黃羽肉雞日糧中添加膽汁酸鹽對腸道黏膜轉(zhuǎn)運蛋白及消化酶的影響

■張振明 賀海蓮 王靜鴿 李鵬祥 劉雄杰 郭家卉 丁保安

（青海大學農(nóng)牧學院，青海 西寧 810016）

膽汁酸（BAs）是由肝臟中獨有的膽固醇合成的，是膽汁中特異性和定量的重要有機成分[1]，有助于促進脂質(zhì)和脂溶性維生素的吸收和轉(zhuǎn)運。禽類膽汁酸主要由去氧膽酸和膽酸組成[2]。近年來，膽汁酸在畜牧業(yè)中的積極作用已有報道，在日糧中添加BAs可以提高肉雞的生產(chǎn)性能，有效提高飼料養(yǎng)分利用率，胴體品質(zhì)得到提高[3-4]。膽汁酸作為一種新型的飼料添加劑，被廣泛應(yīng)用于動物飼料中，以促進脂肪的吸收，是哺乳動物膽固醇分解代謝的主要途徑。但是禽類有關(guān)膽汁酸對脂質(zhì)代謝的研究報道很少。除了作為促進脂質(zhì)吸收的乳化劑，還發(fā)現(xiàn)膽汁酸作為信號分子在機體的多種代謝過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，而且在糖脂代謝中也同樣發(fā)揮著不可或缺的作用[5-6]。固醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白1（SREBF1）屬于核轉(zhuǎn)錄因子家族，是動物體內(nèi)脂肪合成的一個極其重要的調(diào)節(jié)因子，在脂肪酸合成過程中發(fā)揮著重要的作用，從而控制體內(nèi)脂肪合成[7]。脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白4（FATP4）存在于腸絨毛細胞中，被認為是調(diào)控腸道細胞吸收脂肪酸的重要因子[8]。乙酰輔酶A 羧化酶（ACC）是脂肪酸合成的主要限速酶，對脂肪酸的代謝調(diào)控有著重要的生物學作用[9]。脂肪酸合成酶（FAS）對動物體脂肪的沉積性狀起到了重要的調(diào)節(jié)作用，是動物體脂肪酸合成的關(guān)鍵酶之一[10]。本試驗以黃羽肉雞為研究對象，在黃羽肉仔雞日糧中添加不同水平膽汁酸鹽，探究其對腸道黏膜中營養(yǎng)轉(zhuǎn)運蛋白和消化酶的基因表達的影響，以期為青海農(nóng)業(yè)區(qū)黃羽肉雞的養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試驗設(shè)計

選擇同批次孵化、體格健康良好的420 只1 日齡黃羽肉雛雞（紅羽王）為試驗動物。采用單因素試驗設(shè)計，將420只雛雞分為7個組（每組4個重復），每個重復15只雞，試驗1組為陰性對照組，飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗2 組為陽性對照組，在基礎(chǔ)日糧上添加0.02%泰樂菌素代替麩皮，試驗3組、試驗4組、試驗5組、試驗6 組、試驗7 組分別添加0.015%、0.025%、0.035%、0.045%、0.055%的膽汁酸代替麩皮。進行為期28 d的飼養(yǎng)試驗。

1.2 試驗日糧與營養(yǎng)水平

試驗日糧組成與營養(yǎng)水平見表1。膽汁酸鹽為混合型飼料添加劑，購自山東某有限公司，有效成分為膽汁酸，含量≥30%。泰樂菌素購自某生物藥業(yè)有限公司，純度為10%。

表1 基礎(chǔ)日糧組成和營養(yǎng)水平（風干基礎(chǔ)）

1.3 飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)期間為人工喂料，自由采食和飲水，第1 周每天24 h 光照，之后以0.5 h/d 遞減直至第26 d，隨后每天保持17 h 光照。第1～7 d 室溫控制在33～35 ℃，第8～14 d室溫控制在29.5～32.5 ℃，第15～28 d室溫控制在24～29 ℃。濕度為60%～70%，按照常規(guī)免疫程序進行定期消毒，打掃雞舍衛(wèi)生。飼養(yǎng)試驗在青海省湟中縣常綠牧業(yè)公司養(yǎng)雞場進行。

1.4 樣品采集

飼養(yǎng)至第28 d每個重復隨機選取1只雞，頸部放血致死，宰前12 h不采食。采集十二指腸、空腸、回腸和肝臟。樣品都置于2.0 mL effendoff管，然后液氮速凍，6 h內(nèi)放于-80 ℃冰箱長期冷凍保存。

1.5 熒光定量PCR

1.5.1 樣品總RNA提取

采用Trizol 一步法提取總RNA，利用核酸蛋白儀器檢測RNA的濃度和純度，檢測是否合格，進行后續(xù)試驗。

1.5.2 反轉(zhuǎn)錄

反轉(zhuǎn)錄的體系為20 μL（見表2），整個操作過程在冰盒上完成，樣品與試劑混勻后于GenAmp PCR System 9700 儀器37 ℃反應(yīng)30 min，85 ℃變性15 s，4 ℃保存。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于-20 ℃保存使用。

表2 反轉(zhuǎn)錄體系

1.5.3 目的基因引物設(shè)計及qPCR反應(yīng)體系

PCR引物來自參考文獻[11-12]，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表3。

表3 目的基因SREBF1、FATP4、FAS、ACC和內(nèi)參基因β-actin引物序列

采用SYBR Green 實時熒光定量PCR 方法，以βactin作為內(nèi)參基因，對SREBF1、FATP4、FAS、ACC 進行相對定量分析。qRT-PCR 反應(yīng)在BIO-RAD CFX96 Touch上進行。

PCR 反應(yīng)體系：采用單管法進行PCR 擴增，以混合樣（待測樣品等比例混合）對PCR反應(yīng)條件，循環(huán)數(shù)以及目的基因SREBF1、FATP4、FAS、ACC和內(nèi)參基因β-actin的引物濃度等進行優(yōu)化。各目的基因qPCR條件如下：在20 μL的反應(yīng)體系中含有2 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，10 μL TB Green Premix Ex Taq，6.8 μL ddH2O，上、下游引物各0.6 μL。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性15 s，58 ℃退火30 s，40 個循環(huán)。每個待測樣品設(shè)置3個平行，取3個Ct值的平均值作為后續(xù)的公式計算。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

數(shù)據(jù)采用Excel 2019 進行整理，采用2-ΔΔCt方法（Livak 法）計算目的基因的相對表達量，用SPSS 22.0 General Liner Model 的Univariate 方法進行雙因素方差分析，對F檢驗達到顯著水平的因子進行LSD法多重比較，分析結(jié)果包括膽汁酸鹽水平、腸段以及“膽汁酸鹽水平×腸段”互作三個影響模型。不同腸段的SREBF1、FATP4、FAS、ACC mRNA表達的發(fā)育變化用ANOVA 進行單因子方差分析，用Duncan’s 法進行多重比較檢驗，以P＜0.05 作為顯著性差異判斷標準，結(jié)果均以“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 膽汁酸鹽對黃羽肉雞SREBF1 mRNA 表達量的影響（見表4）

由表4 可知，隨著膽汁酸鹽水平的遞增，十二指腸和回腸SREBF1 mRNA 相對表達量呈先增后減再增的趨勢。在十二指腸中，0.055%膽汁酸鹽組SREBF1 mRNA 相對表達量最高，且顯著高于其余各組（P＜0.05）；在空腸中，0.055%膽汁酸鹽組表達量顯著高于其余各組（P＜0.05）；在回腸中，0.055%膽汁酸鹽組表達量顯著大于其余各組（P＜0.05）。肝臟中，0.035%和0.055%膽汁酸鹽組表達量顯著大于其余各組（P＜0.05）。

表4 黃羽肉雞28日齡雛雞SREBF1 mRNA的相對表達量

2.2 膽汁酸鹽對黃羽肉雞FATP4 mRNA表達量的影響（見表5）

由表5 可知，隨著膽汁酸鹽水平的遞增，回腸和肝臟FATP4 mRNA 相對表達量呈先減后增的趨勢。在十二指腸中，0.055%膽汁酸鹽組和陽性對照組FATP4 mRNA相對表達量較高，且顯著高于其余各組（P＜0.05）；在空腸中，0.015%、0.045%膽汁酸鹽組和陰性對照組的相對表達量高于其余各組（P＜0.05）；在回腸中，0.055%膽汁酸鹽組的相對表達量顯著大于其余各組（P＜0.05）；在肝臟中，0.045%和0.055%膽汁酸組的相對表達量顯著大于其余各組（P＜0.05）。

表5 黃羽肉雞28日齡雛雞FATP4 mRNA的相對表達量

2.3 膽汁酸鹽對黃羽肉雞FAS mRNA 表達量的影響（見表6）

由表6 可知，隨著膽汁酸鹽水平的遞增，回腸FAS mRNA相對表達量呈逐漸增加的趨勢。在十二指腸中，0.035%膽汁酸鹽組FASmRNA相對表達量較高，且顯著高于其余各組（P＜0.05）；在空腸中，0.015%膽汁酸鹽組相對表達量顯著高于其余各組（P＜0.05）；在回腸中，0.055%膽汁酸鹽組相對表達量顯著高于其余各組（P＜0.05）；在肝臟中，0.015%、0.035%和0.055%膽汁酸鹽組的相對表達量顯著高于其余各組（P＜0.05）。

表6 黃羽肉雞28日齡雛雞FAS mRNA的相對表達量

2.4 膽汁酸鹽對黃羽肉雞ACC mRNA表達量的影響（見表7）

由表7 可知，隨著膽汁酸鹽水平的遞增，十二指腸和空腸ACC mRNA 相對表達量呈先增后減再增的趨勢。在十二指腸中，0.055%膽汁酸鹽組ACC mRNA相對表達量較高，且顯著高于其余各組（P＜0.05）；在空腸中，0.055%膽汁酸鹽組相對表達量顯著高于其余各組（P＜0.05）；在回腸中，0.055%膽汁酸鹽組相對表達量顯著高于其余各組（P＜0.05）；在肝臟中，0.015%膽汁酸鹽組相對表達量顯著高于其余各組（P＜0.05）。

表7 黃羽肉雞28日齡雛雞ACC mRNA的相對表達量

2.5 腸段與不同水平膽汁酸鹽對SREBF1、FATP4、FAS、ACC mRNA相對表達量的影響（見表8）

表8 腸段、膽汁酸鹽水平對SREBF1、FATP4、FAS、ACC mRNA的相對表達量的影響

由表8可知，SREBF1 mRNA的相對表達量回腸較高，其次是空腸和肝臟，十二指腸最低；SREBF1 mRNA的相對表達量回腸顯著高于十二指腸、空腸和肝臟（P＜0.05），空腸和肝臟顯著高于十二指腸（P＜0.05）。FATP4 mRNA 的相對表達量十二指腸、空腸較高，其次是肝臟和回腸；十二指腸和空腸顯著高于回腸和肝臟（P＜0.05），回腸和肝臟之間差異不顯著（P＞0.05）。FAS mRNA 的相對表達量肝臟較高，其次是回腸，之后是空腸，十二指腸最低；肝臟、回腸都顯著高于十二指腸、空腸（P＜0.05），十二指腸與空腸之間差異不顯著（P＞0.05）。ACC mRNA的相對表達量肝臟較高，十二指腸、空腸次之，回腸最低；肝臟顯著高于十二指腸、空腸和回腸（P＜0.05），但十二指腸和空腸之間差異不顯著（P＞0.05）。

黃羽肉雞十二指腸、空腸、回腸和肝臟SREBF1、FATP4、FAS、ACC mRNA的相對表達量均存在極顯著差異（P＜0.01）；不同膽汁酸鹽添加水平黃羽肉雞腸道SREBF1、FATP4、FAS、ACC mRNA相對表達量存在極顯著差異（P＜0.01）；SREBF1、FATP4、FAS、ACC mRNA的相對表達量均存在“腸段×膽汁酸鹽水平”的互作效應(yīng)（P＜0.01）。

3 討論

3.1 雛雞腸道SREBF1 mRNA 的表達差異與不同水平膽汁酸鹽下的變化

動物采食后，膽汁酸進入小腸，進行乳化脂肪。乳化后的脂肪被水解為甘油和脂肪酸，膽汁酸和脂肪酸形成的復合物被小腸黏膜所吸收，之后與脂肪酸分離，經(jīng)門靜脈進入肝臟。之后游離型膽汁酸再轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)合型膽汁酸，與膽汁一起重新進入腸道，這一過程稱為膽汁酸的肝腸循環(huán)[13]。固醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白（SREBP）是一種屬于基本螺旋-環(huán)-螺旋亮氨酸鏈家族的轉(zhuǎn)錄因子，編碼SREBP-1a 和SREBP-1c，兩者都可以調(diào)節(jié)與脂質(zhì)代謝相關(guān)的基因表達，尤其是脂肪生成基因[14]。有報道說，一旦SREBP-1a被激活，SREBP-1b會增強膽固醇和脂肪酸合成相關(guān)基因的表達，從而達到預(yù)防脂肪肝的發(fā)生[15-16]。Yin等[17]研究了在日糧中添加膽汁酸補充劑來改善熱應(yīng)激肉雞的生長性能和脂質(zhì)代謝，得出了日糧中添加膽汁酸降低了三酰甘油和肝臟SREBP-1c mRNA的表達結(jié)論。Kamisako等[18]研究在小鼠飼料中添加膽固醇、膽汁酸鹽或消膽胺對與膽固醇和膽汁酸代謝相關(guān)的腸道m(xù)RNA 調(diào)節(jié)的影響中得出膽固醇組和膽汁酸鹽組腸道SREBP-1c mRNA表達顯著增加。消膽胺組腸道SREBP-1c mRNA 表達明顯降低。而本試驗中得出膽汁酸鹽組腸道SREBF1 mRNA 表達顯著增加。這與Kamisako 等的結(jié)果有相似之處。Ge 等[11]研究發(fā)現(xiàn)在肉雞日糧中補充膽汁酸可有效改善SREBP-1 mRNA 的表達，從而降低脂肪酸的合成。陸江等[19]研究發(fā)現(xiàn)在產(chǎn)蛋后期日糧中添加膽汁酸可以調(diào)節(jié)SREBP1c mRNA 的表達，抑制脂肪酸的從頭合成，促進脂肪酸β-氧化，從而降低蛋雞血液和肝中的TG，以0.06 g/kg 添加劑量為宜。SREBF1 mRNA的相對表達量隨著膽汁酸鹽水平的遞增，呈現(xiàn)一種較為規(guī)律的變化，且最適添加水平范圍為0.055%。根據(jù)這一結(jié)果可以在分子水平方面推測出，對家禽膽汁酸鹽添加水平的調(diào)節(jié)，滿足其對營養(yǎng)物質(zhì)的調(diào)控具有一定價值。

3.2 雛雞腸道FATP4 mRNA的表達差異與不同水平膽汁酸鹽下的變化

脂肪酸是動物體生命活動所必需的能量物質(zhì)，在動物體內(nèi)的吸收、轉(zhuǎn)運和代謝是一個比較復雜的過程。需要通過腸道上皮細胞來完成[20]。FATPs對長鏈脂肪酸的吸收和代謝發(fā)揮著重要的作用，F(xiàn)ATP4是動物腸道中唯一存在的FATPs家族成員，存在于腸絨毛細胞中，是調(diào)控腸道細胞吸收脂肪酸的重要調(diào)控因子[21-22]。王彥[23]研究了FATP4基因在雞上的表達模式并進行了單核苷酸多態(tài)性（SNP）分析，發(fā)現(xiàn)FATP4基因在不同雞的品種間表達差異不顯著，F(xiàn)ATP4基因型與雞的腹脂率、腿肌率、凈膛重等屠宰性狀具有顯著的正相關(guān)。羅涓[24]試驗發(fā)現(xiàn)FATP4 基因在不同組織中的表達豐度從高到低依次為：腿肌、肝臟、皮脂、腸道、腹脂。FATP4在腿肌中的表達量極顯著高于其他各組織。FATP4 基因在各個組織中的表達量基本上呈現(xiàn)出肌肉、胸肌和腿肌中最多，在脂肪組織腹脂和皮脂中最少的規(guī)律，在肌肉組織和心臟中的基因表達量差異不顯著。肝、腸、腹脂、皮脂中的基因表達量差異不顯著。不同品種間的表達差異不顯著。

本試驗結(jié)果表明FATP4 mRNA 表達量在空腸和十二指腸中最高，其次是回腸和肝臟。這與張愛華[12]研究結(jié)果一致，表明雛雞腸道吸收轉(zhuǎn)運脂肪酸的主要部位是在小腸前端。在不同水平膽汁酸鹽水平遞增的情況下，F(xiàn)ATP4 mRNA的相對表達量在0.055%水平最高，且顯著高于0.015%、0.025%、0.035%、0.045%水平。在本試驗中發(fā)現(xiàn)添加不同水平膽汁酸鹽可以調(diào)劑小腸和肝臟中FATP4 mRNA的表達量，這可能與膽汁酸鹽的作用有關(guān)。

3.3 雛雞腸道FAS和ACC mRNA的表達差異與不同水平膽汁酸鹽下的變化

FAS和ACC是脂肪酸合成途徑中的關(guān)鍵限速酶，在脂肪合成代謝過程中發(fā)揮著不可或缺的作用，其活性和表達可以調(diào)節(jié)脂肪酸的合成，從而影響脂肪代謝及體脂沉積[25]。其中乙酰輔酶A羧化酶（ACC）是催化脂肪酸合成的第一步，脂肪酸合成酶（FAS）是參與合成三酰甘油的關(guān)鍵酶[26]。日糧中的營養(yǎng)成分可以影響編碼這些酶的基因的表達，從而調(diào)節(jié)脂肪沉積。陸江等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在產(chǎn)蛋后期日糧中添加合適的膽汁酸，可以調(diào)控FAS mRNA 的表達，從而降低脂肪酸的合成，減少脂肪沉積。田衛(wèi)華等[25]研究表明在產(chǎn)蛋期母雞飼糧中添加8%水平的大豆油能夠明顯提高FAS、ACC mRNA 表達水平，在肝臟組織中表達量最高。這與本試驗結(jié)果有相似之處，F(xiàn)AS mRNA的表達量在肝臟中最高，回腸次之，十二指腸最低和空腸。Ge 等[11]研究發(fā)現(xiàn)在肉雞日糧中補充膽汁酸可以改善FAS和ACC mRNA的表達，從而起到促進脂肪分解代謝和抑制脂肪合成的作用。Piekarski等[3]研究發(fā)現(xiàn)在日糧中添加0.5%純化的膽汁酸可以有效調(diào)節(jié)肉雞組織中ACC-1c 和FAS mRNA 的表達水平，從而抑制了采食量，并且降低肉雞體重。葛曉可等[27]發(fā)現(xiàn)在肉雞日糧中添加膽汁酸可以使FAS mRNA 的表達量得到調(diào)控，得出膽汁酸可以通過抑制脂肪酸的合成及轉(zhuǎn)運，并促進脂肪酸分解，降低肉雞腹脂率及肝臟的TG水平，緩解肝臟損傷并維持其脂代謝的穩(wěn)定性。

隨著膽汁酸鹽水平的遞增，F(xiàn)ASmRNA 的相對表達量在0.055%水平下極顯著高于其余水平。0.015%水平與0.035%水平顯著高于另兩個水平，另兩個水平差異不顯著。而ACC mRNA 的相對表達量則在0.015%、0.055%水平下顯著高于其他水平，0.055%水平表達量最高且大于0.015%水平。這一情況與陸江等[19]得出的最適膽汁酸鹽水平為0.06%相比較，可以推測出日糧0.055%水平范圍的膽汁酸對于雛雞脂肪酸吸收轉(zhuǎn)運、生長發(fā)育有較好影響。

4 結(jié)論

①28 日齡雛雞SREBF1 mRNA 的相對表達量回腸較高，其次是肝臟和空腸，十二指腸最低；FATP4 mRNA 的相對表達量十二指腸、空腸較高，其次是肝臟和回腸；FAS mRNA 的相對表達量肝臟較高，其次回腸，之后空腸，十二指腸最低；ACC mRNA的相對表達量肝臟較高，十二指腸、空腸次之，回腸最低。腸道和肝臟中mRNA 的表達，不僅與膽汁酸代謝有關(guān)，而且與脂質(zhì)代謝有關(guān)。

②28日齡雛雞SREBF1、FATP4、FAS、ACC mRNA的相對表達量存在“腸段×膽汁酸鹽水平”互作效應(yīng)。

③本試驗得出，黃羽肉雞雛雞日糧添加0.055%左右水平的膽汁酸鹽對于雛雞腸道整體營養(yǎng)轉(zhuǎn)運蛋白及消化酶的基因表達影響最佳，因此推測在日糧中添加不同水平膽汁酸可以調(diào)節(jié)脂肪代謝相關(guān)基因的表達，以促進脂肪分解代謝和抑制脂肪合成，這在改善肉雞脂肪沉積方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。