不同激素處理對白樺幼樹萌條及三萜合成的影響

張玉琦 蘇 欣 尤志強(qiáng) 富金博 詹亞光，2 尹 靜，2*

（1. 東北林業(yè)大學(xué)東北鹽堿地植被恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040；2. 東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040）

白樺（Suk.）中含有重要的次級代謝產(chǎn)物白樺脂醇，白樺脂酸和齊墩果酸等五環(huán)三萜類化合物，它們具有廣泛的藥理活性，在抗癌、抗人類免疫缺陷病毒（HIV）及治療心血管疾病方面發(fā)揮重要作用。最近發(fā)現(xiàn)白樺脂酸對多種腫瘤具有抑制效果，包括人神經(jīng)膠質(zhì)瘤、白血病、人結(jié)腸癌、人前列腺腺癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、肺癌、乳腺癌和宮頸癌?？诜R墩果酸具有抗膽汁淤積作用，也可以用作治療人肝細(xì)胞癌的治療劑。

然而，隨著天然藥物需求的增長，藥用植物資源變得越來越稀缺，特別是以多年生樹木組織作為來源的活性成分，含量及產(chǎn)量更是有限，成為進(jìn)一步應(yīng)用的瓶頸。本實(shí)驗(yàn)室前期已對白樺三萜積累規(guī)律、分布特征、細(xì)胞培養(yǎng)、誘導(dǎo)調(diào)控及相關(guān)基因功能等做了一系列的研究，并取得一定進(jìn)展。但關(guān)于白樺幼苗進(jìn)行萌條實(shí)驗(yàn)還未曾嘗試。之前對木本植物萌芽再生的研究已有一些報(bào)道，其中大多數(shù)主要集中在發(fā)芽機(jī)理上，其中包括6 個(gè)假說：生物地理假說、生境假說、營養(yǎng)假說、干擾假說、資源分配假說和激素調(diào)控假說，也有研究速生多用途固氮樹種馬占相思（Willd.）樹樁性狀（如基徑和高度）對發(fā)芽存活和生長的影響，如伐樁的萌芽率及平均萌條數(shù)隨伐樁高度的增加而增加，隨直徑的增大而減少。萌條直徑、長度及直立萌條總斷面積隨伐樁的高低和大小而增減。幾種常綠闊葉林優(yōu)勢種在砍伐后萌枝更新的初步研究結(jié)果顯示，砍伐對木荷（）、石櫟（）、苦櫧（）、栲樹（）、米櫧（）萌芽更新都會造成影響，對栲樹、米櫧影響更大，而對木荷、石櫟、苦櫧影響較小。從植物萌生角度來說，這是形成研究地區(qū)大面積的以木荷、石櫟、苦櫧為優(yōu)勢種組成的次生灌叢的主要原因。有研究證實(shí)春季（3月）對麻瘋樹（L.）樹干基部進(jìn)行截干處理可達(dá)最佳的優(yōu)樹促萌效果。第2 年春對南酸棗（）截干處理造林效果較好。通過不同種植密度和截干高度的栽培試驗(yàn)，銀杏（L.）葉用林以種植密度100 cm×40 cm 及離地50 cm 截干的鮮葉產(chǎn)量最高。沙棘（）最佳的促萌造林時(shí)間為春秋兩季，同時(shí)又有實(shí)驗(yàn)證明楊樹（cv.）根系具有連續(xù)多年多次萌發(fā)的能力。黃利斌等用0.2% KMnO誘導(dǎo)杉木（（Lamb.）Hook.）促 萌 與對照相比萌條數(shù)量增加效果顯著。蘇廣新等以濕加松（var.Engelm ×Morelet）F2 代為研究對象，對濕加松進(jìn)行修剪促萌試驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)修剪效果最佳方式為主莖留高約l0 cm 進(jìn)行截干。吳幸連對桉樹（）進(jìn)行促萌研究，發(fā)現(xiàn)距根莖部位20 cm 處的截干促萌效果顯著。截干促萌復(fù)壯技術(shù)也應(yīng)用于油茶（Abel.）低產(chǎn)林，增產(chǎn)效果極佳。研究發(fā)現(xiàn)馬尾松（Lamb.）剪頂促萌高度在8 cm 為宜。研究發(fā)現(xiàn)6-BA、KT對提高柚木（L.f.）無性系的萌芽數(shù)和穗條量效果顯著，采用剪除柚木萌條僅留1對葉片的處理效果極佳。本研究以1 年生白樺幼苗為試材，通過不同截干高度、基部保濕、激素促萌處理，探明不同處理下白樺幼苗萌條效果及對三萜合成的影響，以期為持續(xù)、高效、穩(wěn)定地獲得白樺材料及次生產(chǎn)物有效生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

白樺于2013年10月溫室育苗，采用直徑10 cm，高15 cm塑料盆，盆栽用土為（黑土）∶（草炭土）∶（沙）=3∶1∶1，1株/盆，育苗400株。2014年5月，株高達(dá)50～60 cm，選取生長一致、均勻的幼苗進(jìn)行促萌處理。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不同截干高度處理

采用3 個(gè)截干高度：10、20 和30 cm 以及一組不截干（對照）處理。12 次（株）重復(fù)，2014 年5 月12 日按3 個(gè)不同截干高度進(jìn)行截干處理，塑料膜密封截干傷口，統(tǒng)計(jì)初始芽點(diǎn)數(shù)量，截干后充足澆水，此后定期等量澆水，30 d 進(jìn)行促萌結(jié)果統(tǒng)計(jì)，包括萌芽數(shù)量及萌條數(shù)量，計(jì)算萌芽率和萌條率。

1.2.2 基部保濕處理

采用3 個(gè)截干高度處理：10、20、30 cm 處理后，在基部覆蓋鋸末10 cm厚度，并澆水保濕促萌。統(tǒng)計(jì)初始芽點(diǎn)數(shù)量。12 株重復(fù)，一個(gè)月后統(tǒng)計(jì)萌芽數(shù)及萌條數(shù)量。

1.2.3 激素或藥劑促萌處理

采用3 個(gè)截干高度：10、20、30 cm 處理后，每個(gè)截干高度使用4 種激素或化學(xué)藥劑處理：2，4-D（20 mg·L）、KT（20 mg·L）、6-BA（20 mg·L）和KMnO（20 mg·L）。2014 年5 月12 日按上述試劑濃度，在截干的苗莖上使用大毛筆涂抹處理，每個(gè)處理12株，統(tǒng)計(jì)初始芽點(diǎn)數(shù)量，一個(gè)月后統(tǒng)計(jì)萌芽數(shù)量及萌條數(shù)量。

1.2.4 留條方式及二、三次促萌試驗(yàn)

上述不同截干及藥劑促萌試驗(yàn)1個(gè)月后，進(jìn)行萌條數(shù)量統(tǒng)計(jì)，同時(shí)進(jìn)行不同留條試驗(yàn)及二次促萌試驗(yàn)，在二次促萌試驗(yàn)1 個(gè)月后，再進(jìn)行第3 次促萌。

留條方式：在截干1 個(gè)月采條時(shí)，在離最低腋芽5 cm 處剪去萌芽條，即留一對葉片，1 個(gè)月后進(jìn)行萌條數(shù)量統(tǒng)計(jì)。

1.3 試驗(yàn)指標(biāo)觀測

1.3.1 數(shù)據(jù)收集與統(tǒng)計(jì)分析

使用1 年生白樺苗，2014 年5 月12 日開始進(jìn)行截干處理。截干前進(jìn)行苗高、地徑的生長調(diào)查。

截干及激素處理后立即對腋芽原基數(shù)進(jìn)行調(diào)查，然后在截干后1個(gè)月（第1次采條）、2個(gè)月（第2次采條）、3 個(gè)月（第3 次采條）時(shí)對可采穗條數(shù)調(diào)查。

根據(jù)調(diào)查的腋芽原基數(shù)量、萌芽數(shù)量和可采穗條數(shù)量計(jì)算：腋芽原基轉(zhuǎn)化率是指腋芽原基轉(zhuǎn)化成芽和可采穗條的百分率。

穗條可采率是指采集穗條時(shí)可采穗條數(shù)量占萌芽數(shù)量的百分率。

利用DPS7.05軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.3.2 總?cè)频奶崛〖昂繙y定

白樺總?cè)坪繖z測參考本實(shí)驗(yàn)室之前研究方法方法。

1.3.3 白樺脂醇、白樺脂酸、齊墩果酸樣品的制備及檢測

白樺脂醇、白樺脂酸、齊墩果酸提取方法及檢測方法參考本實(shí)驗(yàn)室之前的方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同促萌方式對白樺苗萌條產(chǎn)量及三萜合成的影響

白樺幼苗初次截干（30 d 后）促萌采條結(jié)果表明：截干高度為10 cm 的植株萌芽率達(dá)40%，萌條率達(dá)70%，萌條產(chǎn)量達(dá)32.13 g。萌芽率、萌條率高于截干高度為20和30 cm處理組（見表1）。

由表1 可知，相同截干高度不同藥劑處理下，截干高度為10 cm 的植株中，KT 激素處理的萌芽率最高達(dá)69.12%，鋸末處理的萌條率最高達(dá)77.78%，鋸末處理的萌條產(chǎn)量也為最高，達(dá)61.34 g；截干高度為20 cm 的植株中KMnO激素處理的萌芽率最高，達(dá)40.91%，2，4-D 處理的萌條率最高達(dá)62.86%，鋸末處理的萌條產(chǎn)量最高為77.18 g；截干高度為30 cm 的植株中KT激素處理的萌芽率最高，鋸末處理的萌條率最高達(dá)75%，KMnO處理的萌條產(chǎn)量最高；說明KT 有利于白樺苗芽點(diǎn)的萌發(fā)，2，4-D 有利于白樺的萌條，鋸末處理有利于萌條率和萌條產(chǎn)量的增加。本實(shí)驗(yàn)確定了截干高度10 cm 進(jìn)行激素KT 處理的白樺苗萌芽率最高，達(dá)69.12%；截干高度10 cm的鋸末處理下白樺萌條率最高；截干高度20 cm，鋸末處理下白樺鮮質(zhì)量為最高，達(dá)77.18 g。

表1 初次促萌采條白樺苗萌條產(chǎn)量Table 1 Sprout yield of birch seedlings

圖1 白樺苗初次促萌（30 d）Fig.1 Birch seedlings for first rafting branch

初次促萌采條白樺幼苗枝條總?cè)坪恳越馗筛叨?0 cm 最高，達(dá)76.43 mg·g（見圖2A），其次為截干高度10 cm枝條中有較高三萜含量，其他處理均不利于總?cè)品e累。葉中總?cè)坪恳越馗筛叨?0 cm 下激素6-BA處理最高，達(dá)91.16 mg·g，是截干高度30 cm 下鋸末處理的2.68 倍（見圖2B），另外不同截干高度下的2，4-D 處理沒有顯示出對葉中三萜積累有顯著抑制作用。鋸末處理、KT 和KMnO處理下的枝條和葉片中總?cè)坪恳诧@著低于其他處理，其中鋸末處理下總?cè)坪烤畹汀?/p>

圖2 白樺苗促萌初次采條枝條（A）和采條葉（B）中總?cè)坪孔ⅲ盒懽帜副硎驹?.05水平差異顯著，下同F(xiàn)ig.2 Content of total triterpenoids in branche（sA）and leave（sB）of birch seedlings for first rafting branchNote：Small letter means significant difference at 0.05 level，the same as below

初次促萌后截干高度為20 cm 下6-BA 處理，提高了枝條中白樺脂醇含量，顯著高于其他處理（圖3A）。葉中白樺脂醇含量以截干高度30 cm 進(jìn)行激素6-BA 處理最佳，達(dá)到22.70 mg·g（見圖3B），其次為截干高度30 cm 和截干高度30 cm 進(jìn)行2，4-D 處理。表明6-BA 可顯著促進(jìn)促萌枝條和葉中白樺脂醇的積累。同時(shí)發(fā)現(xiàn)KMnO和鋸末保濕處理并不利于白樺枝條和葉片中三萜物質(zhì)的積累。

圖3 白樺苗初次促萌采條枝條（A）和采條葉（B）中白樺脂醇含量Fig.3 Betulin content in branches（A）and leaves（B）of birch seedlings for first rafting branch

初次截干采條后，白樺枝條中白樺脂酸含量以截干高度20 cm 下激素6-BA 處理含量最高（見圖4A），其次為相同截干高度不加激素處理的組，截干高度20 cm，30 cm 下進(jìn)行2，4-D 處理的枝條中均表現(xiàn)較高白樺脂酸含量。

圖4 白樺苗初次促萌采條枝條（A）和采條葉（B）中白樺脂酸含量Fig.4 Content of betulinic acid in branches（A）and leaves（B）of birch seedlings

葉中白樺脂酸含量以不加激素的三種截干處理及激素6-BA、2，4-D 處理表現(xiàn)較高，顯著高于其他處理（見圖4B）。而鋸末處理、KT 處理及KMnO均不利于白樺脂酸含量積累。

截干高度為20 cm 的枝條中齊墩果酸含量較高，為17.90 g，而截干高度為30 cm 葉中齊墩果酸含量較高，為20.96 g。初次促萌采條白樺幼苗枝條齊墩果酸含量以截干高度20 cm 進(jìn)行激素6-BA處理含量最高，達(dá)18.95 mg·g（見圖5A），其次為截干高度20 cm 和KMnO處理的10 cm 截干高度枝條中均表現(xiàn)較高齊墩果酸含量。葉中齊墩果酸含量以截干高度30 cm 進(jìn)行激素6-BA 處理最佳，達(dá)21.96 mg·g（見圖5B），其次為截干高度30 cm和20 cm 葉中均表現(xiàn)出較高齊墩果酸含量。表明截干高度30 cm 的6-BA 處理對齊墩果酸的積累有利，其他處理均不利于葉片中齊墩果酸積累。

單因素分析結(jié)果顯示，年齡、科室、本單位工作年限、“是否主動了解疫苗相關(guān)知識”“近3年是否接觸過自費(fèi)疫苗”與知識得分有關(guān)（Z/H=6.512、-2.177、14.243、-3.378 和-3.169； P 均＜0.05）。Logistic回歸分析顯示，醫(yī)務(wù)人員“近3年是否接種自費(fèi)疫苗”和“是否主動了解疫苗相關(guān)知識”是知識得分分組的影響因素。見表3。

圖5 白樺苗初次促萌采條枝條（A）和采條葉（B）中齊墩果酸含量Fig.5 Content of oleanolic acid in branches（A）and leaves（B）of birch seedlings

2.2 二次促萌對白樺苗萌條產(chǎn)量及總?cè)坪铣傻挠绊?/h3>

在第一次截干采條后，一個(gè)月再進(jìn)行二次截干處理。結(jié)果表明，截干高度為10、20、30 cm的植株中，鋸末處理的萌條數(shù)量和鮮質(zhì)量都高于其他處理，萌條產(chǎn)量分別為126.96、59.78 和58.65 g（見表2）；其他處理未見比對照有顯著提高，該結(jié)果進(jìn)一步說明鋸末處理有利于二次萌條及產(chǎn)量的提高。

表2 二次促萌白樺萌條產(chǎn)量Table 2 Sprouting shoot yield of birch

二次促萌白樺枝條總?cè)坪恳越馗筛叨?0 cm 進(jìn)行激素6-BA 處理效果較好，達(dá)97.55 mg·g（見圖6A），其次為截干高度30 cm 進(jìn)行KMnO處理及截干高度10 cm 進(jìn)行6-BA 處理。KT、鋸末處理及2，4-D 處理未表現(xiàn)出對二次促萌枝條中三萜含量有促進(jìn)作用。

圖6 二次促萌白樺枝條（A）和采條葉（B）中總?cè)坪縁ig.6 Total triterpenoids content in branches（A）and leaved（B）for secondary sprouting of birch

葉中總?cè)坪恳越馗筛叨?0 cm 進(jìn)行激素KT 處理最佳，達(dá)99.22 mg·g（見圖6B），其次鋸末處理組、6-BA處理組葉中也有較高總?cè)坪俊?/p>

2.3 三次促萌對白樺苗萌條產(chǎn)量及總?cè)坪铣傻挠绊?/h3>

由表3 可知，對白樺苗進(jìn)行三次促萌處理后，截干高度為20 cm 的植株中，2，4-D 處理的萌條數(shù)量最高達(dá)27，鋸末處理的萌條產(chǎn)量最高；截干高度為30 cm 的植株中，KT 處理的萌條數(shù)量最高，2，4-D處理的萌條產(chǎn)量最高，達(dá)18.56 g；說明KT、2，4-D和鋸末有利于三次萌條。

表3 三次促萌白樺萌條產(chǎn)量Table 3 Sprouting yield of birch seedlings of third sprouting promotion

第二次截干促萌后1 個(gè)月，進(jìn)行第三次采條，收集白樺枝條和葉片，檢測總?cè)坪浚Y(jié)果表明：第三次促萌后采條總?cè)坪恳越馗筛叨?0 cm 進(jìn)行激素6-BA 處理最高，達(dá)97.99 mg·g（見圖7A），其次為截干高度20 cm 進(jìn)行KMnO處理及截干高度30 cm 進(jìn)行2，4-D 處理的枝條中有較高三萜含量。三次促萌采條后，枝條中以對照組及鋸末處理組的總?cè)坪枯^低。

圖7 三次促萌白樺枝條（A）和采條葉（B）總?cè)坪縁ig.7 Total triterpenoids content in branches（A）and leaved（B）for third times sprouting promoting birch

葉中總?cè)坪恳越馗筛叨?0 cm 進(jìn)行激素2，4-D 處理最佳（見圖7B），其次為截干高度20 cm及截干高度20 cm進(jìn)行鋸末處理，葉中有較高三萜含量。激素6-BA、KMnO處理組葉片中總?cè)坪枯^低。

3 討論

白樺為落葉喬木，成年白樺樹外皮中含有豐富的抗腫瘤活性成分五環(huán)三萜類物質(zhì)，但樹木生長周期長，三萜物質(zhì)來源有限，成為大規(guī)模實(shí)際應(yīng)用的瓶頸。本文在不同截干高度下利用不同激素處理白樺幼苗，以探索一種可持續(xù)、穩(wěn)定的獲得白樺枝條及三萜物質(zhì)的方法。已有研究結(jié)果表明，截干能夠促進(jìn)南方紅豆杉（var.）地徑生長及莖干上潛伏芽的萌發(fā)，且留干較長的萌蘗數(shù)量較多；截干能夠促進(jìn)新枝萌發(fā)，且留干較短對新枝萌發(fā)數(shù)量有促進(jìn)作用。同時(shí)也有研究顯示，為了縮短非生產(chǎn)期，國營東平農(nóng)場曾嘗試用高截干橡膠（）作定植材料，在早春定植。紫穗槐（L.）截干造林的成活率、新梢生長量、發(fā)枝量、冠幅生長量及次年保存率均優(yōu)于小苗造林，沙荒地效果更明顯，截干以在30 cm 左右飽滿芽處為最佳高度?？梢?，木本植物截干處理可以改變株型，獲得豐富的枝條。

激素處理對于枝條萌發(fā)及次生產(chǎn)物合成也具有重要的作用。6-BA（6-芐氨基嘌呤）的主要作用是促進(jìn)芽的形成，也可以誘導(dǎo)愈傷組織發(fā)生。6-BA 可抑制植物葉內(nèi)葉綠素、核酸、蛋白質(zhì)的分解，是高效能植物生長調(diào)節(jié)劑，在促進(jìn)種子發(fā)芽、促進(jìn)花芽分化、提高坐果率、促進(jìn)果實(shí)生長、提高果品品質(zhì)等多方面表現(xiàn)良好。KT 即激動素，其主要是用來誘導(dǎo)芽的分化，促進(jìn)側(cè)芽發(fā)生，抑制衰老，促進(jìn)植物生長，具有與生長素（IAA）相似的生理效應(yīng)，低濃度時(shí)可以促進(jìn)植株的生長。植物生長調(diào)節(jié)劑GA 和6-BA 對岑軟3 號油茶（Abel.）扦插苗芽眼的萌發(fā)有明顯的促進(jìn)作用，6-BA 500 mg·L、1 000 mg·L、1 500 mg·L噴 霧、GA 2 000 mg·L噴霧和醮芽、GA 3 000 mg·L醮芽6個(gè)處理的萌芽率均顯著高于對照，萌芽率最高的是6-BA 1 500 mg·L噴霧。生產(chǎn)上宜采用6-BA 1 500 mg·L噴霧的方法來進(jìn)行油茶（Abel.）促萌。采用不同藥劑KT、2，4-D 等處理一年生水曲柳（Rupr.）去頂芽的苗木，可獲得大量萌條。當(dāng)NAA 濃度一定時(shí)，培養(yǎng)基中添加6-BA 比KT 更利于煙草（）葉片不定芽的分化。在MS 懸浮培養(yǎng)基中加入6-BA、2，4-D 和KT 后，顯著增加了青錢柳（）中熊果酸和齊墩果酸的含量。本研究發(fā)現(xiàn)，截干10 cm，6-BA、KT 處理能夠提高白樺萌芽率和萌條產(chǎn)量；同時(shí)6-BA 相比其他激素處理對三萜類次生代謝產(chǎn)物合成有更顯著的調(diào)節(jié)效應(yīng)，這一點(diǎn)與前人結(jié)果有相似之處。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以白樺1年生幼苗為試材，通過不同截干高度、激素及基部保濕處理進(jìn)行促萌，結(jié)果顯示：通過三次促萌對比發(fā)現(xiàn)，二次促萌效果最佳。其中白樺枝條中總?cè)坪恳越馗筛叨?0 cm 的6-BA 處理最佳。葉中總?cè)坪恳越馗筛叨?0 cm 進(jìn)行激素KT 處理最佳。HPLC 檢測結(jié)果顯示，一次促萌后，相比其他激素和鋸末處理，6-BA 和2，4-D 對白樺脂醇、白樺脂酸、齊墩果酸的合成有顯著促進(jìn)作用。其中，截干高度20 cm的6-BA枝條中三種成分含量分別為17.77、2.30、18.55 mg·g。葉中含量分別為21.64、3.03、21.56 mg·g。KT、2，4-D和鋸末有利于第三次萌條產(chǎn)量的提高。

通過分析發(fā)現(xiàn)6-BA、KT 及2，4-D 對促萌后枝條和葉片中總?cè)萍捌淙平M分合成有明顯調(diào)節(jié)作用，可考慮在生產(chǎn)中針對白樺幼苗及不同截干處理，進(jìn)行三種激素的適宜濃度處理，有效增加采條數(shù)量和三萜物質(zhì)的產(chǎn)量。該研究為可持續(xù)、高效地利用白樺資源及獲得活性三萜產(chǎn)物提供了技術(shù)支持。