產(chǎn)氣莢膜梭菌唾液酸酶研究進(jìn)展

王 娜,段世宇,程振濤,3,文 明,3,王開功,3,周碧君,3* （1.貴州大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院,貴州貴陽 550025；2.貴州省動物疫病研究室,貴州 貴陽 550025；3.貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州貴陽 550025）

產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens,Cp）又稱魏氏梭菌,為革蘭陽性桿狀菌,在自然界分布廣泛,是重要的條件致病菌,也是人獸共患病原菌[1]。該菌可產(chǎn)生高達(dá)20多種毒素,根據(jù)該菌產(chǎn)生的毒素種類,將其分為A、B、C、D、E及F、G型[2]。產(chǎn)氣莢膜梭菌常見于土壤、污水、垃圾、雞糞以及人類和動物腸道等多種環(huán)境中,可導(dǎo)致人類食源性疾病,但也對動物構(gòu)成重要威脅[3-4]。產(chǎn)氣莢膜梭菌可感染人和各種動物（主要是牛和綿羊）,導(dǎo)致人的食物中毒、壞死性腸炎、動物的腸毒素血癥以及人和動物的外傷性氣體壞疽以及其他疾病。這些疾病不僅嚴(yán)重威脅人類和動物的健康,而且造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[5-6]。

唾液酸酶是致病微生物的常見毒力因子,大量研究表明唾液酸酶在致病菌的發(fā)病機(jī)理中起重要作用,為細(xì)菌提供營養(yǎng)并促進(jìn)細(xì)菌定植、黏附、內(nèi)化、生物膜形成與增強(qiáng)毒素作用[7]。唾液酸酶可以在多種病原體中表達(dá),導(dǎo)致宿主發(fā)生感染和組織損傷[8]。JANESCH等[9]發(fā)現(xiàn),肺炎鏈球菌表達(dá)的3種唾液酸酶（Nan A,NanB和NanC）均增強(qiáng)了肺炎鏈球菌與人氣道上皮細(xì)胞的相互作用,促進(jìn)肺炎鏈球菌對上皮細(xì)胞的黏附和宿主的定植。YANG等[10]構(gòu)建了齒齦假單胞菌唾液酸酶基因突變株后發(fā)現(xiàn)其致病性低于野生型菌株,并且唾液酸酶會影響牙齦卟啉單胞菌表面大分子的合成和修飾,并與細(xì)菌和宿主細(xì)胞之間的相互作用有關(guān)。

1 唾液酸酶

唾液酸酶,也稱為神經(jīng)氨酸酶,其水解糖蛋白和糖脂中末端唾液酸的α-糖苷鍵來產(chǎn)生游離的唾液酸[11-12]。唾液酸酶存在于高等動物和各種微生物中（包括病毒、細(xì)菌和原生動物）[13-14]。許多腸道共生和致病細(xì)菌可以利用唾液酸酶使細(xì)菌能夠從宿主體內(nèi)獲得唾液酸以用作碳源。腸道細(xì)菌編碼的唾液酸酶底物特異性和酶促反應(yīng)各不相同[15-16]。唾液酸酶也可充當(dāng)細(xì)菌發(fā)病機(jī)理中的毒力因子,參與細(xì)胞代謝、促進(jìn)細(xì)菌定植、黏附、增殖,增加毒素結(jié)合作用[17-18]。細(xì)菌獲得唾液酸的方法有2種:內(nèi)源性合成和外源性分解,內(nèi)源性合成發(fā)生在含有唾液酸酶的細(xì)菌中。而有些細(xì)菌（例如牙齦卟啉單胞菌）本身不含唾液酸酶,不能合成唾液酸,取而代之的是通過唾液酸酶從環(huán)境中獲得唾液酸,該過程稱為外源性分解。唾液酸還可能調(diào)節(jié)其他基因的表達(dá)（例如菌毛基因）并修飾細(xì)菌表面的大分子。一方面,細(xì)菌表面的唾液酸增強(qiáng)了細(xì)菌的毒性；另一方面,導(dǎo)致宿主錯誤地將病原體識別為宿主細(xì)胞逃避了免疫反應(yīng)。這種機(jī)制有利于病原體逃避宿主防御的能力[19]。

2 產(chǎn)氣莢膜梭菌唾液酸酶分子結(jié)構(gòu)特征

產(chǎn)氣莢膜梭菌可產(chǎn)生3種唾液酸酶,包括1個內(nèi)分泌唾液酸酶Nan H（43 k Da）與2個外分泌唾液酸酶NanI（77 k Da）和NanJ（129 k Da）[20-21]。產(chǎn)氣莢膜梭菌可以編碼3個唾液酸酶,但并非所有菌株中都存在3個唾液酸酶基因。菌株ATCC 13124編碼3個唾液酸酶,分離株SM101編碼Nan H,但不編碼NanI或NanJ[22]。菌株13編碼NanI和NanJ,但不編碼Nan H[23]。產(chǎn)氣莢膜梭菌唾液酸酶在結(jié)構(gòu)上具有相似性和差異性。這3種唾液酸酶均顯示出氨基酸序列同一性,但它們具有不同的結(jié)構(gòu)域。Nan H僅包含催化結(jié)構(gòu)域,NanI結(jié)構(gòu)包含1個催化結(jié)構(gòu)域和碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域,NanJ結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜,包括1個中央催化結(jié)構(gòu)域、2個碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBM32和CBM40）以及3個其他輔助區(qū)域組成（圖1）。這些碳水化合物結(jié)合區(qū)增加了NanI和NanJ對它們多價(jià)底物的結(jié)合親和力[24]。

圖1 產(chǎn)氣莢膜梭菌唾液酸酶結(jié)構(gòu)域示意圖[24]

研究發(fā)現(xiàn),產(chǎn)氣莢膜梭菌唾液酸存在1個13 bp（5′-GAAAAATATTTTC-3′）的保守序列,這些保守的重復(fù)序列位于啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)區(qū)域,表明它們可以用作充當(dāng)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的識別序列來調(diào)節(jié)產(chǎn)氣莢膜梭菌唾液酸酶的產(chǎn)生[25]。產(chǎn)氣莢膜梭菌3種唾液酸酶均位于染色體的保守區(qū)域,由染色體不同區(qū)域的基因所編碼,對產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株中編碼唾液酸酶的ORF進(jìn)行測序。結(jié)果表明,來自不同產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株的NanJ、NanI和Nan H基因序列的相似性分別為96%～100%,98%～100%和93%～100%[18,26]。

3 產(chǎn)氣莢膜梭菌唾液酸酶特性

產(chǎn)氣莢膜梭菌唾液酸酶具有不同的酶學(xué)特性。研究發(fā)現(xiàn),NanJ或Nan H酶促活性的最佳溫度分別為37℃或43℃,而NanI最佳活性溫度為48℃；3種唾液酸酶在p H5.5時均顯示最佳活性,與NanJ和Nan H唾液酸酶相比,NanI唾液酸酶表現(xiàn)出更高的耐熱性。胰蛋白酶預(yù)處理可增強(qiáng)NanI活性,降低NanJ或Nan H的唾液酸酶活性。胰凝乳蛋白酶或小鼠腸液也可以激活NanI活性,表明腸道蛋白酶可能會增強(qiáng)NanI活性,從而進(jìn)一步增強(qiáng)疾病期間腸內(nèi)毒素活性[27]。NanJ和NanI均從Caco-2細(xì)胞釋放了大量唾液酸,而Nan H僅導(dǎo)致Caco-2細(xì)胞釋放少量唾液酸。Fe2＋、Mn2＋和Mg2＋增強(qiáng)NanI酶的活性,而Fe3＋、Zn2＋降低NanI酶的活性；除了Fe2＋和Mn2＋之外,Co2＋、Mg2＋、Ni2＋和Zn2＋也增加了NanJ活性,僅Fe3＋降低了NanJ活性；對于Nan H活性,發(fā)現(xiàn)除Mg2＋外,所有金屬離子均會降低其活性。3種唾液酸酶的活性受幾種金屬離子的影響不同[28]。3種產(chǎn)氣莢膜梭菌唾液酸酶表現(xiàn)出不同的底物偏好,NanI以α-2,3＞α-2,6＞α-2,8鍵的順序顯示優(yōu)先活性,NanJ活性顯示出對α-2,6＞α-2,8＞α-2,3唾液酸鍵的偏好,Nan H顯示出α-2,8＞α-2,3＞α-2,6的偏好,表明這3種唾液酸酶組合可以水解并從復(fù)雜的底物中釋放出游離的唾液酸。綜上所述,3種唾液酸酶具有獨(dú)特的性質(zhì),這取決于環(huán)境條件可以使這些酶發(fā)揮不同的作用[29]。

4 產(chǎn)氣莢膜梭菌唾液酸酶表達(dá)調(diào)控

4.1VirS/Vir R2組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)產(chǎn)氣莢膜梭菌對唾液酸酶產(chǎn)生的調(diào)節(jié)機(jī)制極其復(fù)雜（圖2）。Vir R/VirS 2組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是產(chǎn)氣莢膜梭菌最主要的調(diào)控系統(tǒng)之一。VirS/Vir R 2組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)由響應(yīng)調(diào)節(jié)器Vir R和傳感器組氨酸激酶VirS組成,VirS有相對疏水的N末端并且有6個跨膜區(qū)域。對產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株13完整基因組序列分析表明,有5個基因在其啟動子區(qū)域具有Vir R結(jié)合位點(diǎn)。這5個基因分別是pfo A、vrr、vir T、virU和ccp,表達(dá)均受VirS/Vir R系統(tǒng)的調(diào)控[30]。Vir R直接調(diào)節(jié)pfo A和ccp的表達(dá)并間接調(diào)節(jié)plc、col A和其他與細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)[31]。Vir R/VirS 2組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)間接調(diào)節(jié)NanI和NanJ表達(dá),其中VirS首先上調(diào)vrr基因的表達(dá)（受Vir R編碼調(diào)節(jié)的RNA（VR-RNA））,然后該調(diào)節(jié)性RNA再對NanI和NanJ表達(dá)產(chǎn)生正調(diào)控作用[32-33]。

圖2 產(chǎn)氣莢膜梭菌唾液酸酶調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型[34]

4.2RevR調(diào)控系統(tǒng)Rev R是Vir R/VirS 2組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之外的一個調(diào)節(jié)蛋白,具有1個N端受體結(jié)構(gòu)域和1個C端結(jié)構(gòu)域,并具有1個DNA結(jié)合區(qū)。Rev R以一種獨(dú)立于VirS/Vir R 2組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的方式調(diào)節(jié)唾液酸酶的產(chǎn)生和毒性。Rev R與其他革蘭陽性細(xì)菌的調(diào)節(jié)劑PhoB和YycF具有相似性,保守結(jié)構(gòu)域顯示Rev R的C端區(qū)域內(nèi)存在DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域并與YycF和PhoB的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域一致,這表明Rev R通過與DNA靶向結(jié)合來調(diào)節(jié)基因表達(dá)。Rev R不影響分別編碼α-毒素和穿孔素溶酶O的Vir R/VirS 2組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)plc和pfo A的表達(dá)[33-34]。CHAKRAVORTY等[35]通過構(gòu)建Rev R缺失突變體對編碼潛在毒力因子的基因（即col A、Nag H、NanI、Nan J和ccp）表達(dá)進(jìn)行測定,在RevR突變體中,除col A以外的所有基因的表達(dá)水平均與野生型水平顯著不同,突變體中的ccp和Nan I表達(dá)顯著增加,而Nag H,Nag L和Nan J表達(dá)下降,表明RevR系統(tǒng)對nan J和nan I表達(dá)具有不同的調(diào)節(jié)作用,Rev R系統(tǒng)增加nan J表達(dá),但對nan I產(chǎn)生負(fù)調(diào)控。

4.3ReeS調(diào)控系統(tǒng)ReeS是細(xì)胞外酶傳感器調(diào)節(jié)劑,為一種組氨酸激酶。在氨基酸序列水平上,ReeS保留了保守的組氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。由于沒有與ReeS緊鄰的兩成分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)相關(guān)的基因,因此ReeS調(diào)控獨(dú)立于VirS/Vir R系統(tǒng),不影響由VirS/Vir R系統(tǒng)調(diào)節(jié)的pfo A、plc或col A的基因表達(dá)[34]。HISCOX等[34]通過同源重組和等位基因交換構(gòu)建了ReeS缺失突變體,并對0,4,8 h的培養(yǎng)上清液進(jìn)行唾液酸酶活性測定。與野生型相比,突變體的總唾液酸酶活性與編碼唾液酸酶的Nan I和Nan J基因的轉(zhuǎn)錄顯著降低,且ReeS突變的互補(bǔ)作用可以逆轉(zhuǎn)這種下降趨勢,表明ReeS積極調(diào)節(jié)產(chǎn)氣莢膜梭菌中唾液酸酶的產(chǎn)生,主要調(diào)節(jié)唾液酸酶Nan I的轉(zhuǎn)錄,但對Nan J也有調(diào)節(jié)作用,對Nan I和Nan J均顯示出正調(diào)控[32]。

4.4NanR調(diào)控系統(tǒng)Nan R是RpiR轉(zhuǎn)錄因子家族的成員。Nan R調(diào)節(jié)唾液酸的分泌、支持孢子形成和CPE的產(chǎn)生[36]。研究報(bào)道,在NanI啟動子區(qū)域中有6個Nan R結(jié)合位點(diǎn),產(chǎn)氣莢膜梭菌在沒有唾液酸的情況下生長時,由于在NanI附近有相似的Nan R結(jié)合位點(diǎn),Nan R會與NanI啟動子中的部分或全部結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。Nan R抑制NanI的產(chǎn)生和唾液酸代謝相關(guān)蛋白的表達(dá),在游離唾液酸存在下,唾液酸被產(chǎn)氣莢膜梭菌代謝產(chǎn)生Man NAc-6P,其與Nan R結(jié)合減輕了對NanI表達(dá)的抑制。在高濃度唾液酸下可能存在另一種未知阻遏物降低NanI的表達(dá)。此外,在高葡萄糖濃度下NanI的表達(dá)降低,這表明除了Nan R之外,還有其他阻遏物可以抑制NanI表達(dá)。該阻遏物是否與在高濃度唾液酸存在下阻抑NanI表達(dá)的阻遏物相同還有待探究[37]。由于Ccp A和Cod Y可以影響NanI的表達(dá),Ccp A和Cod Y調(diào)節(jié)蛋白可能是上述NanI阻遏物的候選蛋白,但這仍有待驗(yàn)證。因此,唾液酸酶由多個系統(tǒng)調(diào)節(jié),并且這些系統(tǒng)之間的關(guān)系有待進(jìn)一步闡明[38]。

4.5VR-RNA調(diào)控系統(tǒng)VR-RNA是報(bào)道的梭狀芽胞桿菌中第1個具有調(diào)節(jié)功能的RNA分子,VRRNA最初是在VirS/Vir R系統(tǒng)的調(diào)節(jié)級聯(lián)中作為二級調(diào)節(jié)劑而發(fā)現(xiàn),該RNA由VirS/Vir R系統(tǒng)調(diào)節(jié),因此它被命名為VR-RNA。包括毒力相關(guān)基因在內(nèi)的147個基因受Vir R/VirS-VR-RNA級聯(lián)調(diào)控。整個VR-RNA的預(yù)測結(jié)構(gòu)具有緊密連接的二級結(jié)構(gòu),并且預(yù)測其5′和3′末端配對并具有很強(qiáng)的對稱軸。從對VR-RNA的缺失分析來看,負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)活性的區(qū)域位于VR-RNA的3′端區(qū)域,3′區(qū)域序列在VR-RNA調(diào)節(jié)功能中發(fā)揮重要作用[39-40]。VRRNA調(diào)控的毒力相關(guān)基因包括plc、cola、唾液酸酶基因（Nan I和Nan J）和透明質(zhì)酸酶基因Nag L。除了與毒力相關(guān)的基因外,與宿主組織中細(xì)菌存活密切相關(guān)的基因都由VirS/Vir R-VR-RNA級聯(lián)調(diào)控。VirS/Vir R-VR-RNA系統(tǒng)調(diào)控多種基因功能從而促進(jìn)產(chǎn)氣莢膜梭菌的定植[41]。

5 唾液酸酶在產(chǎn)氣莢膜梭菌發(fā)病機(jī)理中的潛在作用

5.1增強(qiáng)產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素作用唾液酸酶與細(xì)菌毒力有關(guān)。已有研究報(bào)道它們通過與其他細(xì)菌因子的協(xié)同作用來促進(jìn)疾病的發(fā)病機(jī)理。例如,霍亂弧菌唾液酸酶增強(qiáng)了霍亂毒素的活性[42]。銅綠假單胞菌唾液酸酶增加了銅綠假單胞菌與易感細(xì)胞的結(jié)合[43]。而肺炎鏈球菌的2種唾液酸酶都促進(jìn)了感染進(jìn)程的發(fā)展。

NanI和NanJ在小鼠體內(nèi)感染模型中對產(chǎn)氣莢膜梭菌13型的毒力沒有直接作用,但NanI和NanJ增強(qiáng)了細(xì)胞培養(yǎng)模型中α毒素的活性[44]。FLORES-DIAZ等[45]報(bào)道,NanI顯著提高了上皮腫瘤細(xì)胞和中國倉鼠肺成纖維細(xì)胞中α-毒素的細(xì)胞毒性作用。此外,含有NanI的培養(yǎng)上清液可增強(qiáng)ε毒素與MDCK細(xì)胞的結(jié)合,增強(qiáng)MDCK細(xì)胞中ε毒素介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用[18]。盡管NanI對CPB、CPE和ETX的促進(jìn)作用相對較?。?.5～2.0倍）,但這種作用在腸炎或腸毒素血癥期間仍然很重要。由于CPE、CPB和ETX不共享受體,因此NanI誘導(dǎo)的這3種毒素對細(xì)胞結(jié)合的增強(qiáng)本質(zhì)上是非特異性的。NanI對CPB、CPE和ETX結(jié)合非特異性增強(qiáng)的性質(zhì)需要進(jìn)一步研究,但可能涉及多種機(jī)制。唾液酸在哺乳動物細(xì)胞上提供了許多表面電荷,通過去除表面唾液酸殘基,NanI唾液酸酶可以減少靜電排斥并增加毒素結(jié)合?；蛘?NanI可以從毒素受體中去除掩蓋的唾液酸以增加毒素對其受體的獲取。再者,NanI可能會通過修飾與毒素受體相鄰的糖蛋白或糖脂來增加毒素結(jié)合,從而去除部分封閉毒素受體的唾液酸。唾液酸酶可以增加細(xì)胞旁通透性,因此NanI可能促進(jìn)毒素進(jìn)入宿主細(xì)胞基底外側(cè)表面上存在的受體,從而導(dǎo)致毒素結(jié)合增加。NanI增強(qiáng)CPB、CPE和ETX的細(xì)胞毒性的機(jī)制需要進(jìn)一步研究[46]。Net F毒素是A型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生的一種成孔毒素,唾液酸促進(jìn)Net F毒素與宿主細(xì)胞的結(jié)合并增強(qiáng)細(xì)胞毒活性[47]。NanI增加了MDCK細(xì)胞的ETX敏感性,表明NanI在宿主細(xì)胞表面上暴露了額外的ETX受體。另外,類似于霍亂弧菌唾液酸酶修飾糖脂以增加霍亂毒素的結(jié)合,NanI可以修飾宿主細(xì)胞表面受體,使其獲得ETX結(jié)合能力[48]。

5.2加強(qiáng)產(chǎn)氣莢膜梭菌黏附性唾液酸酶以多種方式促進(jìn)毒力,例如通過暴露位點(diǎn)以促進(jìn)細(xì)菌黏附或毒素與宿主細(xì)胞的結(jié)合[49]。研究表明,產(chǎn)氣莢膜梭菌膠原黏附蛋白（CNA）可能通過促進(jìn)這種細(xì)菌與受損腸道組織的黏附來促進(jìn)豬腸炎的發(fā)生。NanI促進(jìn)了產(chǎn)氣莢膜梭菌對某些宿主細(xì)胞（包括腸細(xì)胞樣Caco-2細(xì)胞）的黏附性,NanI的失活使菌株CN3718對Caco-2細(xì)胞的黏附顯著降低,并且該作用可以通過互補(bǔ)來逆轉(zhuǎn)。此外,用純化的NanI對Caco-2細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理可使不能產(chǎn)生唾液酸酶的CN3718突變株黏附于Caco-2細(xì)胞,表明NanI修飾了Caco-2細(xì)胞表面,使其對菌株CN3718黏附有促進(jìn)作用,而Nan H和NanJ在產(chǎn)氣莢膜梭菌對Caco-2細(xì)胞的黏附促進(jìn)中起著次要作用。盡管NanI可以顯著促進(jìn)菌株CN3718與Caco-2細(xì)胞的特異性黏附,但NanI本身并不是主要的黏附素,產(chǎn)氣莢膜梭菌體內(nèi)的黏附素仍需進(jìn)一步探究[18]。當(dāng)引起腸道疾病時,D型產(chǎn)氣莢膜梭菌的營養(yǎng)細(xì)胞可能會黏附在腸道組織上,從而促進(jìn)細(xì)菌定植并維持毒素的產(chǎn)生。唾液酸酶特異性地增強(qiáng)產(chǎn)氣莢膜梭菌對宿主細(xì)胞的黏附,這主要?dú)w因于唾液酸在碳水化合物鏈末端的負(fù)電荷[50]。此外,末端唾液酸可破壞內(nèi)皮屏障的完整性。用產(chǎn)氣莢膜梭菌唾液酸酶處理單層上皮細(xì)胞會導(dǎo)致屏障損傷,從而促進(jìn)產(chǎn)氣莢膜梭菌定植并黏附上皮細(xì)胞的能力[51]。NanI和與完整上皮屏障相關(guān)的電荷之間的非特異性相互作用有助于毒素結(jié)合和產(chǎn)氣莢膜梭菌的定植。目前,對產(chǎn)氣莢膜梭菌黏附于宿主細(xì)胞和組織的機(jī)制的研究非常有限[52]。

5.3促進(jìn)產(chǎn)氣莢膜梭菌定植產(chǎn)氣莢膜梭菌可作為人類和其他動物正常腸道微生物群中的成員或致病菌在腸道內(nèi)生長繁殖[53]。但是,哺乳動物小腸中的葡萄糖濃度變化很大（0.2～48.0 mmol/L）,在小腸下部和大腸中營養(yǎng)也比其他腸道菌群競爭激烈。同樣,在腸道疾病期間,腹瀉作用可以降低管腔營養(yǎng)素的濃度。產(chǎn)氣莢膜梭菌解決腸道營養(yǎng)限制的策略是分泌唾液酸酶產(chǎn)生游離的唾液酸作為碳源和能源,唾液酸酶還可以通過修飾黏膜表面以減少電荷排斥和或暴露黏附素受體來促進(jìn)產(chǎn)氣莢膜梭菌在腸道的黏附定植[54-55]。

唾液酸酶可以修飾唾液酸末端并暴露出潛在的碳水化合物或氨基酸,被產(chǎn)氣莢膜梭菌糖苷水解酶或蛋白酶釋放,隨后這些細(xì)菌利用這些營養(yǎng)物進(jìn)行生長。產(chǎn)氣莢膜梭菌F4969菌株是一種非食源性人類腸道感染菌株,可產(chǎn)生3種唾液酸酶,NanI是F4969的主要外唾液酸酶,研究表明通過添加黏蛋白制劑可以增強(qiáng)唾液酸酶活性來促進(jìn)F4969菌株的生長[56]。LI等[57]研究表明,產(chǎn)氣莢膜梭菌F4969可以使用黏蛋白或Caco-2細(xì)胞來支持其生長和存活。此外,NanI可以增強(qiáng)腸道細(xì)菌的生長和存活,部分原因是NanI能夠從黏蛋白釋放游離唾液酸或從宿主細(xì)胞釋放唾液酸修飾的大分子來支持細(xì)菌存活。此外,NanI通過從大分子中去除末端唾液酸來暴露潛在的碳水化合物和氨基酸,從而允許其他糖苷水解酶或蛋白酶水解并釋放營養(yǎng)以供細(xì)菌生長和利用。因此,其他因素可能與NanI協(xié)同發(fā)揮作用,從而促進(jìn)產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長[58]。F型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生腸毒素,引起急性食物中毒和慢性非食源性人類胃腸道疾?。∟FD）,例如抗生素相關(guān)性腹瀉（AAD）。體外研究表明,NanI通過增強(qiáng)F型菌株F4969對腸道細(xì)胞的黏附力并利用產(chǎn)生的唾液酸作為能源來促進(jìn)其細(xì)菌生長,從而促進(jìn)菌株的腸道定植。體內(nèi)研究表明,產(chǎn)氣莢膜梭菌F4969型菌株可以在小鼠的小腸、盲腸和結(jié)腸中存活至少4 d,當(dāng)小鼠感染F4969型NanI缺失菌株后,各腸段細(xì)菌數(shù)量均顯著低于野生型菌株,表明NanI在菌株F4969腸道中定植起重要作用,提示唾液酸酶可以增強(qiáng)細(xì)菌在腸道中的定植[57]。

6 唾液酸酶抑制劑

唾液酸酶在產(chǎn)氣莢膜梭菌感染期間的發(fā)病機(jī)理中具有重要作用。在使用抗生素后,已經(jīng)合成的毒素仍將繼續(xù)起作用,因此產(chǎn)氣莢膜梭菌疾病很難用抗生素治療[59]。唾液酸酶抑制劑已經(jīng)成為治療病毒和細(xì)菌感染的藥物靶標(biāo),體外研究表明,某些唾液酸酶抑制劑可能是治療唾液酸中毒、癌癥、感染、免疫疾病、動脈粥樣硬化和其他病理的有用療法[60]。研究表明,唾液酸酶抑制劑可以減輕小鼠的肺纖維化,這表明唾液酸酶抑制劑可能有助于治療纖維化[61]。已證明2種產(chǎn)氣莢膜梭菌唾液酸酶的經(jīng)典抑制劑Siastatin B（SB）和N-乙?；?2,3-脫氫-2-脫氧神經(jīng)氨酸（NADNA）可以抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌唾液酸酶活性。SB或NADNA可以減少產(chǎn)氣莢膜梭菌F4969菌株對Caco-2細(xì)胞的黏附,并有效抑制從產(chǎn)氣莢膜梭菌D菌株CN3718培養(yǎng)物中收集的無細(xì)胞上清液中唾液酸酶的活性[24]。此外,SB可以減少CN3718菌株中ETX的產(chǎn)生。最近的研究表明,在存在Caco-2細(xì)胞的情況下,SB降低了F4969菌株的生長和存活率[57]。由于某些菌株會產(chǎn)生許多不同的毒素,因此通常很難用疫苗或中和抗體來治療或預(yù)防產(chǎn)氣莢膜梭菌感染[38]。黃酮具有增強(qiáng)對錐蟲病抗性的潛力,研究表明黃酮對產(chǎn)氣莢膜梭菌唾液酸酶具有顯著的競爭抑制作用[62]?？偟膩碚f,唾液酸酶抑制劑可能是開發(fā)產(chǎn)氣莢膜梭菌感染疾病藥物的潛在候選者[63]。

7 展望

唾液酸酶在產(chǎn)氣莢膜梭菌致病機(jī)理中發(fā)揮重要作用,其中NanI占主要地位。以往對產(chǎn)氣莢膜梭菌致病性大多數(shù)集中在毒素的研究,近年來對產(chǎn)氣莢膜梭菌唾液酸酶的研究逐漸深入。雖然研究唾液酸酶在產(chǎn)氣莢膜梭菌的發(fā)病機(jī)理中的作用近年來取得了重大進(jìn)展,仍然有許多問題需要解答。產(chǎn)氣莢膜梭菌唾液酸酶的未來研究也可能涉及以下方面的研究:（1）NanI是否直接導(dǎo)致疾??；（2）調(diào)控唾液酸酶的各種系統(tǒng)之間的關(guān)系；（3）唾液酸酶Nan H和NanJ在產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的腸道感染中的作用以及Nan H、NanI和NanJ是否具有協(xié)同作用；（4）由流行病學(xué)上不同的產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株產(chǎn)生的特定唾液酸酶的差異。唾液酸酶抑制劑對治療產(chǎn)氣莢膜梭菌感染疾病提供了新的見解和思路,需要進(jìn)一步研究唾液酸酶的致病機(jī)理,從而為促進(jìn)預(yù)防和治療產(chǎn)氣莢膜梭菌感染尋求新突破。