細(xì)胞療法治療大便失禁的現(xiàn)狀及展望

陳文斌 李旺林

華南理工大學(xué)附屬第二醫(yī)院，廣州市第一人民醫(yī)院結(jié)直腸肛門外科(廣州 510180)

大便失禁是指直腸內(nèi)容物(氣體、固體或液體糞便)反復(fù)不自覺地通過肛門，并且無法推遲排便的癥狀，持續(xù)時(shí)間至少1個(gè)月，發(fā)病年齡大于4歲[1- 3]。據(jù)報(bào)道大便失禁的發(fā)病率為0.4%～24%不等，并且隨著年齡的增加，大便失禁的發(fā)病率有明顯上升趨勢(shì)[4]。分娩、外科手術(shù)等原因都可引起大便失禁[5]。大便失禁不僅會(huì)導(dǎo)致患者生活質(zhì)量下降，同時(shí)常伴有心理問題的發(fā)生和社會(huì)負(fù)擔(dān)加重[6- 7]。目前的治療方案包括保守治療和手術(shù)治療，生物反饋、飲食調(diào)節(jié)、糞便收集等都是常見的保守治療方法[8]。手術(shù)治療常用于保守治療無效及肌肉缺損較大的大便失禁。但目前的療效仍不理想，尤其是長(zhǎng)期療效和對(duì)肛門內(nèi)括約肌的修復(fù)不佳[9-11]。近年來，隨著干細(xì)胞及再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，大便失禁的細(xì)胞療法廣泛開展，并在動(dòng)物模型和臨床研究中證實(shí)其在大便失禁的修復(fù)中發(fā)揮積極作用。

1 大便失禁的動(dòng)物模型及損傷機(jī)制

1.1 肛門括約肌損傷模型

目前，大部分研究者構(gòu)建大便失禁的動(dòng)物種屬為大鼠[4]，也有研究選擇兔[12- 13]、狗[14- 15]等。主要?jiǎng)游锬Ｐ桶ㄒ韵骂愋停?1)肛門括約肌切開及修復(fù)模型[16]：在肛門括約肌復(fù)合體上做一7 mm切口，該切口延伸至肛門外括約肌的上緣，縱向長(zhǎng)度約為3～4 mm。然后縫合直腸黏膜(間隔1 mm)，第二層采用單純間斷縫合(間隔 1 mm)作為加固層，最外側(cè)的肛門外括約肌也需要重新縫合。(2)肛門括約肌復(fù)合體25%切除模型[17]：切除腹側(cè)25%的肛門括約肌復(fù)合體，即10點(diǎn)位到2點(diǎn)位之間的全部括約肌，但文獻(xiàn)中未說明切除的具體長(zhǎng)度、體積。(3)50%肛門括約肌復(fù)合體切除模型[18]：暴露肛門括約肌復(fù)合體，切除括約肌大小為1.0 cm×1.0 cm×0.3 cm，重量為0.5 g。(4)低溫?fù)p傷模型[19]：使用液氮冷凍的3 mm直徑鋁棒(單次應(yīng)用30 s)，對(duì)肛門括約肌進(jìn)行冷凍損傷，范圍為90°扇形區(qū)域，24小時(shí)內(nèi)間隔2次進(jìn)行。(5)陰部神經(jīng)擠壓模型[20]：采用骶尾部的后側(cè)切口入路，在肛門直腸窩處分離出雙側(cè)的陰部神經(jīng)，用Castroviejo針架壓迫2次，每次30 s。其他損傷模型還包括肛門括約肌切開術(shù)(sphinctero-tomy，SP)[21- 22]、肛門外括約肌全切術(shù)[23]、陰部神經(jīng)橫斷術(shù)[24]等。但是在損傷模型的相關(guān)研究中缺乏具體造模步驟或切除括約肌的體積。對(duì)于手術(shù)部位也存在多種選擇，例如50%肛門括約肌復(fù)合體切除模型的損傷區(qū)域在左側(cè)[25]、腹側(cè)中部[18]等部位均有文獻(xiàn)報(bào)道。

模型的正確選擇與構(gòu)建對(duì)研究干細(xì)胞療法的效果至關(guān)重要 ，在不同括約肌損傷程度(肛門括約肌切開、25%括約肌切除、50%括約肌切除)，不同的損傷類型(括約肌外科損傷、冷凍損傷、神經(jīng)損傷)以及急性、慢性損傷等大便失禁模型中，干細(xì)胞療法顯示出令人鼓舞的效果，未來如果能在眾多模型中找到最適合的大便失禁模型，并建立標(biāo)準(zhǔn)建模方法，將在一定程度上促進(jìn)干細(xì)胞對(duì)大便失禁療效的相關(guān)研究，減少各研究間異質(zhì)性，促進(jìn)研究向更深層次拓展。

1.2 大便失禁的損傷機(jī)制

正常排便取決于肛門、直腸、肛門內(nèi)括約肌、肛門外括約肌、恥骨直腸肌以及它們的血管和神經(jīng)之間復(fù)雜的感覺和運(yùn)動(dòng)的相互作用，當(dāng)它們中的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)的相互作用被破壞，而其他部分不能代償時(shí)就會(huì)出現(xiàn)大便失禁[26]。肛門括約肌損傷是大便失禁最常見的病理改變，其中大部分是由于產(chǎn)科疾病導(dǎo)致(30%～40%)，孕婦在分娩時(shí)會(huì)陰部的撕裂、牽拉、缺血以及會(huì)陰切開術(shù)等可能導(dǎo)致括約肌損傷[4]。此外，肛腸外科手術(shù)也可導(dǎo)致括約肌損傷進(jìn)而引起大便失禁[5]。

2 干細(xì)胞的來源和修復(fù)機(jī)制

2.1 干細(xì)胞來源

在大便失禁的研究中使用的干細(xì)胞物種來源廣泛，包括大鼠、兔、狗以及人等，其中常見的干細(xì)胞類型包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC)、成肌細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSC)，同時(shí)神經(jīng)干細(xì)胞、骨髓單核細(xì)胞(bone marrow mononuclear cells， MNC )等也有研究報(bào)道[6]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中通常來源于股骨和脛骨骨髓[27- 29]，剔除股骨周圍肌肉和結(jié)締組織，沖洗骨髓腔培養(yǎng)純化后獲取，而骨髓干細(xì)胞在臨床研究中尚未開展。成肌細(xì)胞在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的來源包括腓腸肌[19, 30]、后肢[14, 31- 34]等肌肉豐富部位，在臨床研究中主要來源于胸大肌[10]。采集脂肪組織進(jìn)行脂肪干細(xì)胞原代提取時(shí)，采集部位主要集中于腹部和腹股溝皮下，也有研究者在臂部、內(nèi)臟和大網(wǎng)膜等部位采集脂肪[25, 35- 39]。神經(jīng)干細(xì)胞通常來源于腸道神經(jīng)元[40]，骨髓單核細(xì)胞來源于骨髓組織[16]。

2.2 干細(xì)胞的修復(fù)機(jī)制

干細(xì)胞療法治療大便失禁的機(jī)制仍不清楚，其多向分化潛能、免疫調(diào)節(jié)、分泌功能、促進(jìn)血管生成等特性或許在治療中發(fā)揮著重要作用[41]。干細(xì)胞具有很大潛力的分化能力主要是通過體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)鮮有文獻(xiàn)報(bào)道，但在Bisson等人[19]的研究中發(fā)現(xiàn)注射后的成肌細(xì)胞可在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為成熟肌纖維[19]。同時(shí)干細(xì)胞可以通過多種途徑參與免疫反應(yīng)，例如MSC可以通過旁分泌、細(xì)胞-細(xì)胞間接觸、細(xì)胞外囊泡調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[42- 43]。干細(xì)胞還可以發(fā)揮旁分泌作用刺激鄰近組織細(xì)胞，Nakamura等人[44]發(fā)現(xiàn)MSC可以分泌外泌體通過促進(jìn)肌肉和血管生成促進(jìn)肌肉再生，這少部分由miRNAs，例如miR- 494介導(dǎo)。

3 臨床前研究

目前大便失禁的干細(xì)胞療法相關(guān)研究日益增多，且向著更加深入和完善方向發(fā)展，但是正如Gras[45]所說，不同干細(xì)胞療法之間缺乏共識(shí)。成肌細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞常被選擇用于相關(guān)研究，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞由于其來源廣泛、免疫原性差，近年來的研究也不斷增多[12, 25, 37]。

常見的干細(xì)胞治療注射方式包括局部肌肉注射和靜脈注射，研究表明兩種治療方式對(duì)大便失禁都有積極作用，但在不同研究中二者療效仍存在較大差異。Sujatha等人[28]的研究表明直接注射而不是靜脈注射間充質(zhì)干細(xì)胞可改善損傷后括約肌的收縮功能，并增加了轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-1和賴氨酸氧化酶的表達(dá)，促進(jìn)肛門外括約肌的基質(zhì)沉積。Salcedo等人[20]的結(jié)果卻與上述的研究相反，即靜脈注射組和局部注射組可以明顯改善肛門括約肌靜息壓和肌電圖(electromyography，EMG)頻率，但是局部注射組相比靜脈注射組未能改善肛壓峰值以及EMG幅度，這表明靜脈注射的療效可能要優(yōu)于局部注射組。最近Li等人[46]的研究與上述研究的結(jié)論都不相同，作者發(fā)現(xiàn)局部注射組與靜脈注射組在改善肛壓基礎(chǔ)值方面沒有明顯差異，但是局部注射組相比于靜脈注射組明顯改善了肛壓峰值、EMG頻率、振幅，Massion染色結(jié)果也表明局部注射組在傷口部位有更多的新生肌肉。Salcedo等人的研究[20，47]結(jié)果表明，靜脈注射組和肌肉注射組均可以促進(jìn)括約肌功能恢復(fù)，而且靜脈注射組的疤痕組織比肌肉注射更少，但是肌肉注射或許是更可取的方法，因?yàn)槠湫枰募?xì)胞量更少。雖然兩種注射方式對(duì)大便失禁的療效優(yōu)劣尚存在爭(zhēng)議，但大部分已發(fā)表文獻(xiàn)表明局部注射組可能優(yōu)于靜脈注射組，這可能是不同研究間造模方式、動(dòng)物種屬、細(xì)胞量、細(xì)胞制備方法等多因素導(dǎo)致的。

干細(xì)胞療法在促進(jìn)損傷肛門括約肌功能恢復(fù)中表現(xiàn)出可觀的療效，但是由于干預(yù)措施、治療周期等的不同，實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在較多分歧，如能否促進(jìn)神經(jīng)損傷的修復(fù)。Lane等人[48]通過肛門會(huì)陰切開術(shù)造模，在成肌細(xì)胞治療2周后，肌電圖頻率、振幅等方面與對(duì)照組相比有明顯改善，治療4周后，各組均恢復(fù)至基線水平，無明顯差異。Salcedo等人[20]使用SP模型模擬外陰切開術(shù)，陰部神經(jīng)壓迫模型模擬分娩導(dǎo)致的神經(jīng)損傷，間充質(zhì)干細(xì)胞治療后，SP模型的肛門壓力及肌電圖得到明顯改善，而陰部神經(jīng)壓迫模型沒有改善，我們猜測(cè)造模方式可能影響神經(jīng)修復(fù)效果。Li等人[46]的研究表明，在MSC治療后7天、14天以及28天，靜脈注射組的肌電圖振幅和頻率與假手術(shù)組沒有明顯差異，但是局部注射組肌電圖振幅及頻率出現(xiàn)明顯改善，這表明注射方式的不同也可影響神經(jīng)修復(fù)。Oh等人[15]通過切除狗的25%肛門括約肌構(gòu)建大便失禁模型，并使用自體肌細(xì)胞進(jìn)行治療，肛壓及肌電圖結(jié)果顯示能改善肛門括約肌功能。肌電圖是評(píng)價(jià)損傷后神經(jīng)及其支配肌肉修復(fù)情況的重要指標(biāo)，許多研究中對(duì)于干細(xì)胞能否促進(jìn)損傷后肌電圖振幅及頻率等的恢復(fù)仍不一致，這種差異的原因是多方面的，例如造模方式、干細(xì)胞種類、治療時(shí)間、注射方式等，由于神經(jīng)支配在肌肉收縮中的重要作用，探究干細(xì)胞療法對(duì)神經(jīng)修復(fù)的作用是有必要的。

干細(xì)胞種類豐富，不同干細(xì)胞有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和作用機(jī)制，例如脂肪干細(xì)胞來源廣泛，成肌細(xì)胞可向肌纖維分化。比較不同干細(xì)胞對(duì)大便失禁的療效對(duì)選擇最佳干細(xì)胞類型和指導(dǎo)臨床應(yīng)用具有重要價(jià)值。Mazzanti等人[16]比較了骨髓單核細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的療效，相比生理鹽水組，干細(xì)胞治療組明顯改善了肌肉再生，并提高了SR后肛門括約肌的收縮能力。兩種骨髓干細(xì)胞類型之間沒有顯著差異，即MNC與MSC在修復(fù)肛門括約肌損傷方面同樣有效。本團(tuán)隊(duì)最近的研究比較了局部注射MSC、ADSC和基質(zhì)血管組分(cellular stromal vascular fraction，CSVF)對(duì)大便失禁的療效，結(jié)果顯示治療后第5天CSVF組的肌電圖振幅和頻率明顯高于PBS組，而MSC組和ADSC組卻沒有明顯增高。第10天時(shí)MSC、ADSC、CSVF組的肛壓和肌電圖明顯改善，并且新生組織中肌肉比例明顯高于PBS組，三者之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，即三者對(duì)大便失禁的修復(fù)效果相同(雖然第10天ADSC和MSC組的肛壓基礎(chǔ)值和肌電圖頻率趨勢(shì)上高于CSVF組，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異)。不同干細(xì)胞類型間療效比較的研究較少，尤其是成肌細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞等細(xì)胞之間的比較尚缺乏，并且已發(fā)表文獻(xiàn)僅為臨床前研究證據(jù)，缺乏臨床研究證據(jù)探索不同干細(xì)胞間療效優(yōu)劣。

4 臨床研究

近年來干細(xì)胞治療肛門括約肌失禁的臨床研究也顯示出令人鼓舞的結(jié)果。 Boyer 等人[49]的一項(xiàng)研究共納入24名大便失禁的患者，患者接受自體成肌細(xì)胞(autologous myoblast，AM)或安慰劑治療后，中位克利夫蘭失禁(Cleveland Clinic Incontinence，CCI)評(píng)分在治療6個(gè)月后與基礎(chǔ)值相比有明顯下降，12月后，AM治療組的中位CCI評(píng)分與對(duì)照組相比明顯下降，并且反應(yīng)率明顯高于對(duì)照組。Frudinger的研究[50]將自體成肌細(xì)胞注射到EAS損傷區(qū)域，治療后1個(gè)月和6個(gè)月，肛門壓力明顯上升，12月后Wexner失禁評(píng)分下降，糞便失禁生活評(píng)分(faecal incontinence quality of life, FIQL)明顯改善。隨后2015年Frudinger等人[51]為觀察成肌細(xì)胞治療后的長(zhǎng)期治療效果又納入10名婦女[51]，納入標(biāo)準(zhǔn)與之前的研究相同，結(jié)果顯示隨著時(shí)間延長(zhǎng)Wexner失禁評(píng)分持續(xù)改善，排便頻率減少，肛門靜息壓和收縮壓持續(xù)改善，并且生活質(zhì)量總體提高。2018年Frudinger等人[10]又探究了在更大目標(biāo)人群中成肌細(xì)胞的治療效果，結(jié)果表明擴(kuò)大目標(biāo)人群后成肌細(xì)胞仍然具有明顯效果，每周大便失禁次數(shù)、FIQL評(píng)分明顯改善，Wexner失禁評(píng)分和大便失禁嚴(yán)重程度明顯下降。 Sarveazad等人[39]的研究表明ADSC對(duì)大便失禁患者的治療效果不理想，所有患者在實(shí)施括約肌成形術(shù)后，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別給予ADSC和PBS治療，2個(gè)月后實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的Wexner評(píng)分增加值沒有顯著差異，然而ADSC治療組的EMG和病變區(qū)的肌肉比例明顯增加。de la Portilla等人[38]也對(duì)ADSC治療大便失禁的療效進(jìn)行探索，結(jié)果表明這種治療是安全的，但未能證明能改善患者的情況。成肌細(xì)胞不僅在短期內(nèi)有明顯效果，在更長(zhǎng)時(shí)間和更大目標(biāo)人群中也明顯改善了大便失禁患者的生活質(zhì)量，然而兩項(xiàng)脂肪干細(xì)胞治療大便失禁的臨床研究卻未表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)，還需要進(jìn)一步探索。

5 結(jié)論與展望

大便失禁的動(dòng)物模型種類多樣，可模擬不同因素導(dǎo)致的大便失禁，同時(shí)可選擇的干細(xì)胞類型豐富，臨床前研究中最常使用的干細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、成肌細(xì)胞。但是在臨床研究中成肌細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞更為常見，骨髓干細(xì)胞尚未用于臨床研究。但對(duì)于干細(xì)胞治療大便失禁的具體機(jī)制不清，不同研究間干細(xì)胞來源、制備方法、造模方式等缺乏規(guī)范化管理。

大量研究表明，細(xì)胞療法在治療大便失禁方面具有很大潛能，能明顯提高患者預(yù)后，促進(jìn)肛門括約肌功能恢復(fù)。雖然臨床研究仍較少，未來需要更大樣本、更加深入的研究探索，但細(xì)胞療法的似乎是安全、可耐受的。