過(guò)表達(dá)海洋微生物宏基因組MbCSP 提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱和耐寒性

王夢(mèng)姣 曹鈺雪 徐永盛 丁風(fēng)鵝 蘇 喬

（大連理工大學(xué)生物工程學(xué)院，植物基因工程實(shí)驗(yàn)室，大連 116023）

干旱和低溫是影響農(nóng)作物產(chǎn)量的兩大主要因素。干旱會(huì)導(dǎo)致植物的膜系結(jié)構(gòu)破壞、細(xì)胞代謝紊亂及光合速率下降等，從而導(dǎo)致作物生長(zhǎng)緩慢，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)。溫度是影響植物生長(zhǎng)和發(fā)育的重要因素，低溫會(huì)導(dǎo)致植物受到嚴(yán)重?fù)p傷甚至死亡。采用基因工程技術(shù)將相關(guān)抗逆基因轉(zhuǎn)入農(nóng)作物，進(jìn)而培育出轉(zhuǎn)基因作物抗逆新品種，是解決干旱和低溫災(zāi)害的有效途徑之一。

冷激蛋白（CSPs）是一類高度保守的核酸結(jié)合蛋白，在微生物、動(dòng)物與植物中廣泛存在。CSPs的大部分功能是通過(guò)冷休克結(jié)構(gòu)域（CSD）與核酸結(jié)合實(shí)現(xiàn)的，主要功能是作為RNA 分子伴侶與mRNA 結(jié)合，起到穩(wěn)定mRNA 的作用。CSD 是一個(gè)保守的核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域，能特異性結(jié)合RNA、單鏈DNA 及雙鏈DNA，阻止mRNA 在逆境脅迫下形成的穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，保證轉(zhuǎn)錄和翻譯的順利進(jìn)行。目前對(duì)CSP的研究已經(jīng)有了較大進(jìn)展，已從多種生物中克隆出。最早被發(fā)現(xiàn)和研究的冷激蛋白是大腸桿菌（）的CspA。已陸續(xù)從嗜熱鏈球菌（）、沙門氏桿菌（serovar Ty‐phimurium）等微生物，小麥（L.）、擬南芥（）、水稻（L.）等植物中克隆出。

一些研究已證實(shí)了CSP 基因的轉(zhuǎn)入能提高農(nóng)作物的抗逆性。Castiglioni 等將大腸桿菌的CspA 和枯草桿菌的CspB轉(zhuǎn)入了擬南芥、水稻和玉米（Zea mays）中，在干旱脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因植株的葉片生長(zhǎng)、葉綠素含量和光合速率顯著優(yōu)于野生型。對(duì)轉(zhuǎn)CspB 基因的玉米進(jìn)行田間干旱試驗(yàn)，轉(zhuǎn)基因玉米的單穗籽粒數(shù)量顯著高于野生型玉米。徐萍莉等將枯草芽孢桿菌（）XS-01 的cspB 基因轉(zhuǎn)入煙草（），干旱脅迫結(jié)果表明在土壤水分恢復(fù)10 d 后，轉(zhuǎn)基因植株的單株干質(zhì)量較野生型顯著增加；轉(zhuǎn)基因植株的光合速率能快速恢復(fù)，但野生型植株恢復(fù)緩慢。Yu 等研究表明在干旱和鹽脅迫條件下，轉(zhuǎn)SeCspA 和SeCspB 基因小麥比野生型具有更低的丙二醛含量、失水率和鈉離子含量，更高的葉綠素含量和脯氨酸含量；田間試驗(yàn)表明，在干旱脅迫條件下，與野生型相比，轉(zhuǎn)SeCspA 基因小麥品系的千粒質(zhì)量和產(chǎn)量均有較大提高。孫雪慧等將來(lái)源于枯草芽孢桿菌的基因cspB 轉(zhuǎn)入大豆（Gly‐cine max）中，研究表明在自然干旱25 d 后非轉(zhuǎn)基因植株已近萎蔫，而轉(zhuǎn)cspB 基因大豆長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)較好。Choi 等將白菜（Brassica pekinensis）中的冷激蛋白基因BrCSDP3 轉(zhuǎn)入到擬南芥中，發(fā)現(xiàn)在脫落酸（Abscisic Acid，ABA）、干旱和鹽堿脅迫狀態(tài)下，轉(zhuǎn)基因擬南芥發(fā)芽率更高、根長(zhǎng)增加和幼苗生長(zhǎng)狀態(tài)更好。王紅蕾等研究表明在低溫（4 ℃）脅迫下，轉(zhuǎn)AmCSDP 基因煙草萌發(fā)率、存活率和長(zhǎng)勢(shì)均顯著高于野生型。

海洋面積占地球總面積的70%，且海洋環(huán)境中的微生物約有100 萬(wàn)種。99%的海洋微生物不能用傳統(tǒng)方式進(jìn)行分離培養(yǎng)，使得對(duì)其功能的使用受到了限制，其中很可能存在人們從未研究過(guò)的CSP 家族蛋白。近年來(lái)提出的宏基因組學(xué)（Metagenomic）技術(shù)克服了“培養(yǎng)限制”的問(wèn)題。該技術(shù)直接將特定小生境中全部微小生物的遺傳物質(zhì)進(jìn)行整體提取并對(duì)微生物群體進(jìn)行研究分析，使得人們對(duì)海洋微生物有了進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，能更大限度的利用海洋微生物資源。目前多數(shù)冷激蛋白基因是從已知生物中得到，來(lái)源于未知海洋微生物的鮮見報(bào)道。

因此，本研究擬從海洋微生物宏基因組DNA中克隆基因，將其構(gòu)建植物表達(dá)載體pTF101-并采用花序浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥，通過(guò)干旱和低溫脅迫條件下對(duì)植株進(jìn)行生物量的測(cè)量和生理指標(biāo)的檢測(cè)，來(lái)研究該基因的抗旱和耐寒功能，為培育農(nóng)作物抗逆新品種奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

海洋微生物來(lái)源于中國(guó)大連黑石礁海域（38.9°N，121.6°E）。野生型擬南芥（）、植物表達(dá)載體pTF101、根癌農(nóng)桿菌（）GV3101 菌株和大腸桿菌（）DH5α菌株均為本實(shí)驗(yàn)室保存樣本。

1.2 海洋微生物MbCSP基因編碼區(qū)的克隆

采用Francis 等在CSP 家族基因序列高度保守區(qū)設(shè)計(jì)的一對(duì)簡(jiǎn)并引物CSPU5 和CSPU3（見表1），以海洋微生物宏基因組DNA為模板，PCR 擴(kuò)增基因部分編碼區(qū)。采用寶生物公司的MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0 DNA 回收試劑盒回收PCR 產(chǎn)物，連接到pMD18-T載體上，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒，PCR 檢測(cè)后選取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

表1 PCR 引物序列Table 1 PCR primer sequence

3′DNA 和5′DNA 序 列 采 用 錨 定PCR方法獲得。根據(jù)已克隆得到的基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)兩條特異性巢式引物CSP-1 和CSP-2（見表1）。以海洋微生物宏基因組DNA 為模板，首先采用特異性引物CSP-1 和CSP-2 分別進(jìn)行單引物擴(kuò)增，在末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，在單鏈擴(kuò)增產(chǎn)物的3′末端和5′末端分別加上寡聚鳥嘌呤oligo d（G）；以加尾產(chǎn)物為模板，分別采用特異性巢氏引物CSP-3和CSP-4與Oligo d（C）進(jìn)行PCR擴(kuò)增；電泳分離后切取目標(biāo)條帶回收，回收片段連接到pMD18-T 載體上，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒，PCR檢測(cè)后選取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

將上述克隆得到的基因保守區(qū)、3′端和5′端片段進(jìn)行拼接，獲得完整的DNA 序列。通過(guò)NCBI（ORF Finder）分析，獲得基因ORF全長(zhǎng)序列。設(shè)計(jì)ORF 全長(zhǎng)引物（CSP-S/CSP-A）（見表1），以海洋微生物宏基因組DNA 為模板，PCR獲得該基因ORF 序列，回收PCR 產(chǎn)物，連接到pMD18-T 載體上，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒，PCR檢測(cè)后選取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

1.3 MbCSP基因編碼區(qū)的生物信息學(xué)分析

根據(jù)基因的開放閱讀框，采用Gene Tool 軟件，推測(cè)其氨基酸序列。采用在線軟件ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）進(jìn) 行蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè)分析。采用NCBI Blastp查找與MbCSP 同源性較高的氨基酸序列。采用ClustalW與其它來(lái)源的CSP 家族基因進(jìn)行氨基酸序列同源性比對(duì)分析。采用MEGA 6.0 軟件運(yùn)用Neighbor-Joining算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 花序浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥

1.4.1 表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得

提取pMD18T-質(zhì)粒和雙元表達(dá)載體pTF101質(zhì)粒，分別用Ⅰ和Ⅰ對(duì)其進(jìn)行雙酶切并回收，采用T4 連接酶連接pTF101 大片段和，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，經(jīng)質(zhì)粒PCR 和Ⅰ、Ⅰ雙酶切檢測(cè)后篩出陽(yáng)性克隆，獲得植物表達(dá)載體pTF101-。采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥。

1.4.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥的分子檢測(cè)

將收獲的T1代種子均勻地播種于方形盆中，待擬南芥長(zhǎng)至兩片真葉時(shí)噴灑質(zhì)量濃度為40 mg·L的Basta 溶液，每2～3 d 噴灑1 次，噴灑3～4 次后即可篩選出陽(yáng)性植株。繼續(xù)培養(yǎng)至植株長(zhǎng)到6 片葉子時(shí)，剪取0.1 g 葉片采用植物基因組提取試劑盒（TIANGEN，北京）提取DNA。利用基因上的正向引物CSP-S 以及載體上的反向引物XHNR（見表1）進(jìn)行PCR 檢測(cè)進(jìn)一步確定轉(zhuǎn)基因植株。采用RNAisoPlus 試劑提取玉米葉片總RNA，根據(jù)大連寶生物公司PrimerScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，以actin-F 和actin-R 為內(nèi)參基因引物，CSP-S 和CSP-A為目的基因引物（見表1）進(jìn)行半定量RT-PCR 檢測(cè)。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，28 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

1.5 轉(zhuǎn)MbCSP 基因擬南芥在干旱和低溫脅迫下的生理檢測(cè)

將收獲的T2 代種子均勻地播種于方形盆中，待擬南芥長(zhǎng)至兩片真葉時(shí)噴灑Basta 溶液，將篩選出的轉(zhuǎn)基因植株移栽到方形盆中，每個(gè)方形盆內(nèi)栽種兩棵，待生長(zhǎng)5周后用于生理檢測(cè)。對(duì)照野生型擬南芥按照上述相同方式培養(yǎng)，不噴灑Basta 溶液。選取生長(zhǎng)狀況一致的轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥進(jìn)行生理檢測(cè)。第一組擬南芥進(jìn)行干旱脅迫（前期澆足水，后期不再澆水），第二組擬南芥進(jìn)行低溫（5 ℃）脅迫，兩組均在第0、3、6、9 和12 d 取樣進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù)，3 次技術(shù)重復(fù)，以減小實(shí)驗(yàn)誤差對(duì)結(jié)果的影響。

1.5.1 生物量的測(cè)量

取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各3株完整的擬南芥，洗凈后放入烘箱中105 ℃殺青30 min，然后調(diào)至80 ℃烘干至恒質(zhì)量，記錄干質(zhì)量（g），求出平均值。

1.5.2 葉片相對(duì)含水量（RWC）的測(cè)定

分別在轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥的相同部位取適量的葉片，并測(cè)量其鮮質(zhì)量（）。將擬南芥葉片浸入蒸餾水中8 h，使組織充分吸水達(dá)到飽和。將葉片從蒸餾水中取出，用濾紙迅速吸去葉片表面水分，稱取其飽和鮮質(zhì)量（）。再將葉片放入培養(yǎng)皿中，80 ℃下烘干至恒質(zhì)量，稱取干質(zhì)量（）。計(jì)算相對(duì)含水量：

1.5.3 葉綠素含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量的測(cè)定

分別在轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥相同部位稱取葉片（測(cè)定MDA 稱取去掉葉脈的葉片）0.2 g，參照《植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)》中的方法對(duì)葉綠素、SOD和MDA含量進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 海洋微生物MbCSP基因編碼區(qū)的獲得

以海洋微生物宏基因組DNA 為模板，利用簡(jiǎn)并引物CSPU5 和CSPU3，經(jīng)PCR 獲得約200 bp 的部分編碼區(qū)片段（見圖1A），回收純化目的片段并測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)做Blastn比對(duì)，結(jié)果顯示：該序列與（）基因序列的同源性為90%，初步推斷此DNA 片段是海洋微生物宏基因組冷休克蛋白基因編碼區(qū)的部分序列。通過(guò)3′錨定PCR 方法獲得3′端片段（見圖1B），回收約850 bp 的條帶并測(cè)序。通過(guò)5′錨定PCR 方法獲得5′端片段（見圖1C），回收約800 bp的條帶并測(cè)序。拼接獲得的三段序列，通過(guò)NCBI ORF Finder 軟件得到5 個(gè)可能的ORF，通過(guò)與已知序列的比對(duì)，找到目的編碼區(qū)，獲得基因編碼區(qū)序列216 bp。設(shè)計(jì)ORF 全長(zhǎng)引物，以海洋微生物宏基因組DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到216 bp 的片段（見圖1D），回收PCR 產(chǎn)物連接T 載后并測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明此全長(zhǎng)序列與拼接序列完全相同。

圖1 海洋微生物宏基因組MbCSP基因電泳圖A.部分編碼區(qū)PCR 擴(kuò)增；B.3′錨定PCR；C.5′錨定PCR；D.ORF PCR 擴(kuò)增；M.DL2000 DNA Marker；1～2.部分編碼區(qū)PCR 產(chǎn)物；3.3′錨定PCR產(chǎn)物；4.5′錨定PCR產(chǎn)物；5～6.ORF PCR產(chǎn)物Fig.1 Electrophoresis of marine microbial metagenomic MbCSPA.PCR amplification of partial coding region；B.3′anchor PCR；C.5′anchor PCR；D.PCR amplification of ORF；M.DL2000 DNA Marker；1-2.PCR product of partial coding region；3. 3′anchored PCR prod‐uct；4.5′anchored PCR product；5-6.ORF PCR product

2.2 海洋微生物MbCSP基因序列的生物信息學(xué)分析

采用Gene Tool 軟件推測(cè)出MbCSP 氨基酸序列，其編碼一個(gè)由71 個(gè)氨基酸構(gòu)成的蛋白。采用Prot Param 預(yù)測(cè)MbCSP 蛋白的基本生理和生化特征，該蛋白的分子式為CHNOS，相對(duì)分子量為17.81 kDa，等電點(diǎn)（pI）為5.34。采用NCBIBlastp 查找MbCSP 氨基酸同源序列，采用ClustalW進(jìn)行多重序列比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MbCSP 蛋白包含RNP1（KGFGFI）和RNP2（VFVHF）等保守結(jié)構(gòu)域（見圖2）；該氨基酸序列與EcCSPG、EcCSPA（大腸桿菌），BsCspB（枯草芽孢桿菌）和BcCspA（蠟樣芽孢桿菌）等冷休克蛋白氨基酸序列同源性分別為90%、78%、64%、和60%。采用MEGA6.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，結(jié)果表明其與EcCspG（大腸桿菌）和CmCspG、CmCspB（堆肥宏基因組）等生物的冷休克蛋白親緣關(guān)系較近（見圖3）。已將該基因提交至Genbank，基因號(hào)為MW202239。

圖2 MbCSP蛋白的多重序列比對(duì)黑框標(biāo)示為RNP1和RNP2所在位置Fig.2 Multiple sequence alignment of MbCSP proteinThe black box indicates the location of RNP1 and RNP2

圖3 MbCSP蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of MbCSP protein

2.3 轉(zhuǎn)MbCSP 基因擬南芥的篩選和鑒定

經(jīng)過(guò)花序浸染法轉(zhuǎn)化和Basta篩選獲得4株擬南芥轉(zhuǎn)化苗。待植株長(zhǎng)至六片葉子時(shí)，以葉片DNA 為模板進(jìn)行PCR 檢測(cè)，均出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的目的片段，說(shuō)明基因已成功整合到擬南芥的基因組中（見圖4A）。半定量RT-PCR 分析結(jié)果表明，4 個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中的外源基因在轉(zhuǎn)錄水平上均表達(dá)，選擇表達(dá)量最高的L2 株系進(jìn)行后續(xù)生理檢測(cè)（見圖4B）。

圖4 轉(zhuǎn)MbCSP基因擬南芥的分子檢測(cè)A.PCR 檢測(cè)；B.半定量RT-PCR 檢測(cè)；M.DL2000 Marker；1.ddH2O；2.野生型；3～6，L1～L4.轉(zhuǎn)基因植株Fig.4 Molecular detection of transgenic Arabidopsis plants containing MbCSPA.PCR detection；B.Semi-quantitative RT-PCR detection；M.DL2000 Marker；1.ddH2O；2.Wild-type；3-6，L1-L4.Transgenic plants

2.4 過(guò)表達(dá)提高轉(zhuǎn)MbCSP基因擬南芥的抗旱性

選用生長(zhǎng)狀態(tài)一致的野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行干旱脅迫。結(jié)果表明：干旱處理前野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥生長(zhǎng)狀態(tài)正常，葉片飽滿且舒展（見圖5A）；干旱處理12 d 后，野生型擬南芥葉片出現(xiàn)明顯的萎蔫、干枯、顏色變深和莖無(wú)法直立，而轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片雖有失水現(xiàn)象，葉片顏色變深，但葉片仍能保持舒展（見圖5B）。干旱處理12 d 后，野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥的干質(zhì)量分別為23.2±10.3 和32.4±6.7 mg，轉(zhuǎn)基因擬南芥比野生型植株的干質(zhì)量高出39.66%。

圖5 干旱脅迫處理前和12 d后野生型以及轉(zhuǎn)MbCSP基因擬南芥的表型A.干旱處理前；B.干旱處理12 d后Fig.5 Phenotypes of wild-type and transgenic Arabidopsis plant containing MbCSP before and after12 d drought stress treatmentA.Before drought stress treatment；B.After 12 d drought stress treatment

在正常生長(zhǎng)條件下，野生型擬南芥與轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉片相對(duì)含水量差異不顯著，分別為87.47%和83.03%；經(jīng)過(guò)12 d的干旱脅迫，野生型擬南芥的葉片相對(duì)含水量驟降至27.65%，而轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉片相對(duì)含水量是野生型的2.62倍（見圖6A）。

干旱脅迫前，轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型擬南芥葉片中的葉綠素含量差異不顯著；在干旱處理第3、6、9 和12 d，轉(zhuǎn)基因擬南芥中葉綠素含量均顯著高于野生型，分別是野生型的1.20、1.12、1.31 和1.30 倍（見圖6B）。在正常生長(zhǎng)條件下，野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片中的MDA 含量均較低，且二者無(wú)顯著差異；干旱9 d 后，野生型擬南芥中MDA 含量急速上升。干旱12 d 后，轉(zhuǎn)基因擬南芥的MDA含量顯著低于野生型（見圖6C）。SOD活性隨著干旱脅迫的進(jìn)行呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在干旱第6d 時(shí)達(dá)到最高，轉(zhuǎn)基因植株的SOD 活性始終高于野生型植株（見圖6D）。

圖6 干旱脅迫下野生型和轉(zhuǎn)MbCSP基因擬南芥的生理指標(biāo)“*”代表在P＜0.05時(shí)差異顯著，下同F(xiàn)ig.6 Physiological indexes of wild-type and transgenic Arabidopsis plant containing MbCSP under drought stress“*”represents a significant difference at the 0.05 level，the same as below

2.5 過(guò)表達(dá)提高轉(zhuǎn)MbCSP基因擬南芥的耐寒性

低溫處理前，轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥生長(zhǎng)狀況良好且狀態(tài)基本一致（見圖7A）；在經(jīng)過(guò)12 d的低溫處理后，野生型擬南芥葉片出現(xiàn)萎蔫，葉片顏色變深，而轉(zhuǎn)基因擬南芥仍能正常生長(zhǎng)（見圖7B）。低溫處理后野生型擬南芥的整株干質(zhì)量為28.9±8.7 mg，轉(zhuǎn)基因擬南芥的整株干質(zhì)量為49.3±15.0 mg；轉(zhuǎn)基因擬南芥比野生型擬南芥的生物量高出了70.59%。

圖7 低溫脅迫處理前和12d后野生型以及轉(zhuǎn)MbCSP基因擬南芥的表型A.干旱處理前；B：干旱處理12 d后Fig.7 Phenotypes of wild-type and transgenic Arabidopsis plant containing MbCSP before and after 12 d low temperature stress teratmentA.Before drought stress treatment；B.After 12 d drought stress treatment

正常生長(zhǎng)時(shí)，野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉片相對(duì)含水量約為88%；低溫脅迫12 d 后，轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥的葉片相對(duì)含水量都有所下降，最終分別為74%和64%，且二者差異顯著（見圖8A）。低溫脅迫前，轉(zhuǎn)基因與野生型擬南芥葉片中的葉綠素含量沒(méi)有顯著性差異；在低溫脅迫過(guò)程中，轉(zhuǎn)基因與野生型擬南芥中葉綠素含量均在逐漸下降，在低溫脅迫9 d 后，轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉綠素含量顯著高于野生型（見圖8B）。在低溫處理前6 d，轉(zhuǎn)基因擬南芥中的MDA 含量無(wú)明顯變化，而野生型的MDA 含量明顯升高。隨著低溫處理天數(shù)的不斷增加，擬南芥葉片中的MDA 含量不斷上升，低溫處理12 d 時(shí)，轉(zhuǎn)基因擬南芥中的MDA 含量顯著低于野生型（見圖8C）。正常生長(zhǎng)條件下，野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥中SOD 活性基本一致；隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥中SOD 活性都在上升，低溫脅迫12 d 時(shí)轉(zhuǎn)基因擬南芥的SOD活性顯著高于野生型（見圖8D）。

圖8 低溫脅迫下野生型和轉(zhuǎn)MbCSP基因擬南芥的生理指標(biāo)Fig.8 Physiological indexes of wild-type and transgenic Arabidopsis containing MbCSP under low temperature stress

3 討論

干旱和低溫嚴(yán)重影響農(nóng)作物的生長(zhǎng)和產(chǎn)量，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高農(nóng)作物的抗逆性是解決此問(wèn)題的主要途徑之一。一些研究表明過(guò)表達(dá)基因可以提高轉(zhuǎn)基因作物的抗旱或耐寒性，但大部分基因是從已知微生物或植物中獲得。不同來(lái)源的基因功能可能存在差異，而99%的海洋微生物不可培養(yǎng)，因此我們嘗試從海洋微生物宏基因組中克隆基因并進(jìn)行功能分析。

本研究采用錨定PCR 技術(shù)從海洋微生物宏基因組DNA 中克隆獲得了基因，對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析：MbCSP 蛋白包含RNP1（KGFG‐FI）和RNP2（VFVHF）等CSP 蛋白經(jīng)典的保守結(jié)構(gòu)域；與已報(bào)導(dǎo)的大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌的冷休克蛋白氨基酸序列的同源性在60%～90%，表明為冷休克蛋白基因。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸染法將基因轉(zhuǎn)入擬南芥中，分子檢測(cè)和Basta 篩選結(jié)果表明外源基因和標(biāo)記基因均已成功轉(zhuǎn)入擬南芥中，且在轉(zhuǎn)錄水平上可以表達(dá)，選擇表達(dá)量最高的陽(yáng)性株系進(jìn)行后續(xù)干旱和低溫脅迫下的生理檢測(cè)。

干旱脅迫處理12 d 后進(jìn)行觀察和檢測(cè)：轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉片仍能保持舒展，而野生型擬南芥葉片出現(xiàn)明顯的萎蔫、干枯；轉(zhuǎn)基因擬南芥的生物量比野生型植株高出39.66%，葉片相對(duì)含水量是野生型的2.62 倍；葉綠素含量顯著高于野生型，MDA含量顯著低于野生型。上述結(jié)果表明過(guò)表達(dá)基因提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱能力，這與Castiglioni 等、徐萍莉等、Yu 等和孫雪慧等研究結(jié)果一致。低溫脅迫處理12 d 后進(jìn)行觀察和檢測(cè)：轉(zhuǎn)基因擬南芥仍能正常生長(zhǎng)，而野生型擬南芥葉片出現(xiàn)萎蔫；轉(zhuǎn)基因擬南芥的生物量比野生型植株高出70.59%；轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉片相對(duì)含水量、葉綠素含量和SOD 活性均顯著高于野生型，MDA 含量顯著低于野生型。上述結(jié)果表明過(guò)表達(dá)基因提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐寒能力，這與王紅蕾等研究結(jié)果一致。

綜上所述，目前多數(shù)研究結(jié)果僅表明過(guò)表達(dá)基因可以提高抗旱或耐寒能力，而本研究從海洋微生物宏基因組DNA 中克隆獲得基因并轉(zhuǎn)入擬南芥中，結(jié)果表明過(guò)表達(dá)基因可以同時(shí)提高植株的抗旱和耐寒能力，未來(lái)可以將該基因轉(zhuǎn)入玉米和大豆等農(nóng)作物中培育抗逆新品種。