間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體改善心肌纖維化的研究進(jìn)展

楊珂欣 李星輝，2 肖晨朦 姚曉濤 林萌 蔡佳

(1.蘭州大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省人民醫(yī)院心內(nèi)一科，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅省中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；4.寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏 銀川 750000)

心肌纖維化是一個(gè)持續(xù)進(jìn)展且不可逆的病理過程，特征是心臟成纖維細(xì)胞過度增殖和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白沉積，引起進(jìn)行性心臟舒縮功能障礙，導(dǎo)致慢性心力衰竭、心律失常和心臟猝死等心血管事件，可影響心血管疾病患者臨床預(yù)后。心肌纖維化的機(jī)制復(fù)雜多樣，尚未完全被了解，迫切需提升應(yīng)對(duì)心肌纖維化導(dǎo)致心肌功能損傷的策略，以降低心血管疾病患者的發(fā)病率和病死率。研究顯示間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)來源的外泌體(exosome，Exo)可通過內(nèi)部的miRNA將信息傳遞至靶細(xì)胞參與并調(diào)節(jié)心肌纖維化的病理形成過程，現(xiàn)就此方面的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，探討間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體(mesenchymal stem cell-derived exosome，MSC-Exo)在心血管疾病中的潛在作用。

1 MSC

MSC是一種多能干細(xì)胞，因其多向分化潛能、自我更新、免疫調(diào)控、易于分離且穩(wěn)定性強(qiáng)等特性，MSC療法已作為一種細(xì)胞替代治療方法被廣泛應(yīng)用于多種疾病，包括心肌梗死、心力衰竭等。前期的研究顯示，MSC移植能顯著延緩心肌梗死后心室重塑，改善心臟功能[1]，但MSC的臨床應(yīng)用仍存在許多挑戰(zhàn)。以往研究[2]顯示，在小鼠移植的心臟干細(xì)胞中0.003%能直接分化為新生心肌細(xì)胞。在動(dòng)物模型中，誘導(dǎo)MSC分化為心肌細(xì)胞，即心臟再生的同時(shí)，存在誘導(dǎo)畸胎瘤形成的可能，且MSC來源的心肌細(xì)胞成熟和整合不足可誘導(dǎo)移植后的心律失常。

2 Exo

細(xì)胞內(nèi)陷生成初始階段內(nèi)體，經(jīng)過相關(guān)蛋白調(diào)控，其出芽形成腔內(nèi)多發(fā)小囊泡構(gòu)成多囊體，后者在Rab酶(targeting GTPase)的調(diào)節(jié)下與細(xì)胞膜融合，其內(nèi)的小囊泡通過胞吐過程釋放到胞外，即Exo。Exo膜具有磷脂雙層結(jié)構(gòu)，為Exo提供結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。膜上有主要組織相容性復(fù)合體表面抗原蛋白，LAMP1、LAMP2、PGRL等跨膜蛋白，Rab、GTPases、annexins膜轉(zhuǎn)運(yùn)融合蛋白，Chol、SM、PC、ceramide等脂質(zhì)筏[3]。Exo含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等多種生物大分子，其攜帶的內(nèi)容與Exo來源母細(xì)胞相似。Exo是異質(zhì)性群體，組成復(fù)雜，來源不同細(xì)胞的Exo成分不同，Exo內(nèi)含物的種類和數(shù)量有所差異，但其作用于靶細(xì)胞的方式基本相同，主要包括三大類：(1)識(shí)別靶細(xì)胞表面的特異性受體，并與之結(jié)合，通過受體-配體相互作用，激活或抑制靶細(xì)胞傳導(dǎo)通路；(2)直接與靶細(xì)胞的質(zhì)膜相互融合，并整合mRNA、miRNA、siRNA等；(3)通過胞吞作用被靶細(xì)胞攝取。

3 MSC-Exo

MSC移植存活及分化有限，但其生物學(xué)特性并不依賴自身的增殖和分化，而是依賴于其旁分泌作用。目前研究顯示，MSC-Exo中含有生物活性物質(zhì)，能代替干細(xì)胞發(fā)揮修復(fù)損傷組織、疾病診療等作用[4]，其作用機(jī)制主要有抗炎、抗凋亡、抗纖維化、免疫調(diào)節(jié)、自噬調(diào)節(jié)及促血管生成等[5-7]。作為“無細(xì)胞的干細(xì)胞治療技術(shù)”，MSC-Exo顯示出無法比擬的優(yōu)勢(shì)：(1)體積?。杭{米級(jí)粒子，僅為細(xì)胞的1/200，可穿透毛細(xì)血管，可穿透血腦等生物屏障，抵達(dá)靶組織，能很好地利用于人體；(2)低免疫原性及優(yōu)異的生物相容性：Exo表面抗原較少，免疫系統(tǒng)不易識(shí)別，人體耐受好；(3)具有抗原呈遞的功能，及潛在的靶向特定細(xì)胞的能力；(4)半衰期長(zhǎng)，性質(zhì)穩(wěn)定，便于保存和運(yùn)輸?shù)取?/p>

MSC-Exo的應(yīng)用避免了干細(xì)胞移植中的多種潛在風(fēng)險(xiǎn)，其優(yōu)勢(shì)使MSC-Exo有望取代MSC，作為治療制劑及基因和藥物的載體發(fā)揮重要作用。MSC-Exo給藥被認(rèn)為安全，目前為止，幾乎無關(guān)于MSC-Exo給藥后副作用的報(bào)道。Xiao等[8]復(fù)制小鼠心肌梗死模型，并在心肌注射骨髓MSC治療中發(fā)現(xiàn)，能減少心肌梗死后心肌細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)其功能修復(fù)。而進(jìn)一步的研究證實(shí)是MSC分泌的MSC-Exo發(fā)揮了調(diào)控作用。MSC-Exo作用于心肌細(xì)胞，介導(dǎo)p53-Bnip3信號(hào)通路下調(diào)心肌細(xì)胞的自噬水平，減少心肌細(xì)胞自噬性死亡。

4 MSC-Exo在心肌纖維化中的作用

心肌纖維化是心臟適應(yīng)應(yīng)激負(fù)荷的表現(xiàn)，但其進(jìn)展會(huì)導(dǎo)致心肌順應(yīng)性下降、舒縮功能障礙等，也是多種心血管疾病發(fā)展到終末階段的共同病理改變。心肌成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblast，CF)約占心肌組織細(xì)胞的2/3。病理狀態(tài)下，通過多種機(jī)制實(shí)現(xiàn)其增殖、活化，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞。肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生平滑肌肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白，它們與黏附蛋白形成連接，將細(xì)胞肌動(dòng)蛋白絲與外基質(zhì)結(jié)合。此外，增加細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的分泌，包括膠原蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑等物質(zhì)。因此，在改善相關(guān)疾病預(yù)后、抑制心臟重構(gòu)的細(xì)胞層面上，CF已成為控制纖維化進(jìn)展的重要靶細(xì)胞。

有諸多研究表明MSC-Exo能通過多種機(jī)制調(diào)節(jié)CF功能，抑制心肌纖維化，促進(jìn)心臟修復(fù)。已證明，MSC-Exo通過在體內(nèi)和體外增強(qiáng)血管生成來減輕心臟纖維化[9]。Wang等[10]通過建立大鼠心臟缺血再灌注損傷模型和體外心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧/再灌注(H/R)模型，發(fā)現(xiàn)MSC-Exo通過調(diào)節(jié)血小板衍生生長(zhǎng)因子受體β，增強(qiáng)應(yīng)激條件下的微血管再生，抑制纖維化的發(fā)展，改善心功能。此外，Ke等[11]研究發(fā)現(xiàn)MSC-Exo通過抑制間充質(zhì)-內(nèi)皮轉(zhuǎn)化和降低高遷移率族蛋白1的表達(dá)，促進(jìn)CF的增殖，增強(qiáng)血管生成，抑制心肌纖維化。

此外，MSC-Exo激活S1P/SK1/S1PR1信號(hào)通路，抑制CF轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞、心肌細(xì)胞凋亡及巨噬細(xì)胞M1極化，以減輕心肌梗死后心肌纖維化和炎癥反應(yīng)，對(duì)心肌損傷發(fā)揮保護(hù)作用；進(jìn)一步研究[12]表明，S1PR1的下調(diào)逆轉(zhuǎn)了MSC-Exo上述的抑制作用，并促進(jìn)炎癥因子核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear transcription factor-κB，NF-κB)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)的表達(dá)。提示S1PR1是MSC-Exo介導(dǎo)心肌保護(hù)的治療靶點(diǎn)。同樣，Li等[13]研究發(fā)現(xiàn)MSC-Exo治療減弱高葡萄糖誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化(降低Ⅰ型膠原和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白分泌)，并降低TGF-β1和pSmad2/3 (TGF-β1通路的關(guān)鍵分子)的表達(dá)。其他研究[14]發(fā)現(xiàn)MSC-Exo可通過減少纖維連接蛋白分泌，顯著減少慢性缺血心臟間質(zhì)纖維化。

5 MSC-Exo調(diào)節(jié)心肌纖維化的miRNA機(jī)制

MSC-Exo包含廣泛的遺傳物質(zhì)，它將具有生物活性的RNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和其他信號(hào)分子傳遞給受體細(xì)胞，特別是miRNA。miRNA是一類內(nèi)源性的，單鏈非編碼RNA，其長(zhǎng)度為19～25個(gè)核苷酸，廣泛存在于真核生物中，參與調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)。它們通過與靶mRNA的3’非翻譯區(qū)特異性結(jié)合，普遍抑制靶mRNA，在轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控中發(fā)揮重要作用，從而顯著改變包括心臟纖維化在內(nèi)的多種分子和細(xì)胞過程。MSC-Exo中miRNA的作用及其在心血管疾病調(diào)控中的意義最近在許多文章中被強(qiáng)調(diào)。眾多來自Exo的miRNA被證明參與調(diào)控纖維化的通路。

已有研究[15]發(fā)現(xiàn)含有miRNA-24-3p的MSC-Exo可抑制CF轉(zhuǎn)分化及肌成纖維細(xì)胞增殖，減少纖維化和炎癥，保存心肌梗死后的心肌功能。此外，Zhang等[16]對(duì)糖尿病性心肌病動(dòng)物模型的研究顯示，MSC-Exo能產(chǎn)生miRNA-22、miRNA-24、miRNA-146、miRNA-210等，阻斷TGF-β信號(hào)通路，從而減少心肌細(xì)胞凋亡及心肌纖維化。而Feng等[17]的研究顯示在缺血預(yù)處理MSC-Exo后，MSC分泌富含miRNA-22的Exo，可顯著降低心肌纖維化，這一作用是通過直接靶向甲基CpG結(jié)合蛋白2來介導(dǎo)的。

最近，Lin等[18]通過miRNA芯片檢測(cè)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證，H/R處理促進(jìn)了miRNA-133在MSC-Exo中的表達(dá)；且miRNA-133可被納入Exo并傳遞到CF，增加心臟成纖維細(xì)胞間充質(zhì)-內(nèi)皮轉(zhuǎn)化，獲得內(nèi)皮細(xì)胞樣功能，并參與心臟損傷區(qū)血管生成，從而減輕心肌纖維化。此外，在該研究中發(fā)現(xiàn)，與結(jié)合蛋白SYNCRIP和hnRNPA2B1的表達(dá)相比，YBX-1在H/R-MSC中的表達(dá)顯著增強(qiáng)，miRNA-133通過YBX-1介導(dǎo)被包裝到MSC-Exo。miRNA被特異性裝載到Exo的機(jī)制與特定的結(jié)合蛋白有關(guān)，如YBX-1、SYNCRIP和hnRNPA2B1，其中YBX-1是轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵蛋白之一[18]。一項(xiàng)類似的研究中，Li等[19]發(fā)現(xiàn)MSC-Exo中miRNA-133可通過下調(diào)MAML1來抑制病毒性心肌炎大鼠的心肌纖維化和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而抑制心肌炎的進(jìn)展。

此外，Wang等[20]將MSC-Exo來源的miRNA-19a/19b傳遞到心臟HL-1細(xì)胞中，并移植到心肌梗死小鼠模型中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：以MSC-Exo作為載體，miRNA-19a/19b顯著抑制了心臟HL-1細(xì)胞的凋亡，并減少了小鼠心肌梗死模型心臟組織纖維化面積。一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)[21]顯示，在嚙齒動(dòng)物慢性心肌梗死模型中，沙庫巴曲/纈沙坦通過下調(diào)miRNA-181a來改善心功能并減少心肌纖維化。

大量研究[22]證明，除上述miRNA外，miRNA-29、miRNA-29b、miRNA-132、miRNA-144、miRNA-221、miRNA-294、miRNA-378和miRNA-455等抑制纖維化；相反，miRNA-130a、miRNA-208a和miRNA-328等誘導(dǎo)纖維化。這些研究表明，miRNA在MSC介導(dǎo)的旁分泌信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用。因此，利用藥理學(xué)或分子方法調(diào)控Exo的生成以及Exo內(nèi)容物的含量，靶向Exo中的這些miRNA，可為調(diào)節(jié)心肌纖維化提供有價(jià)值的治療工具。

6 問題與展望

心臟纖維化是一個(gè)復(fù)雜的病理過程，各種細(xì)胞類型及大量在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上的調(diào)控分子參與其中。在過去的幾年中，通過對(duì)MSC-Exo的廣泛研究，了解MSC-Exo內(nèi)源性活性物質(zhì)及其在心臟纖維化機(jī)制中的作用，其作為一種治療心血管疾病的策略得到進(jìn)一步發(fā)展。

但就目前的水平而言，MSC-Exo的深入研究及臨床轉(zhuǎn)化仍存在很多障礙。一個(gè)突出問題是：從MSC-Exo中提取功能確切且單一的miRNA等內(nèi)含物十分困難，尚無一種能集經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)單、高純無損于一體的分離方法。這給臨床研究帶來挑戰(zhàn)：MSC-Exo的功能機(jī)制闡述尚不十分清楚，部分功能仍存在爭(zhēng)議，并且可能會(huì)導(dǎo)致難以預(yù)料的不良事件，比如免疫反應(yīng)和腫瘤發(fā)生等。針對(duì)該問題，聯(lián)合使用多種分離方式，如Davies等[23]結(jié)合微流體和過濾2種方法，將納米多孔膜整合到微流控芯片上，形成微流控過濾系統(tǒng)；以及研發(fā)新技術(shù)，如低溫電子顯微鏡技術(shù)Cryo-SEM、高敏感納米流式檢測(cè)儀NanoFCM等，使在單顆粒水平上分離提純MSC-Exo得以實(shí)現(xiàn)，加速M(fèi)SC-Exo產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程，并促進(jìn)研究者們掌握更多關(guān)于MSC-Exo的異質(zhì)性和生物學(xué)。

另一突出問題是：天然MSC-Exo可攜帶的藥物及基因種類和數(shù)量有限，其功能和作用存在局限性。工程化改造MSC-Exo作為藥物或基因遞送的載體，可給MSC-Exo賦予新的功能和作用。He等[24]將抗纖維化相關(guān)基因GATA-4轉(zhuǎn)染入MSC-Exo中有效改善心肌梗死后的心功能。促纖維化miRNA的抑制劑及抑纖維化miRNA也可通過操縱親本細(xì)胞富集成MSC-Exo，并用作治療。此外，對(duì)MSC-Exo膜加工修飾可改善生物分布和對(duì)目標(biāo)選擇性?？煽紤]不同的裝載技術(shù)來實(shí)現(xiàn)MSC-Exo的改造，已采用的方法包括共孵育、氯化鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、原位合成、超聲處理和電穿孔等。封裝技術(shù)的更新，如共孵育、氯化鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、原位合成、超聲處理和電穿孔等，為改造MSC-Exo提供更多的可能性，促進(jìn)了MSC-Exo在疾病診療中的應(yīng)用。

基于MSC-Exo的心臟纖維化治療，盡管目前存在很大挑戰(zhàn)。相信隨著研究的進(jìn)一步深入及突破性成果的取得，將解決當(dāng)前MSC-Exo的問題，極大程度改善心臟纖維化患者的診治和預(yù)后。