金塔柏扦插不定根形成與內(nèi)源激素的調(diào)控研究

劉國彬 廖 婷 王 燁 郭麗琴 趙今哲 姚硯武 曹 均

（北京市林業(yè)果樹科學(xué)研究院，北京 100093）

植物激素是植物體通過自身代謝產(chǎn)生的極其微量的、能夠產(chǎn)生明顯生理效應(yīng)的信號分子，對植物的生長發(fā)育起至關(guān)重要的作用，它可以在合成部位起作用，也可以通過運輸在其他組織中發(fā)揮作用。內(nèi)源激素參與調(diào)控植物根系發(fā)育的各個方面，包括愈傷組織形成、器官發(fā)生、根的伸長、側(cè)根的發(fā)生等，是控制不定根再生的重要因素。生長素是不定根再生的核心激素，阻斷生長素合成、極性運輸或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)則會阻斷整個再生過程。在杜鵑屬（）扦插生根過程中，生長素作用最為明顯，較高濃度的生長素（Indole-3 acetic acid，IAA）利于根原基分化形成和生根。茉莉酸（Jasmonic，JA）能夠與組蛋白甲基化修飾協(xié)同開啟傷口信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以促進離體器官生長素合成，進而促進不定根再生。脫落酸（Ab‐scisic acid，ABA）可以調(diào)節(jié)插穗內(nèi)水解酶和養(yǎng)分的動態(tài)變化促進根原基形成。麻文俊等對日本落葉松（）扦插生根期內(nèi)源激素動態(tài)變化的研究表明，隨著扦插時間的延長，插穗內(nèi)玉米素（Zeatin，ZT）含量呈下降趨勢，在扦插后30和60 d較易生根無性系的內(nèi)源ZT含量低于難生根無性系，這個兩個時期正是不定根發(fā)生期和生根高峰期，表明ZT在日本落葉松不定根再生過程中起重要作用。

金塔柏（‘Beverleyensis’）屬 于 柏 科（Cupressaceae）側(cè) 柏 屬（）側(cè)柏（）的一個變種，因其葉色在春秋呈金黃色而極具觀賞價值，是常綠針葉樹種中的一個獨特彩葉類型。我國特有的柏科彩葉種質(zhì)資源極為稀缺，收集、保存、培育易繁殖、生態(tài)抗逆效果好的彩色針葉種質(zhì)資源對于豐富我國園林綠化樹種多樣性具有重要意義。自1980年以來，本課題組即開始柏科植物良種選育工作，挖掘出了大量性狀優(yōu)異、具有園林綠化價值的優(yōu)良類型，并于上世紀(jì)末收集、繁育多個金塔柏實生群體，在連續(xù)20余年的觀測和示范中，選育出了多個抗寒抗旱、葉色穩(wěn)定的金塔柏優(yōu)株。目前，迫切需要進一步開展無性系育種工作，以促進彩色針葉種質(zhì)資源的推廣應(yīng)用。

組培、嫁接和扦插是無性繁殖的主要技術(shù)，是植物細(xì)胞全能性和再生機制的應(yīng)用與體現(xiàn)。但側(cè)柏組培體系不健全、嫁接繁殖系數(shù)低，而扦插是規(guī)模化快繁較優(yōu)的技術(shù)，通過扦插獲得的單株能夠穩(wěn)定遺傳母本優(yōu)良遺傳特性，是目前開展植物無性系育種的主要技術(shù)。人工誘導(dǎo)側(cè)柏扦插生根技術(shù)及生理生化機制的研究較少，但也取得了一定進展，如梁榮納和沈熙環(huán)分析了不同側(cè)柏種源扦插繁殖時在生根特性上的地理變異規(guī)律，趙今哲等研究了生長調(diào)節(jié)劑對金塔柏插穗扦插的影響并觀察了不定根發(fā)育過程中插穗外部形態(tài)及組織結(jié)構(gòu)變化，杜常健等比較分析了側(cè)柏古樹實生樹和嫁接樹的插穗中內(nèi)源激素、非結(jié)構(gòu)碳水化合物、木質(zhì)化程度和形態(tài)解剖學(xué)的區(qū)別，魏黔春等研究了不同類型植物生長調(diào)節(jié)劑、不同濃度處理對側(cè)柏古樹扦插生根的影響，但均缺乏對不定根形成過程及內(nèi)源激素動態(tài)變化的系統(tǒng)研究。

本文在課題組前期研究基礎(chǔ)上，通過連續(xù)組織切片技術(shù)系統(tǒng)研究不定根的發(fā)生模式和組織學(xué)起源，通過分析插穗內(nèi)源激素的動態(tài)變化并探討金塔柏不定根發(fā)生模式和不同內(nèi)源激素對金塔柏扦插生根的影響，旨在為彩色針葉植物扦插不定根發(fā)生發(fā)育機制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為20 年生金塔柏和‘蝶葉’側(cè)柏（‘Dieye’）中上部的一年生半木質(zhì)化枝條，分別于2017年7月上旬、2018年6月下旬采集于北京市林業(yè)果樹科學(xué)研究院彩色針葉樹種采穗圃。生根促進劑為自配試劑，有效成分為400 mg·L吲哚丁酸（Indole-3 butyric acid，IBA）。

1.2 扦插方法

6 月底7 月初從樹體中上部剪取一年生半木質(zhì)化枝條，修剪成長12～15 cm、粗2.5～3.5 mm 的插穗，每根插穗上部留1/2 針葉帶葉扦插。將修剪好的插穗每30 根一捆，在自配生根促進劑中浸泡插穗基部4 h，然后將處理后的插穗垂直插入日光溫室內(nèi)的扦插床中（基質(zhì)為河沙，扦插前用0.25%高錳酸鉀消毒），扦插深度為插穗長度的1/2，每行30根，株行距為5 cm×5 cm，共計900根，450根/品種，3 次重復(fù)。扦插完成后，LK-400 24 h 自動噴霧系統(tǒng)控制插床內(nèi)溫濕度。

1.3 試驗方法

1.3.1 組織結(jié)構(gòu)觀察

自扦插當(dāng)天（0 d）開始，每隔5 d采集金塔柏插穗基部莖段，直至起苗，共計20 次，每次采集插穗3～5 根，其中在形態(tài)變化的關(guān)鍵時期增加取樣量。取樣時截取插穗基部2 cm 左右莖段，F(xiàn)AA（Formal‐dehyde-acetic acid-ethanol）固定，改良石蠟切片法制片及顯微觀察。

1.3.2 內(nèi)源激素提取

根據(jù)課題組前期形態(tài)學(xué)和組織結(jié)構(gòu)觀察及不定 根 發(fā) 生 階 段 的 劃 分，采 集IBA 處 理 后1 d（Stage1）、35 d（Stage 2，愈傷組織形成）、50 d（Stage 3，不定根起始）、60 d（Stage 4，不定根表達(dá)）、70 d（Stage 5，不定根伸長）的金塔柏和‘蝶葉’側(cè)柏插穗基部或根樣品（見圖1：A～E），放入液氮中進行冷凍，然后存于-80 ℃超低溫冰箱保存，以備提取內(nèi)源激素。采集插穗基部2 cm 區(qū)段的莖段，液氮速凍，然后凍存于-80 ℃超低溫冰箱，用于IAA、ABA、ZT、GA和JA的測定。

從超低溫冰箱中取出插穗樣品，加入500 μL提取液（（異丙醇）∶（水）∶（鹽酸）=2∶1∶0.002），經(jīng)研磨機勻漿后于-20 ℃靜置20 min，冰浴中超聲提取30 min；然后加入1 mL 氯仿，經(jīng)-20 ℃靜置，冰浴中超聲，渦旋振蕩，13 000 r·min離心后分兩次提取，合并提取液并揮干；最后利用100μL甲醇復(fù)溶，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 內(nèi)源激素含量測定

質(zhì)譜條件：采用UPLC-ESI-MS/MS 法對插穗莖段中5 種植物激素進行定性定量檢測。采用電噴霧離子源（ESI），正離子模式檢測IAA、ZT，負(fù)離子模式檢測ABA、GA和JA，檢測方式為正負(fù)離子多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。質(zhì)譜分析條件如下：Capillary voltage：2.5 kV（-）；Cone voltage：30 V；Collision：15 V；Source Offset voltage：50 V；Desolvation tempera‐ture：500 ℃；Desolvation Gas Flow：800 L·h；Cone Gas Flow：150 L·h；Collision Gas Flow：0.17 mL·min。

計算機網(wǎng)絡(luò)在當(dāng)前信息社會中所扮演的角色非常重要，如今，已經(jīng)被運用到了社會的各個領(lǐng)域，網(wǎng)絡(luò)信息化也是農(nóng)機安全監(jiān)理工作的重要組成部分。像農(nóng)機監(jiān)理辦證局域網(wǎng)、服務(wù)器、程序運行以及數(shù)據(jù)存儲等都需要網(wǎng)絡(luò)的支持，運用網(wǎng)絡(luò)信息技術(shù)，農(nóng)機監(jiān)理工作很好的實現(xiàn)了數(shù)據(jù)集中管理，提升了農(nóng)機監(jiān)理辦證業(yè)務(wù)的效率。除此之外，農(nóng)機監(jiān)理部門還要將與監(jiān)理相關(guān)的法律法規(guī)、規(guī)章制度、培訓(xùn)內(nèi)容以及事故處理等放在農(nóng)機平臺上。這樣，農(nóng)機使用者就可以直接在平臺上下載自己所需的內(nèi)容。

色譜條件：柱溫40 ℃，進樣體積2μL；流動相A（0.1%甲酸—水溶液），流動相B（0.1%甲酸—甲醇）。洗脫程序：0～5 min，5% B；5.0～6.6 min，70%B，6.6～9.6 min，98%B，9.6～12.0 min，5%B。

根據(jù)植物激素標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間和質(zhì)譜定性離子對樣品中的植物激素定性，外標(biāo)曲線計算植物激素的含量。測定激素峰面積，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，計算各激素含量。為保證測定激素的穩(wěn)定性，在實驗過程中全程保持低溫，在提取及進樣過程中采用棕色進樣瓶避免光影響。實驗設(shè)3次重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實驗所得數(shù)據(jù)利用Excel 2020軟件處理，采用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不定根的發(fā)生與發(fā)育

金塔柏插穗經(jīng)人工誘導(dǎo)扦插后，不定根主要從愈傷組織和皮部兩個部位伸出，形態(tài)上屬于愈傷生根、皮部生根和混合生根3種生根類型（見圖1：F～H）。

圖1 金塔柏扦插不定根的發(fā)育時期及三種類型A～E 分別是金塔柏插穗經(jīng)IBA 誘導(dǎo)后1 d（stage 1）、35 d（stage 2）、50 d（stage 3）、60 d（stage 4）、70 d（stage 5）；F～H 分別為混合生根、愈傷生根及皮部生根Fig.1 Development stages and rooting types of shoot cuttingsA-E are 1（stage 1），35（stage 2），50（stage 3），60（stage 4），70（stage 5）days after cutting，respectively；F-H are callus and bark rooting，callus rooting and bark rooting

連續(xù)組織切片發(fā)現(xiàn)，金塔柏插穗組織結(jié)構(gòu)主要由髓、木質(zhì)部、維管形成層、韌皮部、皮層、表皮等組成（見圖2，0 d）。扦插后20 d，皮層薄壁細(xì)胞逐漸變大增厚，向外分化形成細(xì)胞較大、排列疏松的愈傷組織，外觀上表現(xiàn)為插穗基部膨大或在切口部位出現(xiàn)白色愈傷組織；同時，在次生韌皮部和皮層中發(fā)現(xiàn)不定根原基（見圖2，20 d）。35 d后，愈傷組織進一步增多，其內(nèi)部的薄壁細(xì)胞獨立分化形成不定根原基（見圖2，35 d）。隨著扦插的進程，木射線原始細(xì)胞分化產(chǎn)生木質(zhì)部的各類細(xì)胞，在此過程中，有的區(qū)域分化緩慢，尤其在初生木質(zhì)部與次生木質(zhì)部結(jié)合部位，會形成一團由未分化成熟的木質(zhì)部細(xì)胞組成的分生細(xì)胞團，具有較強的分生能力，不斷向形成層方向反分化形成不定根原基（見圖2，45 d）。扦插后50 d，隨著愈傷組織的不斷增殖，其內(nèi)部不斷獨立分化出圓團狀的不定根原基（見圖2，50 d）。

扦插后60 d，觀察到源自髓射線的不定根原基穿過木質(zhì)部、韌皮部進入皮層，即將突破皮層形成不定根；同時，該時期也發(fā)現(xiàn)在初生木質(zhì)部與次生木質(zhì)部結(jié)合處分化緩慢的分生細(xì)胞團在合適條件下不斷反分化形成不定根原基（見圖2，60 d）。扦插后70 d，在愈傷組織中觀察到大量不定根原基（見圖2，70 d）。扦插后75 d，不定根原基穿過皮層或愈傷組織伸出體外，形成不定根（見圖2，75 d）。不定根原基的形成貫穿不定根發(fā)生發(fā)育的整個過程，在不定根伸長的過程中，在插穗組織內(nèi)仍發(fā)現(xiàn)不定根原基的形成與發(fā)育。在扦插后80～90 d，在皮層、髓射線與形成層交界處、木質(zhì)部靠近形成層一側(cè)發(fā)現(xiàn)發(fā)育中的不定根原基，部分根原基成帽子結(jié)構(gòu)向外分化發(fā)育（見圖2，80 d）。自扦插后70～90 d，進入不定根伸長期，同時伴隨著不定根原基的形成與不定根發(fā)生（見圖2，90 d）。

圖2 人工誘導(dǎo)金塔柏扦插生根過程中的組織結(jié)構(gòu)變化Xy.木質(zhì)部；Vc.維管形成層；Ph.韌皮部；Co.皮層；Ep.表皮；Rp.根原基；Ca.愈傷組織；Pi.髓；Pr.髓射線；Ar.不定根；Rc.根冠；0 d.插穗基本結(jié)構(gòu)（10×）；20 d.韌皮部與皮層中產(chǎn)生根原基（20×）；35 d.愈傷組織中產(chǎn)生根原基（20×）；45 d.木射線細(xì)胞分化形成根原基（20×）；50 d：愈傷組織內(nèi)部不斷獨立分化形成根原基（20×）；60 d.來自髓射線的不定根原基進入皮層，同時在木質(zhì)部伴隨不定根原基的產(chǎn)生（20×）；70 d.愈傷組織中產(chǎn)生大量不定根原基（10×）；75 d.不定根伸出體外（4×）；80 d.皮層和髓射線與形成層交叉處不定根原基正在發(fā)育（10×）；90 d.不定根原基形成與發(fā)育，不定根形成同時存在（4×）；120 d-A.不定根原基在形成層產(chǎn)生（20×）；120 d-B.不定根原基突破皮層（10×）；120 d-C.愈傷組織中產(chǎn)生的不定根原基（20×）；120 d-D.不定根突破愈傷組織伸出（4×）；120 d-E.伸出中的不定根（4×）；120 d-F.伸長中的不定根（4×）Fig.2 Tissue structure changes of cuttings during root formationXy.Xylem；Vc.Vascular cambium；Ph.Phloem；Co.Cortex；Ep.Epidermis；Rp.Root primordium；Ca.Callus；Pi.Pith；Pr-Pith ray；Ar.Adventitious root；Rc.Root cap；0 d.The structure of the cutting（10×）；20 d.Root primordiums originated from phloem and cortex（20×）；35 d.Root primordiums origi‐nated from callu（s20×）；45 d.Root primordiums originated from xylem ray cell（s20×）；50 d.Root primordiums continue to differentiate and form in callu（s20×）；60 d.Root primordiums which originated from pith ray is coming into cortex，with the formation of root primordiums in xylem（20×）；70 d.More and more root primordiums formed in callu（s10×）；75 d.Adventitious roots stick ou（t4×）；80 d.Root primordiums originated from cortex and the junction of pith ray and cortex（10×）；90 d.Root primordia and adventitious root formation coexisting in late cutting（4×）；120 d-A.Root pri‐mordiums originated from vascular cambium（20×）；120 d-B.Root primordiums breaks through the cortex to form adventitious root（s10×）；120 d-C.More root primordiums originated from callu（s20×）；120 d-D.Root primordiums breaks through the callus to form adventitious root（s4×）；120 d-E.The adventitious roots are forming（4×）；120 d-F.The adventitious roots start to grow（4×）

2.2 不定根發(fā)生過程中內(nèi)源激素含量的變化

2.2.1 扦插生根特性

研究發(fā)現(xiàn)，在相同的IBA 處理下，金塔柏和‘蝶葉’側(cè)柏不定根發(fā)生進程較為一致，扦插后35 d 愈傷組織開始形成，50 d 后肉眼可見米粒狀突起，60 d 后開始形成不定根，70 d 后不定根開始伸長。120 d 時生根調(diào)查顯示金塔柏生根率為51.11%，不定根條數(shù)為2～9 條，平均4.4 條；根長范圍為6.1～13.2 cm，平均8.71 cm（見表1）。‘蝶葉’側(cè)柏生根進程與金塔柏較為一致，調(diào)查顯示其生根率為33.33%，不定根條數(shù)為2～4 條，平均2.8 條，平均根長7.99 cm（見表1）。金塔柏對照（CK）生根進程極為緩慢，扦插后50 d 偶見愈傷組織形成，多數(shù)插穗死亡，少量處于休眠狀態(tài)，120 d 調(diào)查發(fā)現(xiàn)生根率為3.33%，不定根條數(shù)1～3 條，平均2 條，平均根長6.05 cm（見表1）。經(jīng)IBA 誘導(dǎo)處理的所有指標(biāo)都優(yōu)于對照，且不同個體間存在差異。

表1 金塔柏生根特性Table 1 Rooting characteristics of P. orientalis‘Bever‐leyensis’

2.2.2 內(nèi)源激素的動態(tài)變化

金塔柏與‘蝶葉’側(cè)柏插穗不定根發(fā)生過程中內(nèi)源激素的動態(tài)變化如圖3 所示。本實驗在插穗中檢測到的激素為IAA、ABA、ZT 和JA，GA未檢測到。

金塔柏插穗內(nèi)源IAA含量在不定根形成過程中呈現(xiàn)持續(xù)降低趨勢，后期略有升高（見圖3A）。IBA誘導(dǎo)處理后1 d，內(nèi)源IAA含量最高（24.5 ng·g），隨后急劇下降，從扦插前的24.5 降至4.2 ng·g，降低了82.86%，此時愈傷組織開始形成，在部分插穗中觀察到根原基的發(fā)生；從誘導(dǎo)期（stage 2）至不定根起始期（stage 3），再至不定根表達(dá)（stage 3），內(nèi)源IAA 含量仍呈下降趨勢，但變化趨勢平緩，從4.2 ng·g降 至3.0 ng·g，再 降 至2.6 ng·g，降 低 了38.10%；從不定根伸長階段（stage 5）開始，內(nèi)源IAA 含量逐漸回升?！~’側(cè)柏中IAA 含量在5 個階段的變化趨勢與金塔柏相似，但I(xiàn)AA 水平略低。分析認(rèn)為在不定根發(fā)生過程中，愈傷組織的形成和不定根原基的誘導(dǎo)、不定根的起始與表達(dá)過程是消耗IAA 的過程，尤其愈傷組織的形成與根原基的誘導(dǎo)會消耗大量內(nèi)源IAA，從而導(dǎo)致內(nèi)源IAA急劇降低；而隨著愈傷組織和根原基的形成與發(fā)育，插穗進入自我發(fā)育階段，在消耗IAA 的同時也開始自我合成新的IAA，但I(xiàn)AA的消耗與合成相一致，從而使總IAA 維持在平穩(wěn)水平；而隨著不定根進入伸長生長階段，插穗自我合成IAA 能力得以加強。

圖3 金塔柏莖段不同發(fā)育期4 種內(nèi)源激素含量的動態(tài)變化（n=3）Stage-1.扦插后1 d；Stage-2.扦插后35 d；Stage-3.扦插后50 d；Stage-4.扦插后60 d；Stage-5.扦插后70 d；下同F(xiàn)ig.3 Dynamic changes of endogenous hormones in cut?ting（sn=3）Stage-1. 1 d after cutting；Stage-2. 35 d after cutting；Stage-3. 50 d after cutting；Stage-4. 60 d after cutting；Stage-5. 70 d after cutting；the same as below

金塔柏插穗內(nèi)源ABA含量呈現(xiàn)先上升后持續(xù)降低至平穩(wěn)的趨勢（見圖3B）。扦插后，經(jīng)過35 d的誘導(dǎo)，內(nèi)源ABA 含量迅速積累，由0 d 的179.1 ng·g快速升高至376.8 ng·g，峰值出現(xiàn)在愈傷組織形成期；之后，隨著不定根原基的形成與發(fā)育，ABA 含量急劇降低（99.9 ng·g），而隨著不定根的表達(dá)與伸長，ABA 含量變化趨緩。而‘蝶葉’側(cè)柏ABA 含量整體水平低于金塔柏，但變化趨勢相同。分析認(rèn)為插穗損傷后促進ABA 的快速積累，至愈傷組織形成達(dá)到高峰，隨著根原基的形成及不定根的發(fā)育，ABA 的積累下降與消耗上升并存，從而維持在低水平，表明愈傷組織的形成過程是ABA的積累過程，而低水平的ABA 利于不定根形成與表達(dá)。

金塔柏內(nèi)源ZT 在生根過程中表現(xiàn)為先下降后升高的變化趨勢（見圖3C）。其中扦插后1 d 插穗內(nèi)ZT 含量最高（0.026 ng·g），隨后急劇下降，在愈傷組織形成期（stage 2）達(dá)到最低水平（0.001 ng·g），表明愈傷組織的形成是一個內(nèi)源ZT 大量消耗的過程；自愈傷組織形成后，根原基開始形成，插穗恢復(fù)合成ZT 的能力，但由于扦插后期愈傷形成與不定根發(fā)生并存，因此ZT 的合成與消耗同時存在，但合成逐漸高于消耗，因此后期呈現(xiàn)緩慢升高的趨勢?！~’側(cè)柏內(nèi)源ZT 含量的變化趨勢與金塔柏前期相一致，‘蝶葉’側(cè)柏后期ZT 含量變化趨勢平穩(wěn)，推測其插穗在該階段形成較多愈傷組織，從而消耗較多ZT。

在整個不定根發(fā)生過程中，JA 含量呈現(xiàn)先升高后降低再略有升高的規(guī)律性變化（見圖3D）。JA含量隨著愈傷組織的形成快速積累，與ABA類似，同樣在愈傷組織形成期達(dá)到峰值（87.8 ng·g），為根原基的形成與不定根的發(fā)生奠定了基礎(chǔ)。愈傷組織形成后，隨著根原基的發(fā)育與不定根的形成，JA 含量急劇下降（10.6 ng·g）。不定根原基向外發(fā)育突破皮層或愈傷組織形成不定根的過程中，插穗恢復(fù)合成JA 的能力，JA 含量開始有所上升。而‘蝶葉’側(cè)柏在整個生根過程中的JA 含量變化與金塔柏相似，不同之處在于其后期JA 含量仍處于下降趨勢。分析認(rèn)為前期JA 的快速積累促進了不定根的形成，后期低水平的JA 含量利于二級側(cè)根的形成。

在扦插生根的5個關(guān)鍵時期，金塔柏和‘蝶葉’側(cè)柏插穗內(nèi)源激素的比值變化趨勢類似，但又有差異。IAA/ABA 值隨發(fā)育進程呈先降低后升高的趨勢，扦插后1 d，金塔柏IAA/ABA 值顯著高于‘蝶葉’側(cè)柏，隨著愈傷組織的形成，IAA/ABA 值下降；隨著根原基的形成與發(fā)育，IAA/ABA 值開始緩慢回升，但‘蝶葉’側(cè)柏則略有下降（見圖4A）。插穗IAA/ZT 值表現(xiàn)為先升高后降低至平穩(wěn)的趨勢，隨著愈傷組織的形成，IAA/ZT值逐漸變大；隨著根原基的形成與發(fā)育，IAA/ZT值急劇下降直至平穩(wěn)，不同品種間差異不顯著（見圖4B）。IAA/JA 值的變化與IAA/ABA 相似，扦插后至愈傷組織形成，IAA/JA值急劇降低，在愈傷組織形成期達(dá)最低值，然后比值小幅度上升，但基本維持穩(wěn)定（見圖4C）。

圖4 金塔柏莖段不同發(fā)育期內(nèi)源激素間比值及總激素含量的動態(tài)變化（n=3）Fig.4 Dynamic changes of endogenous hormone ration and total hormone content in cuttings（n=3）

3 討論

植物扦插不定根的發(fā)生類型從形態(tài)學(xué)上依據(jù)不定根的伸出部位分為愈傷組織生根型、皮部生根型和混合生根型三種類型，依據(jù)不定根原基的起源部位，又分為單一位點發(fā)生和多位點發(fā)生。不定根的發(fā)生模式因樹種不同而有所不同，有的樹種屬于單一皮部生根型且不定根原基起源部位單一，不定根根原基只從形成層與髓射線交叉處或木質(zhì)部和韌皮部之間的維管形成層處發(fā)生，如歐美雜種山楊（×）、合歡（）；有的樹種屬于皮部生根型，但不定根原基可由初生韌皮部中的薄壁細(xì)胞、髓射線與形成層交叉處的部分薄壁細(xì)胞發(fā)育而來，屬于非愈傷組織生根的多位點發(fā)生，如歐洲鵝耳櫪（）。有的樹種屬于單一位點對的愈傷組織生根型，扦插后先在形成層處形成愈傷組織，再由愈傷組織內(nèi)分化出根原基，如薄殼山核桃（）。有的樹種可同時由愈傷組織和皮部誘導(dǎo)產(chǎn)生不定根，不定根原基起源為多位點發(fā)生，如桃（）的不定根原基在皮層、韌皮部、木質(zhì)部和愈傷組織中都可以形成，紅纓海棠（‘Hongying’）的不定根原基誘導(dǎo)產(chǎn)生于愈傷組織、維管形成層、髓射線與皮層交界處、髓射線與環(huán)髓帶交界處等部位。有的樹種既有皮部生根又有愈傷組織生根，且皮部生根與愈傷組織生根相互抑制，如含笑（）；有的樹種包含愈傷組織生根、皮部生根、愈傷組織和皮部混合生根型，大部分不定根從插穗基部愈傷和皮部的交界處伸出，如歐洲云杉（）、圓 柏（）、銀 杏（）。本課題組在前期研究中，認(rèn)為側(cè)柏扦插生根屬于多位點發(fā)生模式，并在金塔柏插穗愈傷組織、髓射線與形成層的交界處2個部位觀察到根原基形成，本試驗通過連續(xù)組織切片觀察，進一步發(fā)現(xiàn)，除了在愈傷組織、髓射線與形成層的交界處發(fā)現(xiàn)根原基形成外，不定根原基在髓射線、木質(zhì)部、維管形成層、次生韌皮部、皮層中都可以形成，而且金塔柏扦插的生根類型包括愈傷組織生根、皮部生根和混合生根三種類型。

植物激素在不定根發(fā)生過程中起著重要作用，在解剖學(xué)的基礎(chǔ)上研究植物激素與扦插生根的關(guān)系一直是不定根發(fā)生發(fā)育生理研究的熱點，其中生長素、細(xì)胞分裂素、脫落酸、赤霉素、茉莉酸等作為不定根發(fā)生發(fā)育的誘導(dǎo)因子，與愈傷組織的誘導(dǎo)、根原基的發(fā)生、根的發(fā)育息息相關(guān)。生長素與生根關(guān)系密切，多數(shù)研究認(rèn)為生長素含量與生根有直接關(guān)系，是調(diào)控不定根發(fā)生的關(guān)鍵激素，在激素互作調(diào)控不定根發(fā)生中起主導(dǎo)作用。但不同樹種中生長素的調(diào)控作用有所不同，IAA 在楸子（）扦插生根中只起協(xié)同作用，較高含量的IAA 抑制四倍體刺槐（）嫩枝扦插生根，而較高濃度的內(nèi)源IAA 含量利于杜鵑屬根原基分化形成和生根。在本試驗中，插穗經(jīng)IBA 處理扦插后1 d 具有較高濃度的IAA 含量積累，隨著愈傷組織的形成與根原基的發(fā)生發(fā)育而逐漸降低，不定根形成后逐步回升，說明愈傷組織與根原基的形成是一個消耗IAA 的過程，而扦插前期較高水平的IAA 積累有利于后期愈傷組織和根原基的誘導(dǎo)分化，后期不定根形成后促進IAA 積累；ABA 含量在扦插后初期較低，隨著愈傷組織的形成而逐漸積累，然后在整個生根過程中持續(xù)下降至平緩，這有利于插穗內(nèi)淀粉水解為糖，進而促進根原基的形成和插穗生根。細(xì)胞分裂素在不定根誘導(dǎo)的早期過程中發(fā)揮作用，在愈傷組織形成之前進行積累并維持在較高水平以調(diào)控愈傷組織的分化，本實驗中金塔柏和‘蝶葉’側(cè)柏插穗在扦插前期莖段內(nèi)內(nèi)源ZT 維持在較高水平，隨著愈傷組織的形成而下降，愈傷組織形成后開始緩慢上升，進一步證實細(xì)胞分裂素可調(diào)控愈傷組織的形成。茉莉酸介導(dǎo)的受傷信號可以促進植物再生，本試驗中茉莉酸在扦插前期水平較低，在愈傷組織誘導(dǎo)形成過程中積累達(dá)到最高水平，隨著根原基的誘導(dǎo)與不定根形成而緩慢升高，該研究結(jié)果證實茉莉酸介導(dǎo)愈傷組織發(fā)育并促進不定根的發(fā)生，后期茉莉酸含量的提高則有助于不定根的形成與伸長，推測這也是‘蝶葉’側(cè)柏生根率低于金塔柏的原因之一。不定根的發(fā)生發(fā)育是不同激素調(diào)控的復(fù)雜發(fā)育過程，植物激素間的動態(tài)平衡決定了不定根的發(fā)生，其中生長素、細(xì)胞分裂素、脫落酸、茉莉酸之間的平衡決定了再生器官的發(fā)育命運，IAA/ABA 值和IAA/JA 值下降、IAA/ZT上升促進愈傷組織形成，IAA/ABA 值上升、IAA/JA值維持在較低水平、IAA/ZT 比值下降促進根原基分化及不定根的發(fā)育。