替代材料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用健康清潔級SD 大鼠，體質量（200±20）g，購于上海中醫(yī)藥大學，動物許可證號：SCXK（滬）2018-0006。飼養(yǎng)在上海中醫(yī)藥大學實驗技術中心，飼養(yǎng)條件為光照周期12 h/12 h，室溫22～25 ℃，相對濕度45%～60%。大鼠自由進食、飲水，整個實驗過程遵照中華人民共和國科技部2016年頒布的《有關動物的使用及倫理學規(guī)定》。

1.2 主要儀器和試劑

殼聚糖（CS，貨號：C105799，中國上海阿拉丁公司）；鹽酸溶液（批號：10011028，國藥集團）；β-甘油磷酸酯（β-GP，批號：D106347，上海阿拉丁科技有限公司）；DXM（貨號：60231A，Adamas）；水浴鍋（HH-S單孔，長城）；大鼠ELISA 試劑盒TNF-α（批號：xy-E1275，上海信裕生物科技有限公司）；大鼠ELISA試劑盒IL-1β（批號：xy-E12689，上海信裕生物科技有限公司）；兔抗Iba1 抗體（貨號：#17198，CST）；羊抗P2X4R 抗體（貨號：ab134559，Abcam）；2450 型爪痛覺測試儀（美國IITC Life Science 公司）；熒光顯微鏡（ECLIPSE Ni，NIKON公司）。

1.3 水凝膠的制備

在連續(xù)磁力攪拌下，將CS（200 mg，脫乙酰度為90%～95%，分子量中等）中加入鹽酸溶液（配制濃度0.1 mol/L，10 mL）2 h，隨后在連續(xù)攪拌下逐滴加入β-GP 溶液（56% W/V，2 mL）。將DXM（12 mg）溶解在上述CS/GP溶液中。

1.4 分組、造模與干預

將40 只健康雄性SD 大鼠隨機分為對照組（Control 組）、模型組（CCI 組）、羊腸線埋植組（Catgut組）、CS/GP 組和CS/GP/DXM 組，每組各8 只。除Control組外，對其余組大鼠進行CCI造模。

CCI 大鼠模型的建立：SD 大鼠于造模前1 d 禁食、禁水，腹腔麻醉（0.3% 戊巴比妥鈉，給藥劑量為1 mL/100 g）。麻醉成功后，在大鼠右腿后側中部進行消毒，鋪無菌巾，切開皮膚約2 cm，鈍性分離股二頭肌，暴露右坐骨神經中段。用4-0絲線松散結扎4次，每次結扎間隔1 mm，松緊度以結扎絲線能在坐骨神經干上滑動，大鼠肌肉輕微顫動為宜。密切觀察大鼠的生命體征和傷口愈合情況。

造模完成后，CS/GP 組和CS/GP/DXM 組分別在足三里（ST36）穴處注射0.1 mL 相應水凝膠，Catgut 組在足三里穴處埋植2 mm 左右羊腸線。各治療組均每周進行1次治療。

1.5 檢測指標

1.5.1 溫敏性實驗

水凝膠的溫敏性通過玻璃瓶倒置方法進行測試，控制溫度在37 ℃左右時進行，將玻璃瓶傾斜放置30 s后，若溶液不再流動，意味著溶液已完全轉化為凝膠。

1.5.2 生物相容性

將12 只雄性SD 大鼠隨機分為對照組（PBS 組）、CS/GP 組與CS/GP/DXM 組，每組各4 只。對照組大鼠在第7 頸椎的椎體處（頸部和背部的交界處）皮下注射200 μL 的PBS；CS/GP 組與CS/GP/DXM 組大鼠在與陰性對照組相同的解剖部位注射200μL 相應的水凝膠。2 周后取注射處皮膚組織，在4%的聚甲醛（PFA）中固定2 d，在一系列乙醇中脫水后，嵌入石蠟中，切3 μm的厚片，然后進行HE 染色，通過HE 染色評價水凝膠的相容性。

1.5.3 行為學評價

機械刺激縮足反射閾值（PMWT）測定：術前和術后第1、3、5、7、10、14 天用電子Von Frey 痛覺測試儀測量SD 大鼠的右后爪痛覺。將大鼠放在籠子里30 min，當大鼠安靜時，逐漸對手術側的腳底施加壓力，直到出現抬腳、避讓或舔腳等動作。記錄出現陽性反應時施加在腳底的最大壓力，并以5 min 為間隔重復測量3次。

1.5.4 ELISA檢測方法

采用ELISA 法檢測大鼠血清中TNF-α 與IL-1β的表達。術后第14 天對大鼠進行麻醉，鈍性分離組織器官，暴露腹主動脈，從腹主動脈采集5 mL 血液，4 ℃下3 000 r/min 離心15 min，用吸管吸出上清液。嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行測定。

1.5.5 免疫熒光技術檢測脊髓L4～L6背角的Iba1 及P2X4R的表達量

術后第14 天對大鼠進行麻醉后取材，取材部位為L4～L6脊髓節(jié)段，多聚甲醛中固定2 h 后，在含有25%蔗糖的0.1 mmol/L PBS 中保存48 h，在冷凍切片機上切片。室溫封閉1 h 后，分別加入稀釋濃度為1∶1 000的一抗（Iba1 與P2X4R），4 ℃下15 h 后，將切片用0.01 mol/L PBS 洗3 次，滴加二抗與顯色劑，于顯微鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計學方法

所有實驗數據均使用SPSS 26.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，并使用GraphPad Prism 5.01 繪圖。采用雙變量方差分析和邦弗朗尼Bonferroni 事后檢驗比較各組在不同時間點的PMWT；采用單因素方差分析對各組生化指標進行比較。數據以均數±標準差（±s）表示，以P＜0.05代表差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 水凝膠的溫敏性實驗結果

溫敏性實驗結果表明，CS/GP 在室溫下為淡黃色透明液體，流動性好，液面隨試管的傾斜而變化，溶液狀態(tài)有利于它的可注射性；在37 ℃以上的水浴中加熱5 min 后，CS/GP 液體迅速轉變?yōu)槟z狀固體，附著在試管壁上，呈淡黃色，性質均勻，渾濁不透明，試管傾斜時凝膠固定，失去流動性，注射于穴位后可以凝固成膠狀粘附于穴位，達到長時程刺激穴位的作用。見圖1。

2.2 水凝膠生物相容性結果

CS/GP 和CS/GP/DXM 水凝膠注射在SD 大鼠體內后并未發(fā)生擠壓變形等情況，且在皮膚組織下很好地形成了膠體。SD 大鼠的生理溫度約為37 ℃，可以清楚地觀察到，水凝膠可在其背部皮膚上形成凝膠，失去流動性，并與周圍組織粘連，而且沒有觀察到局部發(fā)紅、腫脹或壞死等炎癥反應，可以實現對穴位的持續(xù)長時間刺激，見圖2 a1～a3。HE染色發(fā)現，水凝膠在大鼠皮下與周圍組織有良好的分界和固定性，見圖2 b1～b3。在水凝膠注射部位周圍的皮膚組織中可以觀察到清晰的界限。結果表明水凝膠具有良好的生物相容性，可用作穴位埋植的可替代材料之一。

2.3 各組大鼠PMWT結果比較

各組大鼠造模前PMWT 的基礎測量值并無差異。單側坐骨神經結扎后，CCI 組大鼠在1 d 內同側后爪出現明顯的痛覺過敏，并持續(xù)了約14 d。而Control組同側后爪的PMWT 可以保持穩(wěn)定14 d。注射CS/GP/DXM 水凝膠后第1 天，大鼠的PMWT 即開始增加，并在14 d 內有明顯改善。此外，在第1 天治療后到第14 天治療結束時，與CCI 組、Catgut 組比較，在這些不同的治療時間點上CS/GP/DXM 組的PMWT 均明顯提高（P＜0.001），而CS/GP 組和CCI 組差異無統(tǒng)計學意義。結果表明載藥水凝膠在一定治療劑量范圍內可以明顯緩解CCI 大鼠的痛敏情況。見表1和圖3。

表1 各組大鼠治療后PMWT結果比較（±s，g）

表1 各組大鼠治療后PMWT結果比較（±s，g）

注：與CCI組比較，***P ＜0.001；與Catgut組比較，&&&P ＜0.001。

組別Control組CCI組Catgut組CS/GP組CS/GP/DXM組造模前49.73±2.34 47.59±4.10 49.35±5.37 46.93±5.32 50.27±3.73術后第1天46.55±4.05 19.86±1.50 22.48±2.19 20.30±1.61 36.12±2.32***&&&術后第3天48.78±3.80 17.67±1.13 21.99±1.78 19.92±1.31 33.00±2.23***&&&術后第5天44.46±2.83 16.78±1.91 22.85±2.31 19.22±2.45 33.07±2.06***&&&術后第7天47.22±4.20 15.84±1.85 23.04±2.27 19.13±2.13 34.55±2.29***&&&術后第10天46.51±3.11 17.26±1.92 22.75±2.08 18.05±1.87 36.59±4.63***&&&術后第14天48.06±4.00 17.38±1.89 24.94±2.88 18.68±3.23 38.65±2.32***&&&

2.4 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β表達情況比較

與對照組比較，CCI 組和CS/GP 組大鼠血清中TNF-α 和IL-1β 的表達明顯增加（P＜0.001）。與CCI 組和CS/GP 組比較，Catgut 組TNF-α 和IL-1β的表達水平下降（P＜0.001，P＜0.01）。與CCI 組比較，CS/GP/DXM 組大鼠血清中TNF-α 與IL-1β的表達明顯降低（P＜0.001），且低于Catgut 組（分別為P= 0.049，P= 0.013）。結果表明，CS/GP/DXM水凝膠在持續(xù)的藥物釋放下，可通過降低血清中TNF-α、IL-1β 的表達水平來抑制神經性疼痛的全身免疫反應，其效果優(yōu)于沒有載藥的Catgut 組。見表2。

表2 各組大鼠治療后血清中TNF-α、IL-1β比較（±s，ng/L）

表2 各組大鼠治療后血清中TNF-α、IL-1β比較（±s，ng/L）

注：與Control 組比較，***P ＜0.001；與CCI 組比較，##P ＜0.01，###P ＜0.001；與CS/GP 組比較，&&P ＜0.01，&&&P ＜0.001；與Catgut 組比較，△P ＜0.05。

組別Control組CCI組CS/GP組Catgut組CS/GP/DXM組n4 4 4 4 4 TNF-α 81.28±14.84 154.69±8.19***141.11±11.87***99.50±11.56&&&###81.39±9.72&&&###△IL-1β 9.40±1.55 20.02±2.15***19.65±2.65***14.31±1.54&&##10.56±0.82&&&###△

2.5 各組大鼠脊髓L4～L6背角Iba1 及P2X4R 表達量比較

與對照組比較，CCI 模型后SD 大鼠脊髓背角上P2X4R+以及Iba1+細胞數明顯增加。經CS/GP/DXM水凝膠注射治療2 周后，大鼠脊髓背角P2X4R 表達減少；與Catgut 組比較，Iba1+小膠質細胞數量被明顯抑制。見圖4。

3 討論

本次研究中制作的兩種可注射的CS/GP 水凝膠和CS/GP/DXM 水凝膠均具有良好的生物相容性、可注射性、溫敏性以及可載藥性，優(yōu)于功能單一的羊腸線。結果顯示，CS/GP/DXM水凝膠可通過降低血清中TNF-α、IL-1β 的表達水平、抑制脊髓背角上小膠質細胞的活化以及P2X4R 的表達而發(fā)揮其鎮(zhèn)痛作用，且治療效果優(yōu)于羊腸線。

溫敏性水凝膠的優(yōu)點是制備方法簡單，且不需要進行手術，常溫下（25 ℃）水凝膠呈溶液狀態(tài)，具有可注射性，在接近人體生理溫度下（37 ℃）即可成膠，降解時間較長，可在一定程度上改善傳統(tǒng)羊腸線埋線治療方式，減少埋植次數，降低成本。此外，可注射水凝膠的劑量便于控制，療效肯定，在穴位埋線療法的材料選擇中具有很大的應用前景。殼聚糖是一種被廣泛研究的多糖，甘油磷酸酯（GP）的加入能使其成為熱敏性水凝膠，實現溶膠-凝膠的轉變［5］。這種水凝膠可以通過簡單的混合得到，而且與周圍的組織能很好地相容，對臨床治療有一定的參考價值。穴位埋線療法在臨床治療中的應用廣泛，如治療各種急慢性及難治性疾病，這種療法與普通針灸比較，具有刺激持久、治療次數少、依從性好等優(yōu)點［2］。羊腸線是臨床上最常用的埋植材料，目前仍有部分患者對羊腸線過敏，因此其他高分子材料的開發(fā)和應用具有很大潛力［6-7］。研究表明，穴位注射殼聚糖線被人體吸收后，能夠對穴位及周圍組織產生較長時間的生理、生化反應，可達20日或以上［8］。因其可降解性緩慢，注射水凝膠治療能減少穴位埋植次數，簡化操作，同時，其載藥性還能增強治療作用，采用這種可注射水凝膠進行治療不僅能改進埋線工具、減少患者的痛苦，還可以降低治療成本。

CCI 模型是常見的神經病理性疼痛動物模型，神經結扎2 周后，CCI 大鼠表現出自發(fā)性疼痛、熱敏痛和機械熱敏痛，疼痛高峰約在第14 天，因此CCI 模型是模擬慢性神經病理痛癥狀的最佳模型［9］，而足三里穴（ST36）是治療坐骨神經痛的重要穴位［10-12］，故在本研究中被采用。研究結果表明，裝載DXM 的CS/GP 水凝膠在ST36 處注射后可顯著提高CCI 大鼠的PMWT，減少痛敏現象。

IL-1β 和TNF-α 是核轉錄因子-κB（NF-κB）信號通路中的重要因子，在炎癥反應中首先表達，并在促進炎癥發(fā)展中發(fā)揮重要作用［13］。本研究觀察到CCI組大鼠血清中TNF-α、IL-1β 顯著增加，而與CCI 組比較，CS/GP/DXM 組大鼠血清中TNF-α 與IL-1β 的表達明顯降低，表明載有控釋藥物的CS/GP/DXM 水凝膠可以通過長時間刺激穴位起到抗炎鎮(zhèn)痛的作用。此外，本研究通過觀察脊髓背角上小膠質細胞及P2X4R 的表達量，進一步探索可注射CS/GP/DXM 水凝膠可能的鎮(zhèn)痛機制。周圍神經損傷后，脊髓背角小膠質細胞的激活及其表面P2X4R 的表達對痛覺的維持有重要作用［14-15］，阻斷小膠質細胞中P2X4R 的表達可能是治療神經病理性疼痛的新策略［16］。對于神經病理性疼痛的分子機制研究也發(fā)現，神經損傷后P2X4R會迅速在脊髓中大量表達［17］。本次研究結果表明，裝載DXM 的CS/GP 水凝膠能夠抑制CCI 大鼠脊髓背角上小膠質細胞的活化以及P2X4R 的表達，具有良好的鎮(zhèn)痛效果。

總之，裝載DXM 的CS/GP 水凝膠因其良好的生物相容性、可注射性、溫敏性以及對藥物的緩釋作用，在對CCI 大鼠的穴位埋植治療中具有一定的優(yōu)勢，可用作一種新型穴位埋植材料，在治療神經性疼痛中具有很大前景。今后本團隊還需對其在體內治療的作用做進一步考察，以明確本療法的臨床應用前景。