辣木葉粗黃酮對(duì)天府肉雛雞生長(zhǎng)、免疫、腸道菌群及抗氧化功能的影響

■唐子婷 金 超 陳 云 杜 紅 易 鑫 張 帥 劉 瑩 舒 剛*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610000；2.南充市順慶區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 南充 637000）

雞肉在我國(guó)是第二大消費(fèi)肉品，肉雞的健康養(yǎng)殖是保證雞肉安全的前提，飼料添加劑在動(dòng)物養(yǎng)殖中發(fā)揮重要作用，保證著動(dòng)物健康安全，同時(shí)還能提高養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益。隨著人們對(duì)食品安全越來(lái)越重視，藥物飼料添加劑在養(yǎng)殖行業(yè)中逐漸消失[1]。新型綠色的抗生素替代品已成為目前研究的熱點(diǎn)，植物黃酮種類繁多，具有抗氧化[2]、抗腫瘤[3]、抗菌[4]、促進(jìn)生長(zhǎng)、改善肉質(zhì)[5]等多種生物學(xué)作用和安全高效、不易產(chǎn)生耐藥性、無(wú)殘留等優(yōu)點(diǎn)[6-7]。

辣木葉粗黃酮是辣木葉提取物的主要活性成分，主要是槲皮素和山奈酚，易溶于水、甲醇和乙醇等極性較大溶劑[8-10]。朱建忠等[11]研究發(fā)現(xiàn)，辣木黃酮對(duì)腦有一定的保護(hù)作用，可以改善糖尿病腦病大鼠的認(rèn)知功能障礙及記憶能力，改善海馬組織病變。李欣[12]的研究發(fā)現(xiàn)，辣木葉粗黃酮可以提高運(yùn)動(dòng)后小鼠體內(nèi)的肝糖原和肌糖原儲(chǔ)備量以及抗氧化能力，起到緩解運(yùn)動(dòng)性疲勞的作用。饒?bào)w宇等[13]研究表明，辣木葉提取物可以改善蛋鴨的血清和蛋黃抗氧化性能、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝并增加免疫球蛋白的分泌量。此外，辣木葉粗黃酮還可以提高蛋雛鴨的飼料利用率、免疫及抗氧化功能[14]。但目前關(guān)于辣木葉粗黃酮對(duì)雛雞生長(zhǎng)性能、免疫、腸道菌群及抗氧化功能的影響鮮有報(bào)道。因此，本研究旨在探究辣木葉粗黃酮對(duì)天府雛雞生長(zhǎng)性能、免疫功能、腸道菌群及抗氧化功能的影響，為開(kāi)發(fā)禽用天然添加劑提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

辣木葉粗黃酮，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)獸藥創(chuàng)新制劑工程技術(shù)研究中心自制（總黃酮含量為80%）。1日齡健康天府肉雞雄性雛雞由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)家禽育種場(chǎng)提供。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及日糧

選用450只健康、體重相似的1日齡天府肉雞雄性雛雞，隨機(jī)分為3 組，每組6 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)25 只。Ⅰ組作為空白對(duì)照，飼喂基礎(chǔ)飼糧；Ⅱ組飼喂添加30 mg/kg辣木葉粗黃酮的飼糧；Ⅲ組飼喂添加120 mg/kg辣木葉粗黃酮的飼糧，試驗(yàn)共計(jì)28 d。參照NRC（1994）營(yíng)養(yǎng)需要和《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（NY/T 33—2004）配制粉料，基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。試驗(yàn)過(guò)程中，試驗(yàn)雞自由采食，充足飲水，按正常免疫程序進(jìn)行免疫接種，其他管理符合天府肉雞對(duì)環(huán)境要求。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.3 生長(zhǎng)性能的測(cè)定

于試驗(yàn)第1、7、14、21、28 d，每天09：00之前以重復(fù)為單位空腹稱重，統(tǒng)計(jì)各階段試驗(yàn)雞的平均體重（BW）、平均日采食量（ADFI）、平均日增重（ADG）及料重比（F/G）。

平均體重（g）=總體重/試驗(yàn)雞數(shù)

平均日增重（g）=增重/（試驗(yàn)天數(shù)×試驗(yàn)雞數(shù)）

平均日采食量（g）=飼料消耗量/（試驗(yàn)天數(shù)×試驗(yàn)雞數(shù)）

料重比=飼料消耗量/增重

1.4 免疫器官指數(shù)的測(cè)定

于試驗(yàn)第14、28 d，雞稱重后頸靜脈放血致死，取脾臟、胸腺與法氏囊，濾紙吸干水分后剝離脂肪和無(wú)關(guān)組織，電子天平稱重。根據(jù)雞體重計(jì)算雞的免疫器官指數(shù)。

免疫器官指數(shù)（g/kg）=免疫器官重量（g）/雞活重（kg）

1.5 血清細(xì)胞因子的測(cè)定

于試驗(yàn)第14、28 d，頸靜脈采血2 mL，室溫靜置4 h，3 500 r/min 離心10 min，分離血清于EP 管中，-20 ℃保存待用。按照試劑盒說(shuō)明書采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定雞血清白介素-2（IL-2）、白介素-12（IL-12）、γ-干擾素（IFN-γ），試劑盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司。

1.6 腸道菌群計(jì)數(shù)

于試驗(yàn)第14、28 d，空腹屠宰后立即取出左側(cè)盲腸，無(wú)菌操作取0.5 g盲腸內(nèi)容物，在4.5 mL無(wú)菌生理鹽水中振蕩5 min，離心10 min（1 000 r/min），采用倍比稀釋法取上清液連續(xù)稀釋8 次備用。每組取106、107、108稀釋液各30 μL于培養(yǎng)基上，劃線涂布法均勻涂抹，每個(gè)樣品做三個(gè)重復(fù)。菌群數(shù)量以每克腸道內(nèi)容物所含細(xì)菌群落總數(shù)的對(duì)數(shù)[lg (CFU/g)]表示。大腸桿菌選用麥康凱氏培養(yǎng)基有氧培養(yǎng)18 h，乳酸桿菌選用乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基無(wú)氧培養(yǎng)24 h 和雙歧桿菌選用TPY培養(yǎng)基無(wú)氧培養(yǎng)36 h，培養(yǎng)基購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。

1.7 血清抗氧化指標(biāo)的測(cè)定

取1.5中血清，嚴(yán)格按照測(cè)定試劑盒說(shuō)明書操作，采用羥胺法測(cè)定血清中總超氧化物歧化酶（Total superoxide dismutase，T-SOD）活性，采用比色法測(cè)定谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）活性，采用鉬酸銨法測(cè)定過(guò)氧化氫酶（Catalase，CAT）活性，采用硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量，采用比色法測(cè)定總抗氧化能力（Totalantioxidant capacity，T-AOC），試劑盒購(gòu)自南京建成工程生物研究所。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步處理，用SPSS 22.0 軟件的方差分析法（ANOVA）進(jìn)行單因素方差分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05為差異顯著，P＞0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣木葉粗黃酮對(duì)天府肉雛雞生長(zhǎng)性能的影響（見(jiàn)表2）

表2 辣木葉粗黃酮對(duì)天府肉雛雞生長(zhǎng)性能的影響

由表2 可知，與Ⅰ組相比，在7、14 d 和28 d時(shí)，Ⅱ、Ⅲ組的BW 顯著提高（P＜0.05）。Ⅱ、Ⅲ組的ADG 均提高，1～28 d 時(shí)分別提高了31.4%、24.1%（P＜0.05）。Ⅱ、Ⅲ組的F/G均降低，1～28 d時(shí)分別降低了25.3%、21.8%（P＜0.05）。各組ADFI 差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 辣木葉粗黃酮對(duì)天府肉雛雞免疫功能的影響（見(jiàn)表3、表4）

表3 辣木葉粗黃酮對(duì)天府肉雛雞免疫器官的影響

表4 辣木葉粗黃酮對(duì)天府肉雛雞血清細(xì)胞因子的影響（pg/mL）

由表3 可見(jiàn)，與Ⅰ組相比，14 d 時(shí)，Ⅱ、Ⅲ組的胸腺指數(shù)分別提高了27.1%、38.4%（P＜0.05）；Ⅲ組的法氏囊指數(shù)提高了24.4%（P＜0.05）。28 d時(shí)，Ⅱ、Ⅲ組的脾臟指數(shù)分別提高了58.1%、76.1%（P＜0.05）；Ⅱ組的胸腺指數(shù)提高了19.5%（P＜0.05）；Ⅲ組的法氏囊指數(shù)降低了31.3%（P＜0.05）。

由表4 可知，與Ⅰ組相比，14 d 時(shí)，Ⅱ、Ⅲ組的血清IL-2、IL-12、IFN-γ的含量顯著提高（P＜0.05），Ⅱ組分別提高65.7%、90.5%、65.0%，Ⅲ組分別提高72.33%、121.6%、61.6%。與Ⅰ組相比，28 d 時(shí)，Ⅱ組的血清IL-2、IL-12、IFN-γ含量提高，但僅對(duì)IL-2 有顯著性影響（P＜0.05），提高了39.5%；Ⅲ組的血清IL-2、IL-12、IFN-γ含量分別提高62.2%、43.8%、49.1%（P＜0.05）。

2.3 辣木葉粗黃酮對(duì)天府肉雛雞盲腸菌群數(shù)量的影響（見(jiàn)表5）

表5 辣木葉黃酮對(duì)天府肉雛雞盲腸菌群的影響[lg(CFU/g)]

由表5可見(jiàn)，與Ⅰ組相比，在14 d時(shí)，Ⅱ、Ⅲ組的大腸桿菌數(shù)量降低了10.4%（P＞0.05）、60.1%（P＜0.05）；Ⅱ、Ⅲ組的乳酸桿菌數(shù)量提高（P＞0.05）；Ⅱ、Ⅲ組的雙歧桿菌數(shù)量分別提高了76.5%（P＜0.05）、6.1%（P＞0.05）。與Ⅰ組相比，在28 d時(shí)，Ⅱ、Ⅲ組的大腸桿菌數(shù)量分別降低了41.3%、69.4%（P＜0.05）；Ⅱ、Ⅲ組的乳酸桿菌量分別提高了141.9%、76.4%（P＜0.05）；Ⅱ、Ⅲ組的雙歧桿菌量分別提高了30.3%、16.1%（P＜0.05）。

2.4 辣木葉粗黃酮對(duì)天府肉雛雞血清抗氧化能力的影響（見(jiàn)表6）

由表6可知，與Ⅰ組相比，在14 d和28 d時(shí)，Ⅲ組的T-SOD 含量分別提高29.1%、122.7%（P＜0.05）；在28 d 時(shí)，Ⅲ組的GSH-Px 含量提高15.8%（P＜0.05）；在14 d 時(shí)，Ⅱ、Ⅲ組CAT 含量提高，且Ⅲ組提高了163.6%（P＜0.05）；在28 d時(shí)，Ⅱ、Ⅲ組CAT含量分別提高229.9%、257.1%（P＜0.05）。在28 d 時(shí)，Ⅱ、Ⅲ組MDA含量分別降低46.0%、50.0%（P＜0.05）；在14 d和28 d 時(shí)，Ⅱ、Ⅲ組T-AOC 含量均提高，其中Ⅲ組分別提高89.2%、264.0%（P＜0.05）。

表6 辣木葉粗黃酮對(duì)天府肉雛雞血清抗氧化功能的影響

3 討論

3.1 辣木葉粗黃酮對(duì)天府肉雛雞生長(zhǎng)性能的影響

楊汝才等[14]研究結(jié)果表明，在蛋雛鴨飼糧中添加辣木黃酮能顯著提高平均日增重，降低料重比。本試驗(yàn)與前人研究結(jié)果一致，結(jié)果表明，30 mg/kg和120 mg/kg辣木葉粗黃酮均可以提高天府肉雛雞日增重，降低料重比，提高生長(zhǎng)性能和減少飼養(yǎng)成本。

3.2 辣木葉粗黃酮對(duì)天府肉雛雞免疫功能的影響

免疫器官指數(shù)反映動(dòng)物機(jī)體免疫功能，一般認(rèn)為免疫器官指數(shù)增加是免疫增強(qiáng)的表現(xiàn)。家禽免疫器官（胸腺、脾臟、法氏囊等）的重量是評(píng)價(jià)營(yíng)養(yǎng)素對(duì)家禽免疫力影響的重要指標(biāo)。Liaqat等[15]用辣木葉粉替代菜籽粕，發(fā)現(xiàn)可以增強(qiáng)雞對(duì)新城疫和傳染性法氏囊病疫苗接種的免疫反應(yīng)。Khan 等[16]在肉雞飼糧中添加1.2%辣木葉粉，發(fā)現(xiàn)可提高肉雞增重，促進(jìn)腸道健康，有免疫調(diào)節(jié)作用。說(shuō)明辣木能提高禽類的免疫功能，而一個(gè)物質(zhì)能在動(dòng)物機(jī)體發(fā)揮一定功能常與其中含有的活性物質(zhì)有關(guān)系。楊汝才等[14]研究發(fā)現(xiàn)0.4%辣木黃酮能顯著提高蛋雛鴨血清免疫蛋白A含量，說(shuō)明辣木黃酮有提高機(jī)體免疫的功能。Gupta等[17]研究發(fā)現(xiàn)辣木葉乙醇提取物具有免疫調(diào)節(jié)作用，能夠提高小鼠胸腺和脾臟指數(shù)、吞噬細(xì)胞活性、血液白細(xì)胞含量。黃茂林等[18]通過(guò)建立小鼠免疫抑制模型，發(fā)現(xiàn)辣木葉乙醇提取物能通過(guò)促進(jìn)免疫球蛋白IgG 的合成，增加單核細(xì)胞吞噬功能，增加免疫器官指數(shù)而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在雛雞的不同生長(zhǎng)階段，辣木葉黃酮對(duì)雛雞的免疫器官的生長(zhǎng)指數(shù)影響不同，但都表現(xiàn)為升高的趨勢(shì)。說(shuō)明辣木葉粗黃酮可以促進(jìn)天府肉雛雞免疫器官的發(fā)育。

IL-2、IL-12 和IFN-γ等促炎因子的含量增加有利于消除宿主病原體，維持機(jī)體健康。另外促炎因子的產(chǎn)生還能維持促炎和抗炎之間的平衡，因其啟動(dòng)免疫的同時(shí)還會(huì)觸發(fā)相關(guān)抗炎因子的分泌，導(dǎo)致抑制促炎因子的合成、黏附分子的表達(dá)以及特異性細(xì)胞因子抑制劑的水平增加，以形成一個(gè)正反饋回路[19]。但過(guò)多的或長(zhǎng)期的促炎因子分泌會(huì)觸發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng)，甚至還能導(dǎo)致細(xì)胞損傷[20]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在基礎(chǔ)日糧中添加辣木葉粗黃酮能提高雛雞血清IL-2、IL-12、IFN-γ的含量，說(shuō)明辣木葉粗黃酮能調(diào)節(jié)天府肉雞的免疫功能，但其對(duì)抗炎因子的調(diào)節(jié)還需做進(jìn)一步研究，從而更全面準(zhǔn)確地了解辣木葉粗黃酮對(duì)肉雞免疫功能的調(diào)節(jié)作用。

3.3 辣木葉粗黃酮對(duì)天府肉雛雞盲腸菌群數(shù)量的影響

正常腸道菌群在促進(jìn)免疫系統(tǒng)發(fā)育、維持正常免疫功能，協(xié)同頡頏病原菌入侵方面發(fā)揮著重要作用[21]。動(dòng)物腸道中大腸桿菌數(shù)目的增加往往導(dǎo)致致病菌的增加，損傷動(dòng)物機(jī)體，引起動(dòng)物發(fā)病。乳酸桿菌和雙歧桿菌能夠增強(qiáng)動(dòng)物體內(nèi)的免疫力，是動(dòng)物體內(nèi)的有益菌群[22]，有益菌群的增加，使得腸道生態(tài)平衡，可以促進(jìn)動(dòng)物機(jī)體健康[23]。因此其數(shù)量直接反映動(dòng)物的健康程度。有研究表明，辣木能調(diào)節(jié)腸道菌群[24]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，辣木葉粗黃酮對(duì)天府肉雛雞的腸道菌群有良好的調(diào)節(jié)作用，顯著減少大腸桿菌的數(shù)量，增加乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量。

3.4 辣木葉粗黃酮對(duì)天府肉雛雞血清抗氧化功能的影響

動(dòng)物機(jī)體清除體內(nèi)自由基、分解過(guò)氧化物以及清除發(fā)揮催化作用的金屬離子主要通過(guò)非酶促和酶促兩種體系，其中酶促體系則主要包含CAT、SOD、GSH-Px等[25-26]。辣木葉粗黃酮在體外能清除自由基[27]。Elizabeth 等[28]研究表明辣木中黃酮類化合物含量高，具有很好的抗氧化能力，能降低大鼠MDA 水平，改善CAT、SOD、GSH、GSH-Px水平。楊汝才等[14]研究也發(fā)現(xiàn)，辣木黃酮能提高雛蛋鴨血清SOD 含量，含量為0.4%時(shí)能顯著降低MDA含量。本研究與其研究結(jié)果相似，在基礎(chǔ)飼糧中添加辣木葉粗黃酮可提高天府肉雛雞血清中T-SOD、CAT、GSH-Px、T-AOC含量，降低MDA 含量，說(shuō)明辣木葉粗黃酮能提高天府肉雛雞抗氧化能力。

4 結(jié)論

①日糧中添加30 mg/kg 和120 mg/kg 辣木葉粗黃酮均可提高天府肉雛雞生長(zhǎng)性能。增加了平均體重和平均日增重，并減少了料重比。

②日糧中添加30 mg/kg 和120 mg/kg 辣木葉粗黃酮均可促進(jìn)免疫，增加了免疫器官指數(shù)和血清細(xì)胞因子水平。

③日糧中添加30 mg/kg 和120 mg/kg 辣木葉粗黃酮均可調(diào)節(jié)盲腸菌群，增加了盲腸有益菌群數(shù)量并減少有害菌群數(shù)量。

④日糧中添加30 mg/kg 和120 mg/kg 辣木葉粗黃酮均可提高抗氧化能力。