細菌對抗菌藥物敏感性檢測方法研究進展

林施聘,賴文韜,姜中其 （浙江大學 動物科學學院,浙江 杭州 310058）

近年來,越來越多的病原菌對一種或多種抗生素產(chǎn)生耐藥性,甚至出現(xiàn)超級細菌。耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌、耐萬古霉素的糞腸球菌等耐藥菌株的出現(xiàn)成為危害公共健康的緣由之一。據(jù)報道,預計到2050年,耐藥菌的感染將超過癌癥和心臟病,成為主要的病死原因[1]。此外,新抗菌藥物的研發(fā)受到時間、成本等方面的限制。因此,臨床獸醫(yī)能夠快速、準確地對患病動物做出診斷并開具處方對精準醫(yī)療有重大的意義。傳統(tǒng)的藥敏試驗方法（antibiotic susceptibility testing,AST）依靠表型來確定待檢菌對抗菌藥物的敏感情況,比如擴散法、稀釋法、E-test法,這些方法雖然準確、成本低、易操作,但是從預培養(yǎng)到分離純化病原微生物,再到檢測對藥物的敏感性,整個過程長達48～72 h。因此,臨床獸醫(yī)常放棄傳統(tǒng)藥敏試驗而根據(jù)可疑的病原菌結(jié)合當?shù)氐牧餍胁W選擇經(jīng)驗療法以快速治療患者。為解決這一現(xiàn)實問題,科學家們致力于開發(fā)快速藥敏試驗檢測技術,以避免亂用、濫用抗生素。

通常情況下,藥敏試驗分為基因型AST和表型AST?；蛐虯ST包括聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction,PCR）技術、環(huán)介導等溫擴增技術（LAMP）、下一代測序等,其優(yōu)勢主要包括兩方面:一是可在短時間內(nèi)完成檢測；二是有些方法可直接對臨床樣本進行檢測,無需繁瑣的預處理。但也存在著一些問題,除了成本高、不能提供最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration,MIC）外,基因型AST還容易出現(xiàn)假陽性或假陰性的結(jié)果。新興的表型AST包括微流體技術、拉曼光譜、表面等離子體共振等,主要基于在給定的物理化學環(huán)境中將細菌的生長、形態(tài)等生理參數(shù)的變化轉(zhuǎn)化為可測量的信號。而在抗菌藥物的作用下細胞產(chǎn)生的生理變化要比細胞抑制更快（1 hvs1～2 d）[2],因此新興的表型AST比傳統(tǒng)藥敏試驗方法快速,但是其成本、可操作性、準確性有待進一步的驗證與考量。

1 傳統(tǒng)藥敏試驗方法

1.1擴散法擴散法主要包括紙片法、牛津杯法和打孔法,具有低成本、結(jié)果直觀等優(yōu)點,其中紙片法運用最廣。紙片法的原理是將浸有抗菌藥物的紙片貼在涂有待檢菌的瓊脂平板上,由于藥物會在瓊脂平板上進行擴散并且隨著距離的增加濃度會逐漸降低,最終根據(jù)培養(yǎng)基上出現(xiàn)的抑菌圈的直徑大小判斷待檢菌對抗菌藥物的敏感性[3]。但是,擴散法的試驗結(jié)果受多種因素的影響,如培養(yǎng)基的厚度、抗生素含量等,加上試驗中用到的試劑和耗材如培養(yǎng)基、藥敏紙片等來源渠道各異,因此須實施質(zhì)控監(jiān)測,即在平行條件下將質(zhì)控菌株與待檢菌進行藥敏試驗。只有當質(zhì)控菌株的抑菌圈在預測值之內(nèi)時,待檢菌的試驗結(jié)果才可信[4]。

1.2稀釋法稀釋法是監(jiān)測待檢菌在含一系列二倍稀釋抗菌藥物的培養(yǎng)基中生長情況,其優(yōu)勢在于操作簡便、重復性強等。稀釋法可分為瓊脂稀釋法和肉湯稀釋法。瓊脂稀釋法利用固體培養(yǎng)基進行藥物敏感性檢測。將待檢菌接種在含有抗菌藥物的瓊脂平板上并過夜培養(yǎng)后,未有細菌生長的瓊脂平板對應的最小藥物濃度即為MIC。肉湯稀釋法可分為微量肉湯稀釋和宏觀肉湯稀釋,其操作原理與瓊脂稀釋法相似,但換成了液體培養(yǎng)基[5]。

1.3E-test法與含有均等抗菌藥物濃度的藥敏紙片不同,E-test法所用到的非滲透性測試條的一端至另一端包被著濃度逐漸增高的抗菌藥物。將檢測條貼于瓊脂平板表面時,藥物經(jīng)擴散會形成一個連續(xù)變化的濃度梯度,待檢菌經(jīng)培養(yǎng)后最終在平板上會形成抑菌圈,在抑菌圈與測試條的交界處所對應的抗菌藥物濃度即為該藥物對待檢菌的MIC[6]。E-test法與紙片法相似,具有定量的優(yōu)點,并且MIC的判別與稀釋法相比更加直觀,但是其成本較高。

1.4藥敏自動檢測系統(tǒng)目前主要有3種被廣泛采用的藥敏自動檢測系統(tǒng),分別為德國西門子的MicroScan Walk Away系統(tǒng)、法國梅里埃的VITEK系統(tǒng)和美國BD公司的Phoenix系列自動化儀器,均基于微量肉湯稀釋法的原理設計。MicroScan Walk Away系統(tǒng)通過分光光度法檢測細菌生長情況。VITEK系統(tǒng)可動態(tài)監(jiān)測細菌生長情況,將生長速率與藥物濃度作線性回歸分析后判定MIC。Phoenix系統(tǒng)將刃天青作為氧化還原指示劑,通過檢測還原態(tài)刃天青的熒光強度來判定細菌生長狀況[3]。這3種自動檢測系統(tǒng)的缺點是儀器體積龐大、不便攜、昂貴、使用成本高,但優(yōu)勢在于嚴格遵循臨床和實驗室標準協(xié)會（CLSI）和歐洲委員會的抗菌藥敏試驗（EUCAST）指南。

2 新興藥敏試驗技術

2.1基因型AST自1988年首次報道了使用熱穩(wěn)定聚合酶進行核酸擴增的方法以來[7],PCR技術發(fā)展迅速,包括普通PCR和實時熒光定量PCR。PCR技術根據(jù)DNA熱變性原理,通過控制溫度對特定區(qū)域的序列進行擴增。普通PCR技術可檢測待檢菌的耐藥基因,但由于耐藥基因的出現(xiàn)不總與耐藥表型一致,且樣品基質(zhì)中所含的化合物可能會抑制擴增反應,容易導致假陰性或者假陽性的結(jié)果[8]。實時熒光定量PCR可準確定量樣本中特殊核酸的拷貝數(shù)來測量細菌生長量,而不依賴于細菌耐藥機制。LAMP利用4個引物和6個識別（退火）位點在60 min內(nèi)產(chǎn)生高水平的擴增子。與僅使用2個引物的標準PCR相比,LAMP具有更高的特異性[9]。微陣列可將多個探針固定在固體或液體介質(zhì)上,因此可以同時檢測細菌基因組中與耐藥基因相關的多個突變位點[10],其在分枝桿菌的鑒定及耐藥基因的檢測上的優(yōu)勢尤為明顯[11]。PCR技術的主要優(yōu)點是靈敏、快速,甚至可以直接對臨床樣本進行檢測,但也有局限性,包括難以區(qū)分活細胞和死細胞,不能提供MIC,并且核酸擴增的陽性結(jié)果并不能證明有生命體的存在[12]。而下一代測序可通過對全基因組的測序來比較等位基因或分析單核苷酸多態(tài)性,從而預測細菌的耐藥性[13]。

2.2基于光學的表型AST

2.2.1ATP生物發(fā)光測定法 ATP生物發(fā)光測定法的原理是基于螢光素酶利用ATP將熒光素氧化為腺苷酰氧化螢光素,最終形成的光強度與樣品中的ATP成一定比例,從而檢測細菌密度[14]。由于樣本中存在游離的非細菌ATP,體細胞中所含的ATP等干擾因素的存在,該方法無法準確地進行定量檢測。IVANCIC等[15]在檢測臨床尿液樣本中的細菌載量時,先用體細胞提取劑來選擇性地裂解宿主細胞以釋放ATP,再用ATP酶來裂解宿主細胞的ATP以及游離的非細菌ATP,以提高檢測的準確性,最終發(fā)現(xiàn)該方法可準確估計臨床尿液樣本中的細菌密度。

2.2.2拉曼光譜 拉曼光譜是一種非侵入性、無標記的可檢測分子振動的技術,它由存在于待檢菌培養(yǎng)液中的所有生物分子相對應的條帶組成,這些條帶代表著分子的物理化學特征。對拉曼光譜進行必要的校準后,觀察添加抗生素前后所形成的拉曼光譜的區(qū)別,其中峰位置的側(cè)移反映了細菌表型的生物生化或生物物理變化,而峰高的變化則反映了該峰代表的生物分子豐度的變化[16]。但是,拉曼光譜的靈敏度較低,可通過金屬納米粒子利用表面增強拉曼散射（surface-enhanced raman scattering,SERS）來解決這一問題。LIU等[17]展示了一種高靈敏度的SERS基板,即Ag納米粒子嵌入的陽極氧化鋁納米通道,其利用這一技術來研究分別在苯唑西林和亞胺培南作用下的甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌和野生型大腸桿菌的拉曼光譜,結(jié)果顯示,敏感菌的表面增強拉曼散射光譜在波數(shù)為730 cm—1處的峰值在2 h內(nèi)有明顯的下降,同時可以確定MIC。雖然SERS提高了拉曼光譜的靈敏度,但是其需要底物,且細菌通常被可能干擾細菌拉曼信號的不同底物包圍,導致信號的實際變化太大。HONG等[18]開發(fā)了一項在單細胞水平上的拉曼散射成像技術,其利用正常葡萄糖和葡萄糖-d7培養(yǎng)基培養(yǎng)糞腸球菌并將細菌沉積在瓊脂糖凝膠墊上,用CARS顯微鏡在C-D振動區(qū)域?qū)渭毎M行成像,結(jié)果顯示在添加萬古霉素后,敏感菌株和耐藥菌株在0.5 h內(nèi)就表現(xiàn)出了不同的反應。

2.2.3表面等離子體共振 當光以一定的入射角與金屬表層中的電子耦合時,電子會被激發(fā)而平行于金屬表面移動以形成表面等離子體,能達到最大激發(fā)效率的入射角稱為表面等離子體共振（surface plasmon resonance,SPR）角,而未耦合的部分則形成反射光。然而,耦合條件受到了與金屬表面相鄰材料折射率的影響。在SPR生物傳感器中,將探針結(jié)合在金屬表面,當目標分子與探針結(jié)合時,傳感器的折射率發(fā)生變化,通過監(jiān)測反射光或者SPR角的變化來檢測目標分子與探針的相互作用[19]。將列陣技術與SPR成像（surface plasmon resonance imaging,SPRI）技術結(jié)合還可以進行高通量篩選。在SPRI技術中,入射角保持恒定,通過CCD攝像機監(jiān)測反射光的強度變化來反映傳感器的折射率變化。其中,CCD攝像機可以檢測整個列陣的圖像,從而提供每個列陣點的反射光信息[20]。然而,SPR傳感器常用到的棱鏡會限制成像系統(tǒng)的數(shù)值孔徑及放大倍數(shù),從而影響了空間分辨率。并且,樣本和攝像機之間的相對運動在棱鏡的影響下導致獲取的圖像發(fā)生改變,而物鏡型SPR則可以解決這一問題。物鏡型SPRI在掃描入射角時,樣品和成像系統(tǒng)是固定的,并且可以通過使用高數(shù)值孔徑和高倍率成像系統(tǒng)可保證成像光學的分辨率受到衍射限制,從而避免圖像失真[21]。SYAL等[22]開發(fā)了一項等離子體成像和跟蹤技術,可以在2 h內(nèi)檢測多黏菌素B對大腸桿菌O157:H7和尿路致病性大腸桿菌的MIC。該技術利用680 nm超級發(fā)光二極管來激發(fā)SPR圖像,通過使用高數(shù)值孔徑物鏡（NA 1.49）和倒置顯微鏡對47 nm厚的金傳感器芯片進行對比成像,并基于變化的等離子體圖像對比度揭示細菌的納米運動。結(jié)果顯示,抗生素的作用能顯著減慢敏感菌細胞的納米級運動。

2.3基于電學的表型AST

2.3.1基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜 用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS）分析樣品時,需要將樣品混合或包被于酸性基質(zhì)中,當基質(zhì)結(jié)晶時,包埋于基質(zhì)中的樣品發(fā)生共結(jié)晶,經(jīng)激光束投射后電荷從基質(zhì)轉(zhuǎn)移至樣品中,引起新電離粒子的解吸,接著在固定電場作用下由于質(zhì)荷比的不同而相互分離,并用飛行時間分析儀測量離子穿過電場所需的時間來確定質(zhì)荷比,最終生成肽質(zhì)量指紋的特征圖譜[23]。利用MALDI-TOF MS可通過不同的角度來分析待檢菌的藥物敏感性。首先,通過特征峰來分析細菌的敏感性,但是其局限性在于,只有當光譜數(shù)據(jù)庫包含各屬/種/亞種的菌株的肽質(zhì)量指紋圖譜時,才能鑒定分離株。其次,利用抗生素發(fā)生的變化（水解,脫羧,乙酰化）來確定其是否產(chǎn)生作用。例如,β-內(nèi)酰胺類抗生素可通過水解而失活,加水使原始抗生素質(zhì)量增加18 k Da,而脫羧作用使相對分子質(zhì)量減少44 k Da。兩者合計,與抗生素的原始質(zhì)量相比損失26 k Da。但是當細菌通過除了酶以外的其他途徑獲得耐藥性時,該方法無效[24]。再者,SPARBIER等[25]描述一種基于MALDI-TOF MS的非常通用的測定細菌的藥物敏感性的方法,即用含同位素標記的氨基酸的培養(yǎng)基來培養(yǎng)細菌,其耐藥性可從在含有同位素標記的氨基酸和抗生素的培養(yǎng)基中生長的細菌所產(chǎn)生的光譜推斷,如果細菌具有耐藥性,其質(zhì)荷比m/z會變高。理論上,該方法基于細菌生長,因此不受制于任何耐藥機制。

2.3.2介 電 電 泳 介 電 電 泳（dielectrophoresis,DEP）是一種無標記、低成本的診斷技術。在該技術中,帶電或中性粒子的極化是由交流電或直流電產(chǎn)生的電場引起的,當粒子和周圍介質(zhì)具有不同的極化率時,會在電場中發(fā)生不同方向的運動。因此,可通過改變電場大小等因素來操縱粒子的運動。不同的細胞類型,處于成熟或增殖各個階段的細胞以及患病的細胞的極化率均不同,所以可通過研究它們的介電電泳行為來區(qū)分細胞的狀態(tài)[26]。當使用交流電時,常通過提高頻率（大于100 Hz）來消除電滲透和電泳同時減少電化學反應,如氣體的產(chǎn)生；而直流電介電電泳是近年來新開發(fā)的技術,通過使用絕緣體列陣來形成空間的不均勻性后施加電場,由于電極可以不與樣本直接接觸,該技術可以減少樣本受到積垢、電解的影響,同時由于無需金屬控件,設備制作更簡單[27]。細菌經(jīng)過電場的分選后可進一步觀察細菌在抗生素作用下發(fā)生的形態(tài)學變化。SU等[28]開發(fā)了一種四電極陣列,其形成的非均勻電場是由函數(shù)發(fā)生器產(chǎn)生的。敏感菌經(jīng)藥物處理后比周圍的介質(zhì)的極化率高,被吸引到電場的強區(qū)域。相反,如果用無活性藥物或無藥物處理的細胞的極化能力不及周圍介質(zhì),則被排斥到電場的弱區(qū)域。通過光學顯微鏡,結(jié)合CCD照相機和監(jiān)視器屏幕,觀察到細胞伸長、膨脹、裂解等。

2.3.3電化學傳感器 電化學傳感器由于其便攜性、獨立性和低成本而成為強大的分析工具,通常是基于細菌與相應受體結(jié)合后引起電信號的變化來研究細菌的生長情況。根據(jù)如何測量電信號的變化可將該傳感器分為以下5類:（1）阻抗生物傳感器。通過對工作電極施加電勢脈沖來獲取電流響應,從而檢測工作電極-電解質(zhì)界面的電容變化[29]。（2）安培/伏安生物傳感器。多數(shù)利用細菌與化學物質(zhì)的氧化還原反應來檢測電流的變化,從而反映細菌的生長情況[30]。（3）電勢生物傳感器。主要檢測離子選擇電極的電荷的積累,該電極的電勢可選擇性地響應給定離子的濃度[31]。（4）場效應晶體管生物傳感器。主要由源極、漏極、柵極組成,連接源極和漏極的半導體材料修飾生物識別分子,當其識別靶標分子后,改變了半導體材料的電導,而柵極施加的柵壓可放大輸出的電流變化[32]。（5）電導生物傳感器。將能夠識別、結(jié)合靶標分子的介質(zhì)（如納米線）連接2個電極,通過監(jiān)測介質(zhì)的電導率變化實現(xiàn)對靶標分子的選擇性檢測[33]。

2.4基于機械學的表型AST

2.4.1異步磁珠旋轉(zhuǎn)傳感器 異步磁珠旋轉(zhuǎn)（asynchronous magnetic bead rotation,AMBR）傳感器是一項無標簽、能夠進行實時監(jiān)測的技術。放置在外部旋轉(zhuǎn)磁場內(nèi)的磁珠具有一定的旋轉(zhuǎn)頻率,而這種頻率受到磁珠（即形狀和體積）的變化或環(huán)境（即黏度）的影響?；谂ぞ氐拇胖閭鞲衅骺杀O(jiān)測由單個細菌細胞的附著和生長引起的阻力變化。當細菌細胞附著到飾有特異性抗體的磁珠上,磁珠復合物的有效體積會增加,然后在顯微鏡上對細菌的伸長和分裂進行觀察和測量,并量化傳感器磁珠的旋轉(zhuǎn)周期的變化。SINN等[34]將單個AMBR生物傳感器限制在納米級大小的油包水（w/o）液滴內(nèi),來監(jiān)測細菌細胞的增長。該系統(tǒng)的高靈敏度使得異質(zhì)性研究以及單細胞動力學研究成為可能。同一小組利用該技術開發(fā)了AMBR黏度計,當細菌生長時,細菌濃度以及分泌的多糖會影響溶液黏度,最終改變珠子的旋轉(zhuǎn)頻率[35]。雖然AMBR傳感器已經(jīng)顯著減少AST測量時間,但仍需復雜的驅(qū)動磁場來確定每個磁珠的旋轉(zhuǎn)周期。CHUNG等[36]開發(fā)了一項將光擴散法和基于磁珠的免疫分析相結(jié)合的技術來量化粒子的布朗運動。當活細菌特異性附著在顆粒上時,光擴散率會上升；當經(jīng)過抗生素作用的敏感菌附著在顆粒上時,光擴散率會下降。該方法的靈敏度高,只需少量樣品就可同時測定多種病原體。隨后,CHUNG等[37]為同時檢測多種病原體的藥物敏感性優(yōu)化了該項技術。通過不同的病原體特異性抗體功能化的熒光色顆粒與病原體結(jié)合,使用ImageJ將多色粒子圖像分開,從而產(chǎn)生每種熒光色的圖像集。然后,通過互相關算法分析分割后的圖像集,以評估其相應的擴散率值。相對擴散率值是通過將抗原抗體特異性結(jié)合的粒子的擴散率除以參考粒子的擴散率而獲得的,從而消除了因不同環(huán)境因素或背景噪聲引起的測量差異。

2.4.2納米機械生物傳感器 納米機械生物傳感器具有微米甚至納米尺寸的運動部件,通常是懸臂形的。由于生物分子的大小與傳感器的尺寸（主要是厚度）相當,因此傳感器對吸附的生物分子的機械特性高度敏感。當細胞特異性吸附于懸臂時,質(zhì)量、表面應力、有效楊氏模量、黏彈性等參數(shù)會發(fā)生改變,導致傳感器發(fā)生偏轉(zhuǎn)或共振頻率的變化,通過光學、電學技術可以至少以0.1 nm Hz—1/2的靈敏度檢測到傳感器的機械變化[38]。其中,最常用到的是光杠桿技術,其原理是檢測經(jīng)傳感器表面反射的激光束的偏轉(zhuǎn)。STUPAR等[39]通過將納米機械生物傳感器與快速獲取血液培養(yǎng)物中的細菌沉淀的方法相結(jié)合,可直接對血液樣品進行藥敏試驗,其利用氯化銨離心技術在1 h內(nèi)對來自陽性血液培養(yǎng)物的細菌進行濃縮,當附著的細菌具有代謝活性時,可通過光學杠桿方法來檢測傳感器的振蕩,并在3 h內(nèi)檢測出大腸桿菌對環(huán)丙沙星等藥物的敏感性。而電學技術中最常用到的壓阻檢測,該技術需要將壓阻元件與傳感器一體化,利用惠斯登電橋測量由分子吸附在壓阻元件后引起的電阻變化。NUMFOM等[40]將PCR技術應用于壓阻式納米機械生物傳感器,當霍亂弧菌的ctx A基因與壓阻材料上的ssDNA探針結(jié)合時,可引起壓阻材料的電阻變化從而檢測傳感器的彎曲度。該傳感器可在3.25 pg或14 nmol/L的DNA模板中檢測出ctx A基因,比傳統(tǒng)PCR的靈敏度高10倍。原子力顯微鏡是連接著微懸臂的顯微鏡,可以對懸臂表面的細胞進行掃描以獲取其形態(tài)、生長情況等信息。原子力顯微鏡有許多優(yōu)點,首先它具有非常高的分辨率,可以識別細菌的納米結(jié)構；其次,它可用來探索微生物的納米力學特性,同時探測外部刺激引起的形態(tài)和機械變化；另外,AFM還可以任何環(huán)境條件下使用,包括液體、真空在內(nèi)[41]。但是,納米機械生物傳感器仍存在著局限性。例如,懸臂的尺寸會影響捕獲細菌的數(shù)量；在液體環(huán)境中測量共振頻率的靈敏度會由于液體阻尼的存在而受到懸臂的低質(zhì)量（Q-因子）的限制。而微通道諧振器可以很好地解決這一問題。由于液體在懸臂內(nèi),后者可在真空環(huán)境下發(fā)生共振,使得分辨率變得更高。但由于微通道諧振器缺乏檢測選擇性,ETAYASH等[42]將其和紅外光譜結(jié)合,在微懸臂中嵌入一個微通道,通過獲取包括細菌的吸附質(zhì)量、表面應力、紅外光譜在內(nèi)的3個信號來提高該檢測系統(tǒng)的選擇性。首先,細菌的吸附會改變懸臂的質(zhì)量,導致懸臂共振頻率發(fā)生變化。然后,吸附引起的表面應力會使懸臂彎曲。另外,由于非輻射衰減,當紅外輻射照射懸臂時,被吸附的細菌吸收特定的紅外波長,懸臂發(fā)生額外的偏轉(zhuǎn)。

2.5其他

2.5.1流式細胞術 種群的異質(zhì)性以及細胞間的相互作用的存在影響試驗的準確性,而流式細胞術可對單細胞進行評估,其正好解決這一問題。流式細胞儀能檢測細胞個數(shù)和生理特性,包括膜電位、膜完整性、DNA含量、酶活性等,并且每秒能夠分析成千上萬個細胞[43]。通過選擇不同的熒光探針和不同角度的光散射來進行細胞分選,其中光散射反映細胞大小和結(jié)構,而熒光則反映DNA或特定蛋白質(zhì)的含量、酶活性、膜電位[44]。

2.5.2微流體技術 微流體技術可將細胞限制在微米級甚至是納米級的設備中,因此,可以高度控制細胞的微環(huán)境。微流體技術的發(fā)展歸功于一種易于使用的制造技術,即軟光刻技術,它可制造不同形狀的彈性體聚合物的微器件,而目前最常用的就是聚二甲基硅氧烷[45]。微流體技術有非常多的優(yōu)點:可根據(jù)試驗需求為單細胞制造不同的微生物環(huán)境；在物理上實現(xiàn)隔離,但允許化學交流；使目標分子容易達到可檢測水平；微流體系統(tǒng)的較大的表面積與體積比有助于細菌的快速生長[46]。由于很多細菌具有很強的運動能力,因此還可以利用微流體將其捕獲在液滴,微腔,通道中,進而用直接和間接的方法對單個細菌的生長進行監(jiān)測[47]。目前,利用微流體技術開發(fā)了多種具有特定功能的設備,比如濃度梯度生成器,高通量篩選平臺,微腔陣列等。濃度梯度生成器通常是由一系列的通道和腔室組成,層流的液體在通道中隨著流動發(fā)生擴散混合,最終在腔室形成線性濃度梯度的化學物質(zhì)。因此將濃度梯度生成器應用于藥敏試驗,不僅減少了人力,而且能觀察細菌對線性濃度梯度的抗生素的反應[48]。為了在短時間內(nèi)確定細菌在使用抗菌藥物后是否能繼續(xù)分裂,CHOI等[49]開發(fā)了一種單細胞形態(tài)分析（SCMA）技術,首先將細菌和瓊脂糖混合后注入微流體通道內(nèi)然后通過凝膠固化將細菌固定,接著抗菌藥物擴散至瓊脂中,并對細菌的形態(tài)變化進行延時成像,最終觀察到細菌發(fā)生分裂、絲狀形成、腫脹、絲狀形成與分裂、腫脹形成與分裂等5種形態(tài)變化。BROUZES等[50]提出一種基于液滴的微流體技術,可將單個細胞和藥物封裝在不混溶的獨立水性微滴（體積為1～104p L）中,為了進行高通量篩選,他們還對每一種藥物編碼了光學標簽,將藥物與細胞混合后,經(jīng)過染色可檢測液滴的熒光,進而識別液滴中的藥物。他們還利用自己開發(fā)的液滴存活力測定法對液滴內(nèi)細胞活力和生長進行定量評分。這種基于液滴的技術的優(yōu)點包括:液滴的微小體積使試劑快速有效混合；高通量地對液滴進行數(shù)字處理；特別適用于處理可用性有限的細胞,例如干細胞或患者的原代細胞。在細菌生長過程中,糖的代謝產(chǎn)物有機酸的增加會導致培養(yǎng)基p H值發(fā)生變化。針對該現(xiàn)象,TANG等[51]開發(fā)了一種微流體p H傳感器,他們將對p H敏感的殼聚糖水凝膠涂覆在多孔硅芯片上,該芯片用作微流體通道的基底。當p H發(fā)生變化時,殼聚糖水凝膠發(fā)生溶脹,導致有效光學厚度發(fā)生變化,因此可通過傅立葉變換反射光譜法實時觀察微通道中p H的變化。該傳感器的優(yōu)點是通過將細菌細胞限制在納升大小的通道中,可以快速積累代謝產(chǎn)物,還能獲得完整的細菌生長曲線。微流體技術在研究一些特殊細菌的試驗中也顯示良好的發(fā)展前景。眾所周知,生物膜中的細菌比浮游細菌對抗生素的抵抗力要高得多。而微流體系統(tǒng)不僅能促進生物膜的形成,而且能研究生物膜形成的機制以及抗生素對消除生物膜的影響[52]。

2.5.3等溫微量熱法 等溫微量熱法（isothermal microcalorimetry,IMC）是將微生物置于安瓿瓶中,通過測量其生長代謝引起的熱量變化來研究抗菌藥物對待檢菌的影響。該方法的優(yōu)點主要有以下幾方面:第一,每個活細胞平均產(chǎn)生1～3 p W的熱量,而等溫微量熱儀可測量低至1μW的熱流,因此只需少量樣品就可完成檢測；第二,密封的安瓿瓶可提高微生物安全性,減少交叉污染；第三,IMC具有非破壞性的特點,經(jīng)IMC測量后的未受干擾的樣本可進行二次評估；第四,IMC還可以對細菌產(chǎn)生的熱流變化進行實時監(jiān)測,經(jīng)驗證,隨時間推移累積的熱量與細菌含量的升高相關[53]。眾所周知,MIC并不能區(qū)分抗生素具有抑菌性還是殺菌性,而IMC不僅能夠提供MIC結(jié)果,而且還能通過定量測量抗生素對細菌滯后階段以及生長速率的影響來確定抗生素的性質(zhì)。具體而言,延長的滯后階段表明抗生素具有殺菌活性,這是由于即使一部分細胞被殺死,其最大生長速率也不受影響或受到的影響較?。欢志鷦蓴_細胞過程,導致最大生長速率下降而對滯后期持續(xù)時間的影響很小[54]。但是,由于安瓿瓶內(nèi)的氣體無法流通,同時不同細菌和抗生素、初始的細菌濃度等因素導致檢測時間的不確定性,使得瓶內(nèi)的環(huán)境存在差異,從而影響試驗的準確性。

3 展望

近年來,快速藥敏試驗技術的發(fā)展為控制耐藥性帶來了希望。但是,許多技術雖然加快了臨床病原微生物對藥物敏感性的檢測速度,但仍要求在檢測之前從臨床樣品中分離純化出病原微生物。因此,加快藥敏試驗的整個進程甚至實現(xiàn)直接用臨床樣本進行藥敏試驗將成為最終要解決的難題。譬如,血液的成分比尿液的要復雜得多,如何在實現(xiàn)直接對臨床血液陽性培養(yǎng)物進行藥敏檢測的過程中降低其背景值的問題也需要建立標準。在縮短檢測時間的同時必須要與傳統(tǒng)藥敏試驗進行對比以驗證準確性,美國FDA規(guī)定,嚴重錯誤率（誤鑒定為敏感菌株）必須＜1.5%,主要錯誤率（誤鑒定為耐藥菌株）必須＜3.0%。上述新興藥敏試驗檢測技術雖然縮短了檢測時長,但是與“金標準”藥敏試驗方法相比,仍需要對其成本效益、準確性、實用性做出進一步的評估。