響應(yīng)面法優(yōu)化提取虎耳草總酚及其抑制五步蛇毒PLA2酶活性的相關(guān)性

孫彤彤 王忠娟 張秀娟 楊詩(shī)涵 陳小強(qiáng)，2 張 瑩*

（1. 東北林業(yè)大學(xué)化學(xué)化工與資源利用學(xué)院，哈爾濱 150040；2. 西藏農(nóng)牧學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院，林芝 860000）

虎耳草（）別名金線吊芙蓉、石荷葉、老虎耳等，為多年生常綠草本植物，是虎耳草科（）虎耳草屬（）植物，世界上存在的虎耳草屬植物大約有400 余種，常生長(zhǎng)于海拔400～4 500 m 的灌叢、草甸以及潮濕巖縫等地，世界上多分布于南美洲、北極和北溫帶，在我國(guó)約有203 種，南北均產(chǎn)，主要產(chǎn)于青海、甘肅、江西等地。

虎耳草全草，是一種常見苗藥，有“家庭藥箱”之說(shuō)，具有很高的藥用價(jià)值，始見于《履巉巖本草》，曾收載于《中國(guó)藥典》（一部）1977 年版和《上海市中藥材標(biāo)準(zhǔn)》1994 年版等多本著作，其性微苦，辛，寒，且有祛風(fēng)、清熱和涼血解毒等功效，多用于治療瘧疾、丹毒、咳嗽吐血和濕疹等病癥?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明虎耳草具有抗炎、抑菌、保肝等多種藥理活性。研究表明，虎耳草含有多種生物活性成分，包括黃酮類、有機(jī)酸、甾體類和多酚類化合物?；⒍葑鳛槲覈?guó)傳統(tǒng)的民族藥物，不僅產(chǎn)地來(lái)源多、方便采摘，在民間用于治療蛇傷，效果明顯，因此對(duì)苗藥虎耳草的成分及其抑制蛇毒活性的原理進(jìn)行研究，為蛇傷患者的治療提供科學(xué)依據(jù)，具有深遠(yuǎn)意義。

超聲波可產(chǎn)生的強(qiáng)烈空化效應(yīng)能促使植物組織破壁，利用超聲波輔助提取，使溶劑更好地滲透入植物的組織細(xì)胞，使中草藥的有效成分提取得更充分，用時(shí)短且提取率較高，適用條件也更為廣泛。因此本文采用超聲輔助提取虎耳草TP，通過(guò)單因素分析，將粒徑、料液比、超聲功率和超聲時(shí)間四個(gè)因素對(duì)虎耳草TP 含量及其對(duì)五步蛇（）毒PIR 的影響進(jìn)行分析研究，利用響應(yīng)面法優(yōu)化提取參數(shù)，確定最佳提取工藝條件，并對(duì)虎耳草TP 含量及其對(duì)五步蛇毒PIR進(jìn)行相關(guān)性分析，以期為虎耳草進(jìn)一步的藥理學(xué)研究提供試驗(yàn)基礎(chǔ)，為虎耳草抗蛇毒制劑的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料、試劑與儀器

虎耳草全草購(gòu)于北京同仁堂；五步蛇毒購(gòu)于皖南醫(yī)學(xué)院蛇毒研究所；超純水由Unique-R20 多功能超純水系統(tǒng)制備；沒(méi)食子酸（>98%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他試劑均為分析純。

儀器：FW100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；FA114A 電子天平，上海奔普儀器科技有限公司；52N紫外-可見分光光度計(jì)，上海精科實(shí)業(yè)有限公司；JP-100ST 數(shù)控超聲清洗機(jī)，深圳潔盟清洗設(shè)備有限公司；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海青浦滬西儀器廠；HL-60 恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；電熱恒溫水浴鍋，天津泰斯特儀器有限公司；H1650 離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用福林—酚法繪制沒(méi)食子酸（GA）標(biāo)準(zhǔn)曲線，以沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（）、吸光度為縱坐標(biāo)（）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用752N 紫外—可見分光光度計(jì)，測(cè)定吸光度，可得沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在質(zhì)量濃度0.03～0.50 g·L內(nèi)與吸光度的線性關(guān)系較好，擬合線性方程為=4.324 3+0.149 3（=0.997 8）。

1.2.2 虎耳草總酚（TP）提取單因素試驗(yàn)

將室溫條件下干燥至恒質(zhì)量的虎耳草粉末過(guò)篩，分別研究粒徑、料液比、超聲功率、超聲時(shí)間對(duì)虎耳草TP含量和其五步蛇毒PIR的影響。試驗(yàn)范圍分別為：粒徑：20、40、60、80、100 目；料液比：1∶10、1∶20、1∶40、1∶60、1∶80；超聲功率：100、200、300、400、500 W；超聲時(shí)間0.5、1、2、3、4 h。各做三組平行試驗(yàn)。虎耳草總酚的提取參照Habermann等的方法進(jìn)行，并根據(jù)所繪制的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算虎耳草TP含量。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

為確定虎耳草TP含量及其對(duì)五步蛇毒PIR的最佳條件，利用Design-Expert 軟件（10.0.7 版）進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以虎耳草TP 含量和PIR 作為響應(yīng)值進(jìn)行試驗(yàn)，并采用Box-Behnken 方法將所得結(jié)果進(jìn)行回歸和優(yōu)化。

1.2.4 虎耳草水提物抑制五步蛇毒PLA活性測(cè)定

根據(jù)Rojas 等的方法制備平板培養(yǎng)基。再將已經(jīng)凝固的平板用直徑為3 mm 的空心管進(jìn)行打孔，每孔的間隔約45 mm，依次做好標(biāo)記。

稱取虎耳草水提物60 mg，加入超純水500 mL充分溶解，將配制好的溶液依次稀釋至0.12、0.10、0.08、0.06、0.04 g·L。分別將20μL上述不同質(zhì)量濃度虎耳草提取物溶液與等體積1 mg·mL蛇毒混合，將混合液于37 ℃水浴鍋中靜置45 min 后5 000 r·min離心5 min（H1650 醫(yī)用離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。取上清液10μL依次加入平板培養(yǎng)基的孔中，以0.12 g·L虎耳草提取物溶液和1 g·L五步蛇毒分別作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照，在37 ℃恒溫培育箱中進(jìn)行8 h的培育，取出平板用游標(biāo)卡尺測(cè)量并記錄透明圈直徑，計(jì)算出PIR（公式中表示為），混合液透明圈直徑以表示，蛇毒透明圈直徑以d表示，即：

1.2.5 最佳優(yōu)化提取條件驗(yàn)證

根據(jù)單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行分析，得到虎耳草TP 含量和其對(duì)五步蛇毒PIR 的最佳提取條件，并對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化驗(yàn)證。

稱取虎耳草粉末5 g，過(guò)篩（粒徑60 目），以料液比1∶50 加水250 mL，浸泡2 h，在50 ℃下超聲（250 W）提取1.8 h，進(jìn)行過(guò)濾，將濾液于60 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至干，將所得虎耳草水提物配制為1 g·L的水溶液進(jìn)行TP測(cè)定，做3次平行試驗(yàn)。

將上述試驗(yàn)操作下所得虎耳草水提物配制成0.12 g·L的溶液，在平板上打孔，取上述溶液20μL 加入1 g·L的蛇毒溶液20μL，操作同1.2.4，取出平板記錄透明圈直徑并計(jì)算出PIR，做3 次平行試驗(yàn)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

如圖1為單因素試驗(yàn)中，粒徑、料液比、超聲功率、超聲時(shí)間4 個(gè)因素分別對(duì)虎耳草TP 含量和PIR的影響。

由圖1a 可知，在粒徑20～60 目的范圍內(nèi)，虎耳草TP 含量及PIR 隨粒徑的增大而增加，粒徑為60目時(shí)TP 含量和PIR 最大，在粒徑60～100 目的范圍內(nèi)，TP 含量和PIR 均呈下降趨勢(shì)。由于粒徑目數(shù)增大，虎耳草粉末間隙變小，溶劑滲透性降低，故導(dǎo)致提取物中TP 含量降低，PIR 下降，因此將粒徑60目設(shè)定為最優(yōu)。

圖1 單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Results of single factor experiments

由圖1b 可知，在料液比1∶10～1∶40 范圍內(nèi)，隨著料液比的提高，虎耳草TP含量及PIR隨之增加。當(dāng)料液比為1∶40 時(shí)，TP 含量和PIR 均為最大，在料液比1∶40～1∶80 范圍內(nèi)，TP 含量和PIR 增加幅度緩慢，逐漸平穩(wěn)。當(dāng)料液比為1∶10 時(shí)，虎耳草粉末與水接觸不充分，細(xì)胞內(nèi)外間濃度差過(guò)低導(dǎo)致提取物的傳質(zhì)效率不高，使TP含量和PIR較低；隨著料液比增大，虎耳草粉末與水充分接觸有利于多酚類化合物溶出，使TP含量和PIR逐漸增加；但料液比過(guò)大時(shí)，單位體積提取劑內(nèi)TP 含量降低，被分散的多酚類化合物容易發(fā)生分解，造成原料浪費(fèi)，從經(jīng)濟(jì)角度考慮，在后續(xù)試驗(yàn)中以料液比1∶40為最優(yōu)條件。

由圖1c可知，在超聲功率100～300 W 內(nèi)，虎耳草TP 含量及PIR 隨超聲功率的增大而增加，300 W 時(shí)TP 含量和PIR 均為最大，在超聲功率300～500 W 內(nèi)，TP 含量和PIR 均呈下降趨勢(shì)。增加超聲功率能在一定程度上提高傳質(zhì)效率，加速有效成分的溶出，但超聲功率過(guò)大可能使多酚類成分遭到破壞，故使TP 含量降低，因此將最優(yōu)超聲功率條件設(shè)定為300 W。

由圖1d 可知，在超聲時(shí)間0.5～1 h 內(nèi)，虎耳草TP 含量及其PIR 隨著超聲時(shí)間增加先下降，1h 之后逐漸上升，3 h 時(shí)TP 含量和PIR 均為最大，在超聲時(shí)間3～4 h 內(nèi)，TP 含量和PIR 逐漸下降，進(jìn)行超聲時(shí)，超聲時(shí)間太短，活性成分并未完全溶出，所以導(dǎo)致TP 含量和PIR 較低，隨著超聲時(shí)間逐漸增加，多酚類物質(zhì)能充分溶出，故使TP含量和PIR升高，但是超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，容易造成有效成分的分解，因此TP 含量和PIR 會(huì)降低，故將超聲時(shí)間3 h設(shè)定為最優(yōu)條件。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 方差與模型建立分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)，將粒徑（）、料液比（）、超聲功率（）、超聲時(shí)間（）作為考察因素，以虎耳草TP 含量和其對(duì)五步蛇毒PIR 為響應(yīng)值，利用Design-Expert 10.0.7版軟件設(shè)計(jì)四因素三水平Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)，將粒徑、料液比、超聲功率和超聲時(shí)間四個(gè)因素值進(jìn)行優(yōu)化，得到虎耳草TP含量及其對(duì)五步蛇毒PIR的結(jié)果及標(biāo)準(zhǔn)差（見表1）。

表1 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 1 Box-Behnken design（BBD）experiment design and results

將表1所得的數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到虎耳草TP 含量和其對(duì)五步蛇毒PIR（、）對(duì)四個(gè)因素的二次回歸方程如下：

通過(guò)對(duì)值和值的分析可觀察出回歸方程各因素的顯著性，來(lái)揭示各變量間的相互作用，<0.05 說(shuō)明差異顯著，<0.01 說(shuō)明差異極顯著Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析見表2。

表2 回歸模型的方差分析結(jié)果Table 2 Variance analysis results of regression model

由 表2 可 見，TP 含 量 和PIR 的值 分 別 為36.47 和12.88，<0.000 1，說(shuō)明該模型有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；TP含量的失擬項(xiàng)為0.44，PIR失擬項(xiàng)為5.85，且>0.05，說(shuō)明失擬項(xiàng)顯著，建模成功；回歸模型下，一次項(xiàng)（）對(duì)TP 含量影響極顯著（<0.01），交互作用項(xiàng)（AD、BD）對(duì)PIR 影響顯著（<0.05），二次項(xiàng)（、、、）對(duì)TP 含量影響效果非常明顯（<0.01），對(duì)PIR 影響效果明顯，其中A和C對(duì)PIR 具有極顯著影響（<0.01），說(shuō)明四因素對(duì)TP 含量和PIR 具有一定函數(shù)關(guān)系。在響應(yīng)面試驗(yàn)范圍內(nèi)，通過(guò)對(duì)比四個(gè)因素的F 值，可知各因素對(duì)TP 含量的影響的主次排序?yàn)?>>，即粒徑>料液比>超聲時(shí)間>超聲功率；各因素對(duì)PIR 影響的主次排序?yàn)?>>，即超聲時(shí)間>粒徑>超聲功率>料液比。

TP 含量和PIR 回歸方程的分別為0.97 和0.93，說(shuō)明模型的擬合度較高，且決定系數(shù)Adj分別為0.95 和0.86，說(shuō)明預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值相差較小，實(shí)用性較高。TP 含量和PIR 回歸方程的變異系數(shù)（CV%）分別為2.55 和10.76，說(shuō)明模型能較好的反映數(shù)據(jù)的真實(shí)性，TP 含量和PIR 的回歸方程 的 信 噪 比（Adeq precision）分 別 為19.46 和13.24，說(shuō)明具有充分的信號(hào)來(lái)響應(yīng)模型。綜上所述，該模型可靠性較高，可用于進(jìn)行虎耳草TP 含量的提取和其對(duì)五步蛇毒PIR的分析。

2.2.2 三維響應(yīng)面圖分析

三維響應(yīng)面圖可以直觀的表現(xiàn)出不同影響因素的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響，可通過(guò)等高線來(lái)判定試驗(yàn)結(jié)果，如圖2，各個(gè)因素及其交互作用對(duì)虎耳草TP 含量及其對(duì)五步蛇毒PIR 的影響，均為開口向下的凸形曲面，則說(shuō)明TP 含量和PIR 均存在最大值。如圖2a 和圖2a1，當(dāng)超聲功率（）和超聲時(shí)間（）分別為300 W 和2 h時(shí)，粒徑（）和料液比（）對(duì)TP 含量和PIR 回歸方程的線性和二次項(xiàng)均影響顯著，且等高線圖形狀均近似橢圓形，說(shuō)明兩個(gè)因素的交互作用具有顯著影響；如圖2b 和圖2b1，當(dāng)料液比（）和超聲時(shí)間（）分別為1∶40和2 h 時(shí)，隨著超聲功率和粒徑的不斷增加，TP 含量和PIR 均呈先增加后下降趨勢(shì)，且等高線表現(xiàn)為近圓形，因此超聲功率和粒徑的交互作用均不明顯；如圖2c 和圖2c1 可知，當(dāng)料液比（）和超聲功率（）分別為1∶40 和300 W 時(shí)，隨著超聲時(shí)間和粒徑的增加，TP 含量和PIR 均呈先增加后下降趨勢(shì)；且等高線表現(xiàn)為近似橢圓形，說(shuō)明超聲時(shí)間和粒徑交互作用影響均為顯著；如圖2d 和圖2d1，當(dāng)粒徑（）和超聲時(shí)間（）分別為60 目和2 h 時(shí)，隨著功率的不斷增加，TP 含量和PIR 均呈先增加后下降的趨勢(shì)，隨著料液比的逐漸增加，TP含量呈先增加后下降的趨勢(shì)，而PIR 則呈上升趨勢(shì)，但等高線表現(xiàn)為橢圓形，說(shuō)明超聲功率和料液比的交互作用均為顯著；如圖2e 和圖2e1，當(dāng)粒徑（）和超聲功率（）分別為60 目和300 W 時(shí)，隨著超聲時(shí)間和料液比的不斷增加，TP 含量呈先增加后下降的趨勢(shì)，PIR 呈上升趨勢(shì)，且等高線表現(xiàn)為近圓形，故超聲時(shí)間和料液比交互作用影響均為不顯著；如圖2f 和圖2f1，當(dāng)粒徑（）和料液比（）分別為60 目和1∶40 時(shí)，隨著超聲時(shí)間和超聲功率的不斷增加，TP 含量和PIR 均呈先增加后下降趨勢(shì)；但等高線表現(xiàn)為橢圓形，說(shuō)明超聲時(shí)間和超聲功率的交互作用影響均為顯著。從單因素試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，隨著料液比的增加，TP 含量和PIR 均呈增加趨勢(shì)，與響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果略有不同，可能是由于粒徑和超聲功率或超聲時(shí)間的交互作用導(dǎo)致。

圖2 提取條件交互作用對(duì)TP含量（a、b、c、d、e、f）和PIR（a1、b1、c1、d1、e1、f1）影響的響應(yīng)曲面圖Fig.2 Extract the response surface plot of the influence of conditional interaction on TP content（a，b，c，d，e，f）and PIR（a1，b1，c1，d1，e1，f1）

2.3 最佳提取條件驗(yàn)證

利用Design-Expert 10.0.7 版軟件優(yōu)化的最佳提取條件為：粒徑62.81 目，料液比1：49.23，超聲功率252.06 W 和超聲時(shí)間1.811 h，TP 含量和PIR的預(yù)測(cè)結(jié)果的最大值分別為87.6 mg·g和41.06%。以試驗(yàn)的操作可行性為基礎(chǔ)，將預(yù)測(cè)的最佳條件進(jìn)行簡(jiǎn)單修改，更改后的條件為粒徑60目，料液比1：50，超聲功率250 W 和超聲時(shí)間1.8 h，進(jìn)行三次平行試驗(yàn)，測(cè)得虎耳草TP 含量和其對(duì)五步蛇毒PIR 分別為（86.90±0.46）mg·g和（40.91±0.21）%，與預(yù)測(cè)值的誤差較小，說(shuō)明優(yōu)化模型的預(yù)測(cè)結(jié)果精準(zhǔn)可靠。

劉佳等通過(guò)單因素試驗(yàn)和Box-Behnken 響應(yīng)面優(yōu)化，對(duì)虎耳草中抗氧化活性物質(zhì)提取最佳試驗(yàn)條件進(jìn)行確定，再將優(yōu)化條件下獲得的提取液進(jìn)行多項(xiàng)成分分析（總黃酮、總多酚、多糖），其中獲得TP含量為20.27 mg·g，從上述試驗(yàn)及分析中，可得該方法獲得總酚含量較高，但是只能說(shuō)明當(dāng)抗氧化活性較高時(shí)各成分的交互作用，不能精確說(shuō)明TP 含量的最佳條件和結(jié)果，因此本文在綜合考慮下，以虎耳草水提物為指標(biāo)，進(jìn)行TP 測(cè)定，對(duì)TP 含量的優(yōu)化條件更加準(zhǔn)確，具有科學(xué)性依據(jù)。

2.4 虎耳草水提物中TP 含量及其對(duì)五步蛇毒PIR相關(guān)性

利用響應(yīng)面試驗(yàn)所得結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化，所得TP含量和PIR 的優(yōu)化范圍分別為64.4～87.6 mg·g和21.7%～41.06%，在此范圍下探索TP 含量及其對(duì)五步蛇毒PIR 的相關(guān)性（見圖3），在試驗(yàn)范圍內(nèi)，隨著TP含量的增加，對(duì)五步蛇毒PIR逐漸增大，呈正相關(guān)，應(yīng)用SPSS20.0 版本軟件進(jìn)行相關(guān)性分析可得，Pearson 相關(guān)系數(shù)為0.958（<0.01），說(shuō)明虎耳草TP含量與PIR極顯著相關(guān)。

圖3 虎耳草TP含量和其對(duì)五步蛇毒PIR的相關(guān)性Fig.3 Correlation between TP content in the aqueous extract of S. stolonifera and PIR in D. acutus venom

熊艷等利用小葉三點(diǎn)金不同萃取相對(duì)尖吻蝮蛇毒主要酶類的抑制進(jìn)行研究，并通過(guò)GCMS 分析，從乙酸乙酯萃取相中共檢測(cè)出26 種成分，發(fā)現(xiàn)其中含有大量具有抑制蛇毒活性的總酚類成分，能夠有效地抑制蛇毒PLA酶的活性；和七一等采用中草藥徐長(zhǎng)卿進(jìn)行毒蛇咬傷的分子機(jī)制研究，采用有機(jī)溶劑萃取、柱層析及高效液相色譜法（HPLC）相結(jié)合，從徐長(zhǎng)卿中篩選并篩選出主要活性成分，經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振鑒定為丹皮酚原苷。采用分子模擬軟件技術(shù)，揭示出丹皮酚原苷是通過(guò)與蛇毒中主要成分金屬蛋白酶和PLA發(fā)生相互作用，從而抑制尖吻蝮蛇毒發(fā)揮致傷作用；因此通過(guò)相關(guān)文獻(xiàn)可知，TP 含量可能是抑制五步蛇毒中PLA活性的影響因素。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，篩選出粒徑、料液比、超聲功率和超聲時(shí)間的四因素三水平取值，利用Box-Bohnken Design 原理設(shè)計(jì)試驗(yàn)，結(jié)果表明，虎耳草TP 及PIR 的最佳提取工藝條件為：粒徑60目，料液比1∶50，超聲功率250 W 和超聲時(shí)間1.8 h，根據(jù)優(yōu)化條件測(cè)定虎耳草TP含量及PIR分別為（86.90±0.46）mg·g和（40.91±0.21）%，與預(yù)測(cè)值誤差均小于1.5%，說(shuō)明模型精準(zhǔn)可靠。相關(guān)性分析結(jié)果表明，虎耳草TP 含量及其對(duì)五步蛇毒PIR呈極顯著正相關(guān)，因此TP 應(yīng)是抑制五步蛇毒中PLA活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，該結(jié)果為虎耳草后續(xù)的藥理學(xué)研究與應(yīng)用開發(fā)提供了一定的理論依據(jù)。