半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑的指紋圖譜建立與抗氧化活性成分的化學(xué)模式識(shí)別

杜義龍 李賽 李艷榮 潘海峰

中圖分類號(hào) R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2022）04-0425-08

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.04.08

摘 要 目的 測(cè)定半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑中總黃酮的含量，評(píng)價(jià)其體外抗氧化活性，建立其指紋圖譜，并進(jìn)行化學(xué)模式識(shí)別分析。方法 采用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑中總黃酮含量（以野黃芩素計(jì)）;采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基、2，2′-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）自由基清除實(shí)驗(yàn)考察半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑的體外抗氧化活性;采用高效液相色譜（HPLC）法，以野黃芩苷峰為參照峰，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A版）》繪制16批半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑的指紋圖譜并進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，確定共有峰;采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，篩選具有體外抗氧化活性的潛在物質(zhì)，并以其為變量，采用SPSS 24.0、SIMCA 14.1軟件進(jìn)行聚類分析和主成分分析。結(jié)果 總黃酮檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍為2.106～21.06 μg/mL（R 2=0.999 3）;精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性（120 min）試驗(yàn)的RSD均小于2%;加樣回收率為100.62%（RSD=0.55%，n=6）;總黃酮含量為0.634～1.053 mg/mL。DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)的半數(shù)抑制濃度（IC50）為1.120～3.602 mg/mL，ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)的IC50為0.684～1.327 mg/mL;相關(guān)性分析結(jié)果顯示，半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑中總黃酮含量與DPPH自由基、ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)的IC50均呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.976、-0.940（P<0.01）。16批半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑共有18個(gè)共有峰，相似度為0.964～0.997;共指認(rèn)出其中4個(gè)共有峰，分別為野黃芩苷（8號(hào)峰）、野黃芩素（14號(hào)峰）、木犀草素（15號(hào)峰）、芹菜素（17號(hào)峰）。半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑HPLC指紋圖譜中3～4、8～9、12～15、17號(hào)峰峰面積與DPPH自由基、ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)的IC50均呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05或P<0.01）。聚類分析結(jié)果顯示，16批半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑可聚為兩類，其中S2、S7～S8、S14～S16為一類，S1、S3～S6、S9～S13為一類;主成分分析將16批半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑分為兩類，其中S2、S4、S7、S14～S16為一類，S1、S3、S5～S6、S8～S13為一類，S4、S13、S15樣品的綜合評(píng)分較高。結(jié)論 所建HPLC指紋圖譜及化學(xué)模式識(shí)別分析方法可用于評(píng)價(jià)半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量;3～4、8～9、12～15、17號(hào)峰及總黃酮是半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑清除DPPH自由基和ABTS自由基的潛在物質(zhì)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 半枝蓮;標(biāo)準(zhǔn)湯劑;總黃酮;體外抗氧化作用;指紋圖譜;主成分分析;聚類分析

Fingerprint establishment of Scutellaria barbata standard decoction and chemical pattern recognition of antioxidant components

DU Yilong，LI Sai，LI Yanrong，PAN Haifeng（Hebei Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Research and Development， Chengde Medical University， Hebei Chengde 067000， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE To determine the contents of total flavonoids in Scutellaria barbata standard decoction， evaluate in vitro antioxidant activity， establish the fingerprint and conduct chemical pattern recognition analysis. METHODS The contents of total flavonoids in S. barbata standard decoction （calculated by scutellarein） were determined by ultraviet-visible spectrophotometry. In vitro antioxidant activity of S. barbata standard decoction was investigated by free radical scavenging tests of 1，1-diphenyl- 2-trinitrophenylhydrazine （DPPH） and 2，2′-azino-bis （3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid） ammonium salt（ABTS）; HPLC method was adopted. Using scutellarin as reference， the fingerprints of 16 batches of S. barbata standard decoction were drawn and evaluated by Similarity Evaluation System of TCM Chromatogram Fingerprint （2004 A edition）， and the common peaks were determined; Pearson correlation analysis was carried out by using SPSS 24.0 software to screen substances with in vitro antioxidant activity. Taking them as variables， cluster analysis and principal component analysis were carried out by using SPSS 24.0 and SIMCA 14.1 software. RESULTS The linear range of total flavonoids were 2.106-21.06 μg/mL（R 2=0.999 3）; RSDs of precision， reproducibility and stability tests （120 min） were all lower than 2%; the recovery was 100.62% （RSD=0.55%，n=6）; the contents of total flavonoids were 0.634-1.053 mg/mL. Median inhibitory concentration （IC50） of DPPH radical scavenging experiment ranged 1.120-3.602 mg/mL， and IC50 of ABTS radical scavenging experiment ranged 0.684-1.327 mg/mL. The results of correlation analysis showed that the content of total flavonoids in S. barbata standard decoction was negatively correlated with the IC50 of DPPH free radical and ABTS free radical scavenging experiment， and the correlation coefficients were? -0.976 and -0.940 respectively （P<0.01）. There were 18 common peaks in the fingerprints of 16 batches of S. barbata standard decoction; the similarities were 0.964-0.997. A total of 4 common peaks were identified， such as scutellarin （peak 8），scutellarein （peak 14）， luteolin （peak 15）， apigenin （peak 17）.In the HPLC fingerprints of S. barbata standard decoction， the peak areas of peak 3-4， 8-9， 12-15 and 17 were significantly negatively correlated with the IC50 of DPPH free radical and ABTS free radical scavenging experiment （P<0.05）. The results of cluster analysis showed that 16 batches of S. barbata standard decoction could be clustered into two categories， of which S2， S7-S8 and S14-S16 were clustered into one category， S1， S3-S6 and S9-S13 were clustered into one category. By principal component analysis， 16 batches of S. barbata standard decoction were divided into two categories， of which S2， S4， S7 and S14-S16 were clustered into one category， and S1， S3， S5-S6 and S8-S13 were clustered into one. The comprehensive scores were high in the samples of S4， S13， S15. CONCLUSIONS Established HPLC fingerprint and chemical pattern recognition analysis method can be used to evaluate the quality of S. barbata standard decoction; peak 3-4， 8-9， 12-15 and 17 and total flavonoids are the potential material basis for S. barbata standard decoction to scavenge DPPH free radical and ABTS free radical.

KEYWORDS? ?Scutellaria barbata; standard decoction; total flavonoids; in vitro antioxidant effect; fingerprint; principal component analysis; cluster analysis

半枝蓮Scutellaria barbata D. Don為唇形科黃芩屬多年生草本植物，以干燥全草入藥，始載于《外科正宗》[1]。半枝蓮在明代被稱為“解蛇傷之仙草”，主產(chǎn)于我國(guó)河南、河北、安徽、四川、浙江等省，主要含有黃酮類、二萜類、多糖類等化學(xué)成分，具有清熱解毒、化瘀利尿之功效[1-2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，半枝蓮所含有的黃酮類成分具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗炎、抗病毒等多種藥理活性[3-5]，是潛在的天然抗氧化劑，臨床應(yīng)用前景廣泛[1]。

2016年國(guó)家藥典委員會(huì)提出了“標(biāo)準(zhǔn)湯劑”的概念，是指在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，通過(guò)規(guī)范化煎煮、固液分離和適當(dāng)濃縮或適宜方法干燥制得的中藥湯劑[6]。中藥標(biāo)準(zhǔn)湯劑是衡量單味中藥配方顆粒臨床湯劑與對(duì)應(yīng)中藥飲片臨床湯劑是否一致的物質(zhì)基準(zhǔn)[7]。指紋圖譜能夠通過(guò)共有峰標(biāo)定、相似度評(píng)價(jià)等手段較全面地反映中藥的整體性[8]，故《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》將指紋圖譜作為評(píng)價(jià)單味中藥標(biāo)準(zhǔn)湯劑與對(duì)應(yīng)中藥飲片臨床湯劑一致性的重要手段[9]。中藥譜效學(xué)是著重解決中藥活性成分復(fù)雜、藥理作用機(jī)制不明的一門學(xué)科，可利用多種數(shù)據(jù)分析中藥藥理活性的物質(zhì)基礎(chǔ)[10]。化學(xué)模式識(shí)別分析包括聚類分析和主成分分析等，是用于揭示隱含于化學(xué)量測(cè)數(shù)據(jù)內(nèi)部規(guī)律的一種多元分析技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于中藥材及中藥制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)[11]。

目前，有關(guān)半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑的研究較少，大多為半枝蓮飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑中野黃芩苷、野黃芩素的含量測(cè)定[12]。半枝蓮中的黃酮類成分為其主要活性成分，具有顯著的抗氧化活性[13]，但尚未有半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑中各成分與其抗氧化活性的相關(guān)性研究;加之半枝蓮在臨床主要以水煎服，而中藥水煎劑大多具有作用機(jī)制復(fù)雜、作用靶點(diǎn)多樣、成分不確定等特點(diǎn)[8]，且煎煮過(guò)程中的不穩(wěn)定因素較多[7，14]，故為保證臨床用藥的一致性，對(duì)半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行全面的質(zhì)量控制就顯得尤為重要?；诖?，本研究采用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定了半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑中總黃酮的含量（以野黃芩苷計(jì)），同時(shí)以體外抗氧化作用為主要藥效基礎(chǔ)，篩選半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑中與抗氧化活性潛在相關(guān)的主要化學(xué)成分，采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法建立其指紋圖譜，并以篩選出的化學(xué)成分為變量進(jìn)行聚類分析和主成分分析，旨在為半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有1220 infinity Ⅱ型液相色譜儀及配備的雙柱塞串聯(lián)泵、真空在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器、標(biāo)準(zhǔn)流通池（美國(guó)Agilent公司），UV-2600 Probe型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本Shimadzu公司），AG-245型十萬(wàn)分之一分析天平（瑞士Mettler Toledo公司），KQ-700型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），HC-2062型高速離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司），Multiskan FC型酶標(biāo)儀（美國(guó)Thexmo Fisher Scientific公司），JA2003型電子分析天平（蘇州德匯科學(xué)儀器有限公司），ZDHW型調(diào)溫電熱套（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

維生素C對(duì)照品（批號(hào)J1024A，純度>99.0%）、2，2′-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽[2，2′-azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）ammonium salt，ABTS，批號(hào)M0403A]均購(gòu)自昆明澤浩科技有限公司;野黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)18032206，純度≥98%）購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司;野黃芩素對(duì)照品（批號(hào)140107，純度≥98%）、芹菜素對(duì)照品（批號(hào)140224，純度≥98%）均購(gòu)自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司;木犀草素對(duì)照品（純度≥98%，HPLC法）由承德醫(yī)學(xué)院崔鳳俠教授于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部制得;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH）自由基（批號(hào)464RB-GE）購(gòu)自梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司;過(guò)硫酸鉀（K2S2O8，批號(hào)181027）購(gòu)自天津市歐博凱化工有限公司;甲醇、乙腈均為色譜純，冰醋酸、甲醇均為分析純，水為純凈水。

16批半枝蓮藥材（編號(hào)Y1～Y16）于2019年購(gòu)自河北安國(guó)中藥材市場(chǎng)，經(jīng)承德民族師范學(xué)院生物系董建新教授鑒定為唇形科植物半枝蓮S. barbata D. Don的干燥全草。16批半枝蓮藥材樣品來(lái)源信息見(jiàn)表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備

取洗凈、充分干燥后的半枝蓮藥材 100 g，精密稱定，置于煎藥鍋中，加水1 200 mL，浸泡30 min，武火煮沸后，文火保持微沸30 min，趁熱用3層紗布濾過(guò);殘?jiān)铀? 000 mL，武火煮沸后，文火保持微沸20 min，趁熱用3層紗布濾過(guò);合并2次濾液，于60 ℃減壓濃縮至500 mL，即得[14]，共制備16批（編號(hào)S1～S16）。

2.2 半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑中總黃酮含量的測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取野黃芩苷對(duì)照品適量，精密稱定，加60%甲醇溶解并稀釋，制成質(zhì)量濃度為1.053 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取“2.1”項(xiàng)下半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑，濾過(guò)，精密移取濾液1 mL，置于100 mL量瓶中，加60%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 按2020年版《中國(guó)藥典》（一部）“半枝蓮”項(xiàng)下總黃酮含量測(cè)定方法操作[2]：取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液（編號(hào)S1），以60%甲醇為空白對(duì)照，使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)于200～600 nm波長(zhǎng)內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果顯示，在335 nm波長(zhǎng)處，對(duì)照品溶液、供試品溶液均有最大吸收，且空白對(duì)照無(wú)干擾（圖1），故選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為335 nm。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.5、1.0 mL，分別置于50 mL量瓶中，加60%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得系列線性工作溶液。以60%甲醇為空白對(duì)照，使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)于335 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以對(duì)照品的質(zhì)量濃度（c）為橫坐標(biāo)、吸光度（A）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果顯示，野黃芩苷的回歸方程為A=27.604c-151.63（R 2=0.999 3），表明野黃芩苷檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍為2.106～21.06 μg/mL。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.3 mL，置于50 mL量瓶中，加60%甲醇稀釋至刻度，搖勻。以60%甲醇為空白對(duì)照，使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)于335 nm波長(zhǎng)處連續(xù)測(cè)定吸光度6次。結(jié)果顯示，對(duì)照品溶液吸光度的RSD為0.06%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)S1），分別在室溫下放置0、20、40、60、80、100、120 min時(shí)，以60%甲醇為空白對(duì)照，使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)于335 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。結(jié)果顯示，待測(cè)樣品吸光度的RSD為1.80%（n=7），表明供試品溶液于室溫下放置120 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取“2.1”項(xiàng)下半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑（編號(hào)S1），共6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，以60%甲醇為空白對(duì)照，使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)于335 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品含量。結(jié)果顯示，總黃酮含量的RSD為1.85%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知含量的半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑（編號(hào)S1），每份0.5 mL，共6份，精密稱定，分別精密加入一定量的“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，以60%甲醇為空白對(duì)照，使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)于335 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.9 樣品含量測(cè)定 取16批“2.1”項(xiàng)下半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，以60%甲醇為空白對(duì)照，使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)于335 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品含量，每樣品平行測(cè)定3次。結(jié)果見(jiàn)表3。

2.3 體外抗氧化活性的測(cè)定

2.3.1 陽(yáng)性對(duì)照溶液的制備 精密稱取維生素C對(duì)照品48.4 mg，置于10 mL量瓶中，加水溶解并定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度為4.84 mg/mL的陽(yáng)性對(duì)照溶液。

2.3.2 DPPH自由基溶液的制備 精密稱定DPPH12.0 mg，置于100 mL量瓶中，加70%乙醇溶解并定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.12 mg/mL的DPPH自由基溶液。

2.3.3 ABTS自由基溶液的制備 精密稱定ABTS 41.0 mg、K2S2O8 18.0 mg，分別置于10 mL量瓶中，加水溶解并定容，得ABTS貯備液和K2S2O8貯備液;分別精密吸取上述單一貯備液各2.5 mL，置于100 mL量瓶中，加水定容，搖勻，即得ABTS自由基溶液，避光儲(chǔ)存12～16 h，備用。

2.3.4 樣品溶液的制備 取16批“2.1”項(xiàng)下半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得樣品溶液。取上述樣品溶液，加水稀釋，制得質(zhì)量濃度（以生藥量計(jì)）分別為0.50、0.75、1.00、1.50、2.50、3.75、5.00 mg/mL的系列樣品溶液A，用于DPPH自由基清除率的測(cè)定;同法制得質(zhì)量濃度（以生藥量計(jì)）分別為0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、2.00、2.50 mg/mL的系列樣品溶液B，用于ABTS自由基清除率的測(cè)定。

2.3.5 DPPH自由基清除率的測(cè)定 取“2.3.1”項(xiàng)下陽(yáng)性對(duì)照溶液、“2.3.4”項(xiàng)下系列樣品溶液A各50 μL，加至96微孔板中，再加入“2.3.2”項(xiàng)下DPPH自由基溶液100 μL，避光反應(yīng)30 min后，使用酶標(biāo)儀于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)得吸光度（A）;用水代替樣品溶液，同法測(cè)得吸光度（B）。按公式計(jì)算DPPH自由基清除率：DPPH自由基清除率=

[（B-A）/B]×100%[15]。每樣品平行操作3次，取平均值。由于各批半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑對(duì)DPPH自由基的清除率與其質(zhì)量濃度不成線性關(guān)系，因此采用SPSS 24.0軟件中的Probit方法對(duì)DPPH自由基清除率進(jìn)行回歸分析。結(jié)果顯示，擬合后的方程為Probit（P）=Intercept+Bx（式中，Intercept表示截距，B表示斜率，P為DPPH自由基清除率，x為半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑稀釋后的質(zhì)量濃度;Probit=0.50時(shí)，半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑的相應(yīng)濃度以生藥量計(jì)）。經(jīng)χ 2檢驗(yàn)后，得到半數(shù)抑制濃度（median inhibitory concentration，IC50），其值越小表示半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑的體外抗氧化活性越強(qiáng)[10]。結(jié)果見(jiàn)表4、圖2A。

2.3.6 ABTS自由基清除率的測(cè)定 取“2.3.1”項(xiàng)下陽(yáng)性對(duì)照溶液、“2.3.4”項(xiàng)下系列樣品溶液B各50 μL，加至96微孔板中，再加入“2.3.3”項(xiàng)下ABTS自由基溶液100 μL，避光反應(yīng)6 min后，使用酶標(biāo)儀于734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A）;用水代替樣品溶液，同法測(cè)定吸光度（B）。按“2.3.5”項(xiàng)下公式及方法計(jì)算ABTS自由基清除率的IC50[15]。每樣品平行操作3次，取平均值。結(jié)果見(jiàn)表4、圖2B。

2.3.7 相關(guān)性分析 采用SPSS 24.0軟件以Pearson相關(guān)性分析評(píng)價(jià)半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑中總黃酮含量與IC50的相關(guān)性，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑中總黃酮的含量與DPPH、ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)的IC50均呈負(fù)相關(guān)（P<0.01），相關(guān)系數(shù)分別為-0.976、-0.940，表明半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑中總黃酮含量越高，其體外抗氧化活性越強(qiáng)。

2.4 半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑HPLC指紋圖譜的建立

2.4.1 色譜條件 以ZORBAX Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以0.1%冰醋酸溶液為流動(dòng)相（A）、甲醇-乙腈混合溶液（8 ∶ 2，V/V）為流動(dòng)相（B）進(jìn)行梯度洗脫（0～20 min，10%B→28%B;20～30 min，28%B→35%B;30～40 min，35%B→40%B;40～50 min，40%B→50%B;50～60 min，50%B→70%B）;檢測(cè)波長(zhǎng)為335 nm;流速為1 mL/min;柱溫為30 ℃;進(jìn)樣量為10 μL。

2.4.2 供試品溶液的制備 取“2.1”項(xiàng)下半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑，濾過(guò)，精密移取濾液10 mL，置于25 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，精密移取5 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，混勻，以12 000 r/min離心10 min，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4.3 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取野黃芩苷、芹菜素、野黃芩素、木犀草素對(duì)照品適量，置于100 mL量瓶中，加60%甲醇溶解并定容，混勻，制成上述成分質(zhì)量濃度分別為77.5、7.5、8.6、30.0 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.4.4 精密度試驗(yàn) 取“2.4.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)S1），按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄色譜圖。以野黃芩苷峰為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，18個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于2.50%（n=6），表明方法精密度良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.4.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)S1），分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以野黃芩苷峰為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，18個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3.00%（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取半枝蓮藥材（編號(hào)S1），共6份，按“2.1”項(xiàng)下方法制備半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑，按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以野黃芩苷峰為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，18個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3.00%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.4.7 指紋圖譜的建立 取16批半枝蓮藥材，按“2.1”項(xiàng)下方法制備半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑，按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，將16批半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑的色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A版）》進(jìn)行分析，以各色譜峰保留時(shí)間及峰面積適中的S1樣品為參照，設(shè)定時(shí)間窗寬度為0.20，以中位數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜，采用多點(diǎn)校正法生成疊加指紋圖譜。結(jié)果顯示，16批半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑共有18個(gè)共有峰，其HPLC疊加指紋圖譜見(jiàn)圖3，對(duì)照指紋圖譜見(jiàn)圖4。

2.4.7 共有峰指認(rèn) 取“2.4.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，得混合對(duì)照品溶液的HPLC圖（圖5）。將對(duì)照指紋圖譜（圖4）與該圖進(jìn)行比對(duì)，共指認(rèn)4個(gè)共有峰，分別為野黃芩苷（8號(hào)峰）、野黃芩素（14號(hào)峰）、木犀草素（15號(hào)峰）、芹菜素（17號(hào)峰）。

2.4.8 相似度評(píng)價(jià)與共有峰峰面積差異分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A版）》進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，16批半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度分別為0.994、0.996、0.992、0.996、0.989、0.993、0.964、0.994、0.997、0.982、0.996、0.982、0.993、0.993、0.990、0.965，均大于0.96，表明不同批次半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑所含主要成分的種類基本一致。16批半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑共有峰峰面積的RSD為20.52%～68.66%，表明不同批次半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑所含主要成分的含量存在一定差異。結(jié)果見(jiàn)表5。

2.5 體外抗氧化活性相關(guān)化學(xué)成分的篩選

以16批半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑的DPPH、ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)的IC50為因變量，共有峰峰面積為自變量，采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑的HPLC指紋圖譜中3～4、8～9、12～15、17號(hào)峰峰面積與DPPH、ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)的IC50均呈負(fù)相關(guān)（P<0.05或P<0.01），相關(guān)系數(shù)為-0.811～-0.555;同時(shí)，結(jié)合“2.3.7”項(xiàng)下結(jié)果可知，半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑中總黃酮含量與DPPH、ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)的IC50均呈負(fù)相關(guān)，表明半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑中的3～4、8～9、12～15、17號(hào)峰以及總黃酮是半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑清除DPPH自由基和ABTS自由基的潛在物質(zhì)基礎(chǔ)。結(jié)果見(jiàn)表6。

2.6 聚類分析

以16批半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜中3～4、8～9、12～15、17號(hào)峰峰面積及總黃酮含量為變量，采用組間連接聚類法，以Pearson相關(guān)性為度量標(biāo)準(zhǔn)，使用SPSS 24.0軟件進(jìn)行聚類分析。結(jié)果顯示，16批半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑可聚為兩類，其中S2、S7～S8、S14～S16為一類，S1、S3～S6、S9～S13為一類。結(jié)果見(jiàn)圖6。

2.7 主成分分析

以16批半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑HPLC指紋圖譜中3～4、8～9、12～15、17號(hào)峰峰面積及總黃酮含量為變量，采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行主成分分析。結(jié)果顯示，KMO檢驗(yàn)和Bartlett檢驗(yàn)的KMO度量值為0.576（P<0.001），提示各變量間存在顯著相關(guān)性，可進(jìn)行主成分分析。前3個(gè)主成分的特征值均大于1，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為88.406%，表明前3個(gè)主成分可以代表半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑中上述10個(gè)變量的大部分信息。結(jié)果見(jiàn)表7。

采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行因子載荷矩陣分析。結(jié)果顯示，主成分1與3～4、9、17號(hào)峰峰面積及總黃酮含量呈正相關(guān);主成分2與3、8、12～14號(hào)峰峰面積及總黃酮含量呈正相關(guān);主成分3與14～15、17號(hào)峰峰面積及總黃酮含量呈正相關(guān)。結(jié)果見(jiàn)表8。根據(jù)下式計(jì)算各主成分得分值：F=ZX×A（式中，F(xiàn)表示主成分得分，ZX表示原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后得到的標(biāo)準(zhǔn)化矩陣，A表示標(biāo)準(zhǔn)化的正交特征向量矩陣）;同時(shí)，結(jié)合各主成分貢獻(xiàn)率建立綜合評(píng)分（F綜）模型：F綜=0.539 46×F1+0.238 73×F2+0.105 88×F3。綜合評(píng)分可反映半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑的整體質(zhì)量，評(píng)分越高，則質(zhì)量越好，體外抗氧化活性越強(qiáng)[11]。結(jié)果顯示，S4、S13、S15樣品綜合評(píng)分較高，表明這3批半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑總體質(zhì)量較好，體外抗氧化活性較強(qiáng)。結(jié)果見(jiàn)表9。

以16批半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑HPLC指紋圖譜中3～4、8～9、12～15、17號(hào)峰峰面積及總黃酮含量為變量，采用SIMCA 14.1軟件繪制主成分分析得分圖和載荷圖。結(jié)果顯示，第1、2、3主成分所反映的信息與上述主成分分析結(jié)果一致;16批半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑被分為兩類，其中S2、S4、S7、S14～S16為Ⅰ類，S1、S3、S5～S6、S8～S13為Ⅱ類;結(jié)合載荷圖可知，Ⅰ類樣品中3～4、9、15、17號(hào)峰對(duì)應(yīng)成分及總黃酮的含量較高，Ⅱ類樣品中8、12～14號(hào)峰對(duì)應(yīng)成分的含量較高。結(jié)果見(jiàn)圖7。

3 討論

本研究對(duì)16批半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑中的總黃酮含量進(jìn)行了測(cè)定，參考2020年版《中國(guó)藥典》（一部），以野黃芩苷為對(duì)照品，通過(guò)紫外吸收光譜掃描發(fā)現(xiàn)，野黃芩苷對(duì)照品和半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品于335 nm波長(zhǎng)處均有最大吸收，且空白對(duì)照無(wú)干擾，故選擇335 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。16批半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑中總黃酮的含量為0.634～1.053 mg/mL，表明不同產(chǎn)地半枝蓮中總黃酮含量差異較大，質(zhì)量參差不齊，可能與藥材的產(chǎn)地、采收、加工方式等因素不同有關(guān)[16]。

本研究通過(guò)DPPH、ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)，考察了16批半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑的體外抗氧化活性。結(jié)果顯示，不同批次樣品DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)的IC50為1.120～3.602 mg/mL，ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)的IC50為0.684～1.327 mg/mL，后者更小，表明半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑對(duì)ABTS自由基的清除能力相對(duì)較強(qiáng)。不同批次半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)的IC50值、ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)的IC50值的RSD分別為32.96%、17.52%，表明不同批次半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑的體外抗氧化活性差異較大，可能與不同批次半枝蓮藥材的內(nèi)在質(zhì)量不一致有關(guān)。

本研究建立了16批半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑的指紋圖譜，相似度均大于0.96，共有峰峰面積的RSD為20.52%～68.66%，表明不同批次半枝蓮藥材所含化學(xué)成分種類基本一致，但含量差異較大，可能與產(chǎn)地、貯藏等因素的不同導(dǎo)致各批藥材內(nèi)在質(zhì)量存在差異有關(guān)[17]。

本研究將16批半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑的體外抗氧化活性測(cè)定結(jié)果與其指紋圖譜中的18個(gè)共有峰峰面積及總黃酮含量進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，3～4、8～9、12～15、17號(hào)峰對(duì)應(yīng)成分及總黃酮是與DPPH自由基和ABTS自由基清除有關(guān)的潛在物質(zhì)，其中野黃芩苷（8號(hào)峰）、野黃芩素（14號(hào)峰）、木犀草素（15號(hào)峰）、芹菜素（17號(hào)峰）及總黃酮的抗氧化活性已有文獻(xiàn)報(bào)道[18-23]，可考慮在后續(xù)研究中進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，將野黃芩苷、野黃芩素、木犀草素、芹菜素及總黃酮含量作為評(píng)價(jià)半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量的指標(biāo)。本研究以3～4、8～9、12～15、17號(hào)峰峰面積及總黃酮含量為變量進(jìn)行聚類分析和主成分分析。聚類分析結(jié)果顯示，16批半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑可聚為兩類，其中S2、S7～S8、S14～S16為一類，S1、S3～S6、S9～S13為一類;主成分分析結(jié)果顯示，16批半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑分為兩類，其中S2、S4、S7、S14～S16為Ⅰ類，S1、S3、S5～S6、S8～S13為Ⅱ類，Ⅰ類樣品中3～4、9、15、17號(hào)峰對(duì)應(yīng)成分及總黃酮的含量較高，Ⅱ類樣品中8、12～14號(hào)峰對(duì)應(yīng)成分的含量較高。綜合評(píng)分排序結(jié)果顯示，16批半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑的綜合評(píng)分排序與其體外抗氧化活性趨勢(shì)基本一致，表明綜合評(píng)分模型可用于評(píng)價(jià)半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑的整體質(zhì)量。

綜上所述，所建HPLC指紋圖譜及化學(xué)模式識(shí)別分析方法可用于評(píng)價(jià)半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量;3～4、8～9、12～15、17號(hào)峰對(duì)應(yīng)成分及總黃酮是半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)湯劑清除DPPH自由基和ABTS自由基的潛在物質(zhì)基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2021-08-26 修回日期：2021-12-23）

（編輯：陳 宏）