產(chǎn)毒黃曲霉頡頏菌的篩選及復合菌劑的構(gòu)建

■黎 歡 祁姣姣 彭玉莉 梁嘉旭 秦海嘯 胡文鋒1，*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東 廣州 510642；2.廣東省食品藥品職業(yè)技術(shù)學校，廣東 廣州 510663；3.生物源生物技術(shù)（深圳）股份有限公司，廣東 深圳 518118）

霉菌具有繁殖速度快、孢子數(shù)量大、散布遠等特點，因此農(nóng)作物在其生長、收獲、貯存和運輸加工等過程中的各個環(huán)節(jié)均容易被霉菌污染[1]。霉菌毒素是某些霉菌在食品或飼料里生長所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，對人類和動物的健康造成不同程度的危害[2]。研究表明，全球約有25%的谷物類糧食受到不同程度的霉菌毒素污染。霉菌毒素種類較多，主要有黃曲霉毒素、伏馬毒素、嘔吐毒素、赭曲霉毒、玉米赤霉烯酮毒素等。其中，黃曲霉毒素是毒性最強的一類致癌、致突變、致畸形的霉菌毒素，被世界衛(wèi)生組織癌癥研究機構(gòu)劃為ⅣA 級（Ⅰ類）危險物[3]。目前，已發(fā)現(xiàn)20 多種黃曲霉毒素，其中以AFB1 的毒性最強，毒性為氰化鉀的10 倍，砒霜的68 倍[4]。對黃曲霉毒素的防控方法主要有物理脫毒、化學脫毒和生物脫毒等。

試驗擬從土壤中分離篩選出對產(chǎn)毒黃曲霉具有高效頡頏作用的不產(chǎn)黃曲霉毒素的生防菌株，并初步探究其對黃曲霉頡頏的作用機理，創(chuàng)建高效防毒復合菌群，減少農(nóng)作物在田間感染產(chǎn)毒黃曲霉，為從源頭防控黃曲霉毒素污染奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

產(chǎn)毒菌株：黃曲霉GDMCC3. 18Aspergillus flavus。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDB）、馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基（PDA）。

1.1.3 主要儀器設(shè)備高壓蒸汽滅菌鍋、旋渦混合儀、生化培養(yǎng)箱、低速離心機、雙人單面凈化工作臺。

1.2 不產(chǎn)黃曲霉毒素的霉菌的分離純化

參照張初署等[5]土壤樣品采集方法采樣，將土壤樣品采用稀釋涂布平板法進行分離[6-7]，具體方法如下：稱取10 g土壤樣品于90 mL滅菌生理鹽水中充分振蕩，制成10-1土壤懸液。采用10 倍系列稀釋方法，依次制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6土壤懸液。分別取10-3、10-4、10-5、10-6梯度的土壤懸液100 μL 涂布于PDA 平板培養(yǎng)基上，每處理重復2 次，28 ℃黑暗條件下倒置培養(yǎng)5 d。挑取生長速度較快的菌落邊緣的菌絲，接種于新的PDA平板培養(yǎng)基上，重復3～4次，以得到純化的霉菌，4 ℃保存?zhèn)溆肹8]。

將純化菌株培養(yǎng)至第3 d的平板置于波長365 nm紫外燈下照射，觀察菌落周圍的培養(yǎng)基是否有藍色或黃色熒光。若有熒光且較強，則舍去。若熒光較弱或無熒光，菌株繼續(xù)培養(yǎng)，次日重復上述操作，直至第7 d[9]。

1.3 產(chǎn)毒黃曲霉頡頏菌的篩選

采用平板對峙法：將產(chǎn)毒黃曲霉接種于PDA 平板培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)3 d。取直徑約為5 mm 的菌塊接種于PDA平板培養(yǎng)基上，菌塊距培養(yǎng)基中心10～20 mm，在距產(chǎn)毒黃曲霉菌塊約40 mm處放置初篩菌新鮮菌株菌塊，以在PDA 平板中央接種約5 mm 的產(chǎn)毒黃曲霉菌塊為對照組，28 ℃培養(yǎng)7 d，每處理重復2 次。觀察接種3、5、7 d產(chǎn)毒黃曲霉菌與頡頏菌的生長狀況[10]。利用CAD軟件對培養(yǎng)至第7 d的對峙結(jié)果計算抑制率。

頡頏菌對產(chǎn)毒黃曲霉的抑制率（%）=（對照產(chǎn)毒黃曲霉的生長面積-對峙培養(yǎng)產(chǎn)毒黃曲霉生長面積）/對照產(chǎn)毒黃曲霉生長面積×100。

1.4 初篩菌的鑒定

1.4.1 形態(tài)學鑒定

待初篩菌菌絲長成菌落后，采用透明膠帶法[11]制成臨時裝片，于光學顯微鏡下觀察菌絲、孢子等形態(tài)。對照真菌鑒定手冊對初篩菌進行初步鑒定[12-13]。

1.4.2 分子生物學鑒定

對產(chǎn)毒黃曲霉抑制率最高的初篩菌，通過ITS 基因（ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）序列進行分子鑒定[14]。必要時將該菌株進行保種。

1.5 初篩菌發(fā)酵液對產(chǎn)毒黃曲霉生長的影響

選取生長速度快、抑制效果較好的4株霉菌，編號為A-1、A-2、F-501和Q-281分別接種于PDA平板培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)3 d?；罨蟮?株霉菌分別接種于含有50 mL PDB 培養(yǎng)基的三角瓶中，28 ℃、180 r/min搖床避光培養(yǎng)3 d。取發(fā)酵液于3 500 r/min 離心5 min，獲得發(fā)酵上清液，保存?zhèn)溆谩?/p>

用接種環(huán)挑取少許產(chǎn)毒黃曲霉孢子于1 mL無菌水中，充分振蕩，制成孢子懸液。移取500 μL孢子懸液于100 mL約45 ℃PDA培養(yǎng)基中，充分混勻。移取20 mL PDA 培養(yǎng)基于滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)，充分凝固后，移取5 mL含黃曲霉孢子的PDA培養(yǎng)基于底層平板上迅速鋪平，待凝固。每個平板放置4 個牛津杯，10 min后分別加入4 株菌株的發(fā)酵液，加液量與杯口水平，每處理重復2次。28 ℃培養(yǎng)3 d后觀察產(chǎn)毒黃曲霉受抑制的情況[15]。

1.6 初篩菌的相互作用

處理方法如1.5 所述，28 ℃培養(yǎng)3 d 后觀察各菌株之間的相互作用效果。

1.7 復合菌劑的構(gòu)建

依據(jù)初篩菌生長特性及彼此之間相互作用等因素，確定3 株菌株制備復合菌劑。采用L9（43）正交試驗，以菌株A-1 孢子懸液（A）、菌株A-2 孢子懸液（B）、菌株Q-281孢子懸液（C）為考察因素，每個因素下設(shè)置3個水平，以對產(chǎn)毒黃曲霉的抑制率為考核指標，進行復合菌劑配方的構(gòu)建，具體正交試驗因素及水平如表1所示。操作方法如下：

表1 正交試驗因素水平表

將3 株菌株及產(chǎn)毒黃曲霉分別接種到PDA 斜面試管培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)5～7 d。分別向試管中加入5 mL無菌水，將霉菌孢子刮下，倒入裝有無菌水的三角瓶，置于搖床振蕩1.5 h[16]。血球計數(shù)板計數(shù)孢子數(shù)，用無菌水將其稀釋到所需濃度，備用。

1.8 復合菌劑對產(chǎn)毒黃曲霉產(chǎn)毒的影響

稱取完整無破損的玉米粒30 g 置于三角瓶中，121 ℃滅菌30 min。向三角瓶中加入300 μL 最優(yōu)復合菌劑及300 μL 1×105個/mL 的產(chǎn)毒黃曲霉孢子懸液，輕輕搖晃，使孢子懸液覆蓋到玉米粒上。以三角瓶中加入300 μL 無菌水及300 μL 1×105個/mL 的產(chǎn)毒黃曲霉孢子懸液為對照組，每處理重復2 次，并于28 ℃，黑暗條件下培養(yǎng)14 d。試驗結(jié)束后，將玉米粒于121 ℃滅菌30 min。采用免疫熒光層析法測定其AFB1的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 初篩菌產(chǎn)黃曲霉毒素能力的快速檢測

從土壤樣品篩選分離得到的4株菌株A-1、A-2、F-501和Q-281在PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)的第3 d至第7 d，在365 nm紫外燈照射下菌落周邊的培養(yǎng)基均無熒光。

2.2 平板頡頏對峙試驗（見表2、圖1）

圖1 初篩菌與產(chǎn)毒黃曲霉對峙結(jié)果

表2 初篩菌株對產(chǎn)毒黃曲霉生長的抑制率(%)

通過平板對峙測定，分離得到的4株霉菌均對產(chǎn)毒黃曲霉的生長具有一定的頡頏能力。在對峙3 d后，分離菌株的生長速度明顯超過產(chǎn)毒黃曲霉。A-1、A-2、F-501 和Q-281 對產(chǎn)毒黃曲霉的抑制率分別為51%、66%、61%和53%。

2.3 初篩菌的鑒定（見表3、圖2）

圖2 初篩菌菌株形態(tài)特征及鏡檢圖

表3 初篩菌的形態(tài)特征

4 株初篩菌的形態(tài)特征等各不相同，其形態(tài)特征分別似木霉、曲霉和青霉。對產(chǎn)毒黃曲霉生長抑制率最高的菌株為A-2，ITS rDNA 擴增序列長度為577 bp，將A-2的序列結(jié)果通過與核酸序列庫中的序列進行對比發(fā)現(xiàn)，A-2與綠木霉的同源性為100%，結(jié)合其形態(tài)學特點，確定A-2菌為綠木霉。

2.4 初篩菌發(fā)酵液對產(chǎn)毒黃曲霉生長的作用（見表4）

表4 初篩菌株發(fā)酵液對產(chǎn)毒黃曲霉的生長影響

A-1的發(fā)酵液對產(chǎn)毒黃曲霉的生長有抑制效果，抑菌圈直徑為18.00 mm，其余4株菌株的發(fā)酵液對產(chǎn)毒黃曲霉沒有抑制效果。

2.5 初篩菌之間相互作用（見表5）

表5 初篩菌發(fā)酵液對其余初篩菌生長的影響

A-1發(fā)酵液對Q-281的生長有抑制作用，抑菌圈直徑為8.12 mm。A-2發(fā)酵液對A-1和F-501的生長有抑制作用，抑菌圈直徑均為10.52 mm。F-501發(fā)酵液對A-1的生長有抑制作用，抑菌圈直徑為12.22 mm。

2.6 復合菌劑對產(chǎn)毒黃曲霉生長的抑制作用（見表6、圖3）

圖3 復合菌劑與產(chǎn)毒黃曲霉的對峙結(jié)果

表6 正交試驗表及結(jié)果

9 組試驗結(jié)果表明，復合菌群對產(chǎn)毒黃曲霉的抑制率均大于等于63%，7 組試驗組比單一菌劑作用產(chǎn)毒黃曲霉的抑制率高，其中A1B3C3組合對產(chǎn)毒黃曲霉生長的抑制作用最強，抑制率達到73%。

2.7 復合菌劑對產(chǎn)毒黃曲霉產(chǎn)毒的影響（見表7）

由表7 可知，產(chǎn)毒黃曲霉在玉米培養(yǎng)基上培養(yǎng)，AFB1 含量為4.85 ng/g；在此基礎(chǔ)上添加復合菌劑，AFB1含量為1.23 ng/g，對AFB1的抑制率為75%。

表7 復合菌劑在玉米培養(yǎng)基上抑制AFB1生成的效果

3 討論

本研究從土壤樣品中分離得到4 株對產(chǎn)毒黃曲霉有明顯抑制作用的不產(chǎn)毒霉菌，抑制效果依次為A-2（66%）＞F-501（61%）＞Q-281（53%）＞A-1（51%）。在平板對峙中，初篩菌F-501、Q-281與產(chǎn)毒黃曲霉之間沒有明顯的界限，甚至是初篩菌覆蓋了產(chǎn)毒黃曲霉，A-1、A-2 與產(chǎn)毒黃曲霉之間有一條透明帶，猜測可能是因為初篩菌的分泌物對產(chǎn)毒黃曲霉生長有抑制作用。徐楊玉等[17]研究發(fā)現(xiàn)，木霉能產(chǎn)生多種抗生素、酶等頡頏性物質(zhì)抑制病原真菌。但在初篩菌發(fā)酵液對產(chǎn)毒黃曲霉生長的抑制試驗中，A-2的發(fā)酵液對產(chǎn)毒黃曲霉的生長沒有抑制作用，可能是因為A-2在液體培養(yǎng)中的接種量較少，以至發(fā)酵液中的活性物質(zhì)少，尚未達到抑制產(chǎn)毒黃曲霉生長的最低下限。菌株A-1、A-2可能除了與產(chǎn)毒黃曲霉競爭空間營養(yǎng)外，其分泌物對產(chǎn)毒黃曲霉生長也具有抑制作用。其余2 株初篩菌可能是在生長營養(yǎng)空間上對產(chǎn)毒黃曲霉進行抑制作用。

本研究還探究了分離菌之間的相互作用，這為構(gòu)建更高效防毒的復合功能菌劑提供了一定的理論支持。菌株A-1 發(fā)酵液對產(chǎn)毒黃曲霉有較強的抑制作用，將A-1列入復合菌劑配方中。菌株Q-281發(fā)酵液對其余初篩菌沒有抑制作用，將Q-281列入復合菌劑配方中。菌株F-501 發(fā)酵液對A-1 有較強的抑制作用，舍去F-501。菌株A-1 與菌株A-2 為同一土壤樣品中篩選出來的霉菌，為使得所配復合菌劑能在相互制約動態(tài)平衡下，對產(chǎn)毒黃曲霉生長有最大抑制效果，故最終選取A-1、A-2、Q-281 3 株初篩菌創(chuàng)建復合菌劑。從平板對峙結(jié)果來看，有7組復合配方對產(chǎn)毒黃曲霉的生長抑制效果比單菌株A-2 的抑制效果要好。在玉米等谷物中，加入最優(yōu)復合菌劑，AFB1含量由4.85 ng/g 下降為1.23 ng/g，抑制率達75%。由此可見，復合菌劑能高效抑制產(chǎn)毒黃曲霉的生長和AFB1的生成。

谷物等農(nóng)作物被黃曲霉及其毒素污染嚴重，從源頭上有效抑制產(chǎn)毒黃曲霉生長及其產(chǎn)毒已成為研究熱點。而在黃曲霉毒素的生物防治方法中，探究單一菌株抑制產(chǎn)毒黃曲霉生長及產(chǎn)毒的研究較多，但是相關(guān)復合菌劑的研究較少。該復合菌劑中包含木霉及青霉，木霉在生物防治手段中已被廣泛研究及利用。本復合菌劑配伍后，是否會有其他毒素的生成，還需要進一步研究。而周璞等[18]發(fā)現(xiàn)，利用干酪乳桿菌、枯草芽孢桿菌及產(chǎn)阮假絲酵母制備復合益生菌對AFB1 的降解率為49.58%，而本研究中構(gòu)建的復合菌劑對產(chǎn)毒黃曲霉的抑制率達75%。若在此基礎(chǔ)上添加某些益生菌，是否能使復合菌劑更加穩(wěn)定可靠，更大效果地降解AFB1，并將其余可能產(chǎn)生的毒素一并吸附降解，值得深入探討。

4 結(jié)論

本研究分離得到的4 株對產(chǎn)毒黃曲霉生長具有抑制作用的霉菌，其抑制率均大于50%。經(jīng)鑒定其分別為木霉（A-1、A-2）、曲霉（F-501）、青霉（Q-281）。由A-1、A-2、Q-281孢子濃度分別為1×104、1×106、1×106個/mL 組建的復合菌劑，對AFB1 生成的抑制率高達75%，抑制效果顯著高于單一菌劑。