蒙古馬盲腸中纖維素分解菌的篩選、鑒定及酶學(xué)特性分析

■李雅靜 宋海燕 蘇少鋒，3 其日格日 陶金山 張建強(qiáng) 芒 來 趙一萍*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)馬屬動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部馬屬動物遺傳育種與繁殖科學(xué)觀測實驗站，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)馬屬動物研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；4.興安職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 烏蘭浩特 137400）

蒙古馬以放牧為主，長期生活在草原上，在飼喂方式上以干草為營養(yǎng)來源，具有耐粗飼料的優(yōu)良特點，能適應(yīng)極粗放的飼養(yǎng)管理，這種食草特性與其腸道中纖維素分解菌有著密切的聯(lián)系。馬為非反芻單胃動物，它有特殊且較發(fā)達(dá)的胃腸道，腸道中后腸系統(tǒng)（結(jié)腸和盲腸）是食物消化吸收的主要場所，可通過微生物發(fā)酵降解植物纖維。蒙古馬盲腸有“發(fā)酵罐”之稱，是微生物發(fā)酵的主要部位，其內(nèi)寄生著大量可以分解纖維素的微生物菌群，這也是蒙古馬相較于其他物種耐粗飼性的重要原因。1999年，Julliand等[1]的研究發(fā)現(xiàn)，在馬盲腸菌群中纖維素分解菌占有主導(dǎo)地位，其內(nèi)存在有22%的蛋白水解菌和78%的纖維素分解菌，且盲腸中的纖維素分解菌的比例遠(yuǎn)大于后腸末端，是末端結(jié)腸的6 倍[2]。在自然界和動物體內(nèi)存在著大量的纖維素分解菌，這些微生物在動物飼養(yǎng)、微生態(tài)制劑和資源利用等方面有著廣闊的應(yīng)用前景。因此，篩選和優(yōu)化出酶活力較高的纖維素分解菌是解決纖維素資源利用的有效途徑。已有研究從土壤、海洋等環(huán)境以及多種動物消化道中成功分離和篩選出纖維素分解菌[3-9]，但從馬屬動物體內(nèi)分離和篩選纖維素分解菌的研究極少。本試驗以蒙古馬盲腸內(nèi)容物為試驗材料，旨在篩選、分離出高效的蒙古馬源纖維素分解菌株，為馬源纖維素分解菌和纖維素酶的工業(yè)生產(chǎn)和利用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗動物來源于內(nèi)蒙古自治區(qū)錫林郭勒草原自由采食的5 匹蒙古馬，年齡在3～5 歲，其中公馬3 匹，母馬2匹；由于春季禁牧，放牧季節(jié)為夏季到冬季；草地上常見牧草種類有大針茅、羊草、冰草、糙隱子草、苔草、冷蒿。蒙古馬在屠宰后剖開腹腔，迅速分離盲腸，取內(nèi)容物50 mL于無酶無菌的離心管中密封，置入冰盒，迅速帶回實驗室開始纖維素分解菌的分離與篩選，每匹蒙古馬所取內(nèi)容物為獨立樣品進(jìn)行處理。

1.2 方法

1.2.1 纖維素分解菌的分離、篩選

取蒙古馬盲腸內(nèi)容物1.0 g 放入無菌培養(yǎng)瓶中，加入無菌生理鹽水至100 mL。在80 ℃恒溫水浴鍋中振蕩30 min后，取菌懸液按照10-2～10-6進(jìn)行梯度稀釋，取各濃度稀釋樣本100 μL 均勻涂布于羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）固體培養(yǎng)基平板上[10]。37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，采用剛果紅染色法篩選菌株。最后通過菌落周圍形成的降解圈直徑（D）與菌落直徑（d）比值為篩選細(xì)菌降解纖維素能力的一個初步標(biāo)準(zhǔn)。而后將比值（D/d）大的菌落進(jìn)行純化和培養(yǎng)。將初篩選出的D/d 值大的菌株菌液濃度OD600nm值調(diào)到1.0左右，按1%接種量接種于LB液體培養(yǎng)基，在37 ℃、220 r/min 條件下發(fā)酵培養(yǎng)24 h，重復(fù)2次。離心后收集上清液作為確定纖維素酶活力檢測的粗酶液。

1.2.2 纖維素酶活力測定

纖維素酶活力的測定依據(jù)我國農(nóng)業(yè)行業(yè)頒布的標(biāo)準(zhǔn)（NY/T 912—2004）為參考。采用3，5-二硝基水楊酸試劑法測定纖維素酶活力[11]。每組試驗做3次平行。

1.2.3 纖維素分解菌的鑒定

1.2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定

取培養(yǎng)3～5 d 的純化菌液進(jìn)行革蘭氏染色，確定細(xì)菌的革蘭氏屬性。并觀察細(xì)菌在CMC-Na 平板上的生長狀況，包括菌落形狀、形態(tài)、透明度、顏色和邊緣整齊程度等。

1.2.3.2 生理生化特性鑒定

按照API 50 CHB 和API Staph 試劑盒說明書，測定的指標(biāo)有D-葡萄糖、淀粉、甲基-α-D-吡喃甘露糖苷和檸檬酸鐵等。

1.2.3.3 纖維素分解菌分子學(xué)鑒定

提取菌株基因組DNA，采用通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和反向引物1492R（5’-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’）進(jìn)行細(xì)菌16S rDNA 的擴(kuò)增[12]。PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)體系包括：2×Tap PCRMaster Mix 12.5 μL、細(xì)菌基因組DNA（50～100 ng/μL）2.0 μL、上下游引物（10 pmol/L）各1 μL、無離子水8.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30個循環(huán)；72 ℃修復(fù)延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。菌株測序所得16S rDNA序列通過NCBI中BLAST軟件進(jìn)行同源性分析，再用Mega 4.1 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 酶學(xué)特性的研究

1.2.4.1 最適pH和最適溫度

使用不同pH（4.0～7.0）的緩沖液分別稀釋粗酶液和溶解1.0% CMC-Na，在40 ℃、30 min 的反應(yīng)條件下，測定酶活力以確定最適pH。同時，用粗酶液與不同pH（3.0～10.0）等比例混合測定CMC 酶液的相對酶活力。在確定最適pH 反應(yīng)條件下，將菌液與1.0%CMC-Na 溶液混合，在不同溫度（40～80 ℃，每5 ℃為一變量）的水浴中反應(yīng)30 min，根據(jù)測得的酶活力確定最適反應(yīng)溫度。

1.2.4.2 纖維素分解菌在不同發(fā)酵條件下的產(chǎn)酶特性

在同樣接種量和條件下，改變之前培養(yǎng)基中碳源，以秸稈粉、玉米粉、微晶纖維素、苜蓿粉4 種物質(zhì)為碳源，其余組成成分不變，研究不同種類的碳源對Bacillus amyloliquefaciensH3 產(chǎn)酶方面的影響。在確定碳源后，選擇2%和1.5%蛋白胨和酵母粉混合物、1%酵母粉、1%蛋白胨、1%尿素為氮源，發(fā)酵后取發(fā)酵液測定纖維素酶活力，確定最佳氮源。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素分解菌的分離及篩選

采用CMC-Na 固體培養(yǎng)基初篩，從蒙古馬盲腸內(nèi)分離的多株菌的菌落周圍都產(chǎn)生了清晰的透明圈，經(jīng)劃線純化培養(yǎng)、剛果紅染色，確定其中D/d比值大的10株菌進(jìn)入復(fù)篩。再以10株菌在搖瓶發(fā)酵28 h的羧甲基纖維素酶（CMCase）活力為依據(jù)（見表1），最終確定將編號為H3、D/d 值為4.0（降解圈直徑為12 mm、菌落直徑為3 mm）、CMCase活力為0.60 U/mL的纖維素分解菌用于后續(xù)試驗（見圖1）。

表1 分離篩選纖維素分解菌株

圖1 菌株H3的降解圈

2.2 菌株H3形態(tài)學(xué)鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果表明，菌株H3顏色呈灰白色，不透明，周圍呈皺醭狀，表面較平滑。對菌株進(jìn)行革蘭氏染色，呈現(xiàn)為陽性，在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)桿狀的菌體，菌體兩邊鈍圓，具有芽孢（見圖2）。

圖2 菌株H3的形態(tài)和革蘭氏染色

2.3 生理生化特性鑒定

菌株H3 的生理生化特性經(jīng)比對和分析，可將其初步鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），鑒定結(jié)果見表2。

表2 菌株H3的生理生化檢測結(jié)果

2.4 菌株分子學(xué)鑒定

將菌株H3 DNA通過1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，所得電泳條帶單一（見圖3）。利用細(xì)菌通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，以H3 菌株基因組DNA 為模板，1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測后，得到了1 500 bp的目的條帶，大小與預(yù)期結(jié)果基本一致（見圖4）。經(jīng)測定，證明纖維素分解菌H3的有效基因片大小為1 515 bp。

圖3 菌株H3 DNA的電泳圖

圖4 菌株H3 16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.5 纖維素分解菌系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

利用BLAST 軟件對菌株H3 16S rDNA 基因序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該菌序列與芽孢桿菌屬的相似性高達(dá)99%，通過利用Mega 4.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)H3與Bacillus amyloliquefaciens親緣關(guān)系最接近（見圖5）。綜合該菌株的形態(tài)學(xué)、生理生化特性以及分子鑒定結(jié)果，最終確定試驗篩選出的纖維素分解菌H3 為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）的一種或變種，將其命名為Bacillus amyloliquefaciensH3。

圖5 菌株H3的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.6 Bacillus amyloliquefaciens H3 分泌纖維素酶的酶學(xué)特性

2.6.1 不同pH 對菌株Bacillus amyloliquefaciensH3產(chǎn)CMCase的影響

pH 可影響酶的催化效率，Bacillus amyloliquefaciensH3 反應(yīng)的最適pH 為4.8；在pH 3.0～4.8 時，CMCase 隨著pH 升高而逐漸升高；當(dāng)pH 4.8～7.0 時，CMCase 隨著pH 升高而降低（見圖6）。CMCase 在pH 3.0～8.0 范圍內(nèi)的緩沖液中30 ℃、1 h 酶活力相對穩(wěn)定，保持在70%～92%，具有較強(qiáng)的耐酸堿性；pH 9～10時，相對纖維素酶活力降到40%（見圖7）。

圖6 pH對酶活力的影響

圖7 pH對酶穩(wěn)定性的影響

2.6.2 不同溫度對菌株Bacillus amyloliquefaciensH3產(chǎn)CMCase的影響

在確定適合的pH 條件基礎(chǔ)上，纖維素酶發(fā)生反應(yīng)的最適溫度為65 ℃，其酶活力最高為0.60 U/mL（見圖8）。在不同的溫度下，菌液與底物反應(yīng)1 h后，當(dāng)溫度為40～50 ℃時，該酶相對活力在80%左右，穩(wěn)定性強(qiáng)；當(dāng)溫度為50～80 ℃時，酶活性迅速下降（見圖9）。

圖8 溫度對酶活力的影響

圖9 溫度對酶穩(wěn)定性的影響

2.6.3Bacillus amyloliquefaciensH3在不同碳源、氮源條件下的產(chǎn)酶特性（見圖10）

Bacillus amyloliquefaciensH3可以利用秸稈粉、玉米粉、微晶纖維素、苜蓿粉4種碳源，其中以微晶纖維素作為碳源時產(chǎn)酶量最少，而以玉米粉作為碳源時，產(chǎn)酶量最多，可達(dá)1.10 U/mL。在以蛋白胨和酵母粉混合物、1%酵母粉、1%蛋白胨和1%尿素為氮源時，確定以2%蛋白胨和酵母粉混合物作為氮源時，產(chǎn)酶量最高，可達(dá)1.20 U/mL，其余氮源產(chǎn)酶量依次為1.5%蛋白胨和酵母粉混合物、1%酵母粉、1%蛋白胨、1%尿素（見圖10）。

圖10 不同碳、氮源對酶活力的影響

3 討論

纖維素是一種大分子多糖，占植物碳含量50%以上[13]，是微生物重要的碳源之一。作為自然界中廣泛存在、價格低廉的一種可再生型能源，如何充分利用纖維素能源，對緩解資源危機(jī)、環(huán)境污染和飼料能源緊缺具有重大的研究意義。而微生物能夠?qū)Y(jié)構(gòu)復(fù)雜的纖維素進(jìn)行有效降解，因此利用微生物技術(shù)是實現(xiàn)纖維素資源能源化、肥料化的一種有效途徑，也在提高動物采食量和飼料利用率、改善飼用品質(zhì)等方面具有顯著作用[14]。

目前該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于眾多草食性動物胃腸道內(nèi)容物或糞便的篩選中，如豬[15]、牛[16]、雙峰駝[17]和大熊貓[18]等。但是從蒙古馬腸道中分離分解纖維素細(xì)菌的研究鮮見，而蒙古馬耐粗飼料的優(yōu)良特點與其腸道微生物群落組成及多樣性息息相關(guān)。本研究以蒙古馬盲腸內(nèi)容物為試驗材料，分離篩選具有高效降解纖維的解淀粉芽孢桿菌，可為發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)纖維素酶提供菌種來源與試驗依據(jù)。

本試驗采用以CMC-Na為唯一碳源的培養(yǎng)基，使用剛果紅染色法初步分離篩選纖維素分解菌[19]，以纖維素被酶作用后形成的透明水解圈與菌落直徑的比值為依據(jù)，初步確定其中D/d 值大的10 株菌進(jìn)入復(fù)篩。而后進(jìn)一步確認(rèn)菌株的產(chǎn)酶活力，最后選定蒙古馬盲腸內(nèi)纖維素分解菌優(yōu)勢菌株H3（D/d 值為4.8，CMCase 活力為0.60 U/mL）。本試驗菌株H3 通過形態(tài)學(xué)鑒定、標(biāo)準(zhǔn)生理和生化特性鑒定和16S rDNA 序列比對分析發(fā)現(xiàn)，H3 與芽孢桿菌屬的同源性高達(dá)99%，與Bacillus amyloliquefaciens遺傳距離關(guān)系最近。

劉海艷[20]從藏香豬糞便中分離篩出了芽孢桿菌屬，利用BHM 培養(yǎng)基培養(yǎng)和純化后，其酶活力可達(dá)0.92 U/mL；楊偉平等[21]從鵝糞便中鑒定出纖維素降解活力較強(qiáng)的芽孢桿菌屬，其酶活力為0.83 U/mL；Sadhu 等[22]從大象的糞便中分離并篩選出一株芽孢桿菌屬，其酶活力為0.37 U/mL。本試驗篩選出的Bacillus amyloliquefaciensH3 的酶活力（0.60 U/mL）略低于劉海艷等[20]和楊偉平等[21]獲得的芽孢桿菌，高于Sadhu等[22]分離篩選出的芽孢桿菌。

解淀粉芽孢桿菌自然界分布十分廣泛，在土壤、堆肥、動物體內(nèi)和植物表面、青貯玉米秸稈飼料，甚至污水、湖泊的底泥中均可發(fā)現(xiàn)并分離得到，它是一種與枯草芽孢桿菌親緣性很高的細(xì)菌，可合成各類纖維素酶，具有促進(jìn)纖維素資源分解與利用的潛在能力。菌種來源、發(fā)酵培養(yǎng)條件，如pH、溫度、碳源、氮源等因素均可影響纖維素分解菌酶活力[23]，通過分析不同條件Bacillus amyloliquefaciensH3 的酶學(xué)特性，可進(jìn)一步優(yōu)化和提高纖維素酶活力。通過調(diào)整培養(yǎng)基配方及其比例，從而改變解淀粉芽孢桿菌生長活力，也可以導(dǎo)致產(chǎn)纖維素酶的能力有所改變。pH和溫度是影響微生物生長的化學(xué)和物理因素，可對微生物產(chǎn)生的酶活力和穩(wěn)定性有著一定的作用。從耐受能力看，Bacillus amyloliquefaciensH3具有較強(qiáng)的酸堿耐受力，這與王卉等[24]報道的解淀粉芽孢桿菌對酸堿的穩(wěn)定性基本一致；戴秀華等[25]報道的解淀粉芽孢桿菌最適溫度為26 ℃，到52 ℃時菌體幾乎全部死亡。本試驗分離菌株最適溫度為65 ℃，在溫度為40～50 ℃時，該酶活力穩(wěn)定性強(qiáng)，高于戴秀華的文獻(xiàn)報道。纖維素分解菌在發(fā)揮降解或發(fā)酵作用時，含氮源、碳源的物質(zhì)是多樣的，因而研究不同的氮源、碳源對纖維素分解菌酶活力有著一定的影響，尤其在家畜飼喂中對飼料種類的選擇和配比有著深遠(yuǎn)的意義。本試驗對不同氮源研究發(fā)現(xiàn)，Bacillus amyloliquefaciensH3 以2%蛋白胨和酵母粉混合物作為來源時酶活力最高；對碳源的利用中，以玉米粉酶活力最高，玉米粉作為最有價值的碳源，其成本低廉、來源豐富。試驗也進(jìn)一步驗證Bacillus amyloliquefaciensH3 酶活力與碳源的結(jié)構(gòu)有關(guān)系，隨著碳源的粗糙程度升高，其酶活力降低。

4 結(jié)論

本研究從蒙古馬盲腸中篩選并鑒定出一株可有效降解纖維素的解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciensH3，它具有相對較高的纖維素酶活力。該菌株所產(chǎn)生的纖維素酶具有一定的耐酸堿性和熱穩(wěn)定性，有較好的開發(fā)潛力。為進(jìn)一步優(yōu)化纖維素分解菌酶活力提供科學(xué)的參考依據(jù)，為馬源纖維素分解菌和纖維素酶的后續(xù)工業(yè)生產(chǎn)和利用提供基礎(chǔ)。