雙色法和三色法檢測NK細胞殺傷功能的實用性比較

陳曉燕 陽莉 蔡惠寧 李翠平 盧建溪

自然殺傷細胞（Natural killer cell，NK cell）是具有主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）非限制性殺傷特點的先天性免疫細胞，是人體抵御腫瘤和病毒感染的第一道防線［1-2］。NK 細胞活化后通過分泌細胞因子、趨化因子，增強細胞毒功能發(fā)揮自然殺傷功能［3］，NK細胞還有較強的免疫調節(jié)功能，在機體免疫監(jiān)視和早期抗感染和免疫過程都起著重要作用［4］。NK細胞對細胞免疫治療效果具有重要意義，而評估NK 細胞活性的主要方法是通過檢測外周血或體外誘導擴增培養(yǎng)NK 細胞的殺傷功能［5-6］。

本研究采用流式細胞檢測方法聯(lián)合應用CFSE與Annexin-V/7-AAD 三色熒光染色法和CFSE 與PI 雙色熒光染色法檢測不同效靶比以及不同孵育時間的NK 細胞對K562 細胞的殺傷功能。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

K562 白血病細胞株為本實驗室保存；所有外周血樣本取自2019 年至2021 年中山大學附屬第三醫(yī)院健康志愿者，癌癥腫瘤患者排除納入，共計20 名，平均年齡（59±8）歲，本研究獲得本院倫理委員會批準，受試者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器

ALYS505NK-AC 培養(yǎng)液和ALYS505NK-EX培養(yǎng)液購自日本CSTI 公司，RPMI1640 培養(yǎng)液和胎牛血清FBS 購自美國Gibco 公司，DMSO 購自德國Sigma 公司，赫賽汀購自美國Roche 公司，rhIL-2 重組人白細胞介素-2 購自山東泉港藥業(yè)，淋巴細胞檢測試劑盒CD45/CD56/CD19/CD3 購自美國Bechman Coulter 公司，CFSE 購自美國Thermo Fisher Scientific 公司，PE-Annexin-V/7-AAD 熒光凋亡檢測試劑盒購自孟加拉國BD 公司，PI 溶液購自德國Sigma 公司，PBS 緩沖液購自美國Gibco公司，Centrifuge 5702R 離心機購自德國Eppendorf公司，Sorvall ST16R Centrifuge 離心機購自美國Thermo Scientific 公司，CU600 型電熱恒溫水箱購自中國Bluepard，二氧化碳培養(yǎng)箱240i 購自美國Thermo Scientific 公司，CytoFLEX 流式細胞分析儀購自美國Bechman Coulter 公司。

1.3 方法

NK 細胞對K562 細胞的殺傷檢測分2 組，分別采用2 種不同染色方法，A 組：CFSE/Annexin-V/7-AAD 三色熒光染色；B 組：CFSE/PI 雙色熒光染色。

1.3.1 效應細胞（NK 細胞）的準備

肝素鈉抗凝管采集的外周血，通過密度梯度離心法分離出單個核細胞（PBMC），用ALYS505NK-AC 培養(yǎng)液重懸細胞，調整細胞密度為（1～3）×106/mL，加入預先用赫賽汀包被好的培養(yǎng)瓶中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每隔3 d 用ALYS505NK-EX 培養(yǎng)液進行補液。收集培養(yǎng)14 d的細胞，使用淋巴細胞檢測試劑盒CD45/CD56/CD19/CD3 在流式細胞儀上測定NK 細胞（CD3-CD56+）含量，用含10%FBS 的RPMI1640 培養(yǎng)基重懸細胞，調整細胞濃度為1×106/mL、2×106/mL。

1.3.2 靶細胞（K562 細胞）的準備

K562 細胞培養(yǎng)于含10%FBS 的RPMI1640 培養(yǎng)液中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3 d換液。收集生長狀況良好的K562 細胞，用PBS 緩沖液洗滌兩次，用含0.1%FBS 的PBS 重懸細胞，并將細胞分為A 組和B 組，每組準備4 管細胞，每管細胞的細胞濃度均為1×106/mL。在A 組和B 組的每管細胞中分別加入熒光染料CFSE 對靶細胞進行標記，37℃避光，水浴20 min；加入5 倍體積預冷的含10%FBS 的RPMI1640 培養(yǎng)基，冰浴5 min，終止反應；PBS 洗滌兩次，用含10%FBS 的RPMI1640培養(yǎng)基重懸細胞調整細胞濃度至1×106/mL。

1.3.3 效-靶細胞共培養(yǎng)

效應細胞按照細胞數(shù)2×106/mL、1×106/mL，與標記好的靶細胞按照效靶比10∶1、20∶1 分別加入24 孔無菌培養(yǎng)板中，每孔設3 個復孔，并設對照孔只加靶細胞，用于檢測靶細胞自發(fā)死亡率。將細胞培養(yǎng)板中的效應細胞與靶細胞輕輕混勻，室溫，1 600 r/min，離心3 min（離心半徑13.9 cm），以使細胞緊密接觸。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育。

1.3.4 使用熒光凋亡檢測試劑盒測定NK 細胞對K562 細胞的殺傷功能

分別取1 h、2 h、3 h、4 h 四個時間點的共培養(yǎng)細胞轉入流式管中，用PBS 緩沖液洗滌兩次后重懸細胞。A 組細胞加入Annexin-V 和7-AAD 各5 μL 標記細胞，B 組細胞加入PI 5 μL 標記細胞，混勻，室溫避光孵育15 min。加入500 μL 緩沖液，室溫，2 200 r/min，離心3 min（離心半徑13.9 cm），洗滌1 次后，加入200 μL 緩沖液重懸。用CytoFLEX 流式細胞儀進行檢測，CytExpert 獲取和分析數(shù)據(jù)。

計算公式：靶細胞殺傷率（%）=（靶細胞死亡率-靶細胞自發(fā)死亡率）/（100-靶細胞自發(fā)死亡率）×100%

1.3.5 統(tǒng)計學處理

采用Excel、Prism 6 和IBM SPSS Statistics 25.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理；計量資料采用（±s）表示，使用Shapiro-Wilk 方法檢驗數(shù)據(jù)是否服從正態(tài)，用Levene's 方法檢驗數(shù)據(jù)的方差是否有差異，對總體實驗結果進行三因素方差分析，使用配對樣本t檢驗進行進一步的兩兩比較；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NK 細胞培養(yǎng)結果

初始培養(yǎng)時NK 細胞占PBMC 的比例僅為（6.15±7.29）%，培養(yǎng)到第14 天，NK 細胞比例增至（48.83±27.28）%。

2.2 CFSE 標記靶細胞結果

CFSE 均能對密度為1×107/mL 的靶細胞進行有效標記，對靶細胞的標記率均可達99%以上。見圖1。

圖1 靶細胞經CFSE 標記前后熒光強度變化Figure 1 Changes of fluorescence intensity of target cells labeled with CFSE

2.3 NK 細胞（CD3-CD56+）對靶細胞（K562）的殺傷功能

CFSE/PI 雙色法圈定目的細胞，分出CFSE陽性的細胞（圖2 中直方圖P2），在門P2 中分析凋亡細胞（圖2 中直方圖Q2）。在CFSE+細胞群中，CFSE+PI-為正常靶細胞，CFSE+PI+為發(fā)生凋亡的靶細胞。NK 細胞對靶細胞殺傷功能越強，靶細胞凋亡值越大，從圖2 可知，隨著效靶比由10∶1 增加為20∶1，NK 細胞殺傷靶細胞功能越強；隨著共培養(yǎng)時間越長，NK 細胞殺傷靶細胞功能越強。

圖2 CFSE/PI 雙色法檢測NK 細胞對K562 細胞的殺傷功能Figure 2 CFSE/PI to detect the killing function of NK cells on K562 cells

CFSE/Annexin-V/7-AAD 三色法圈定目的細胞，分出CFSE 陽性的細胞（圖3 中直方圖P2），在P2 中分析早期凋亡和中晚期凋亡細胞（圖3 中十字門散點圖）。CFSE 可有效地將效應細胞和靶細胞區(qū)分開，CFSE+為靶細胞，在CFSE+細胞群中，Annexin-V 和7-AAD 雙標記將靶細胞分為Annexin-V-7-AAD-、Annexin-V-7-AAD+、Annexin-V+7-AAD+、Annexin-V+7-AAD-4 個組群，其中CFSE+Annexin-V-7-AAD-為正常靶細胞、CFSE+Annexin-V+7-AAD-為早期凋亡的靶細胞，CFSE+Annexin-V+7-AAD+為中晚期凋亡的靶細胞。NK 細胞對靶細胞殺傷功能越強，靶細胞凋亡值越大，從圖3 可知，隨著效靶比由10∶1 增加為20∶1，NK 細胞殺傷靶細胞功能越強；隨著共培養(yǎng)時間越長，NK 細胞殺傷靶細胞功能越強。

圖3 CFSE/Annexin-V/7-AAD 三色法檢測NK 細胞對K562 細胞的細胞毒作用Figure 3 CFSE/Annexin-V/7-AAD to detect the killing function of NK cells on K562 cells

NK 細胞對K562 白血病細胞株的殺傷結果顯示：檢測方法的差異性不受效靶比和共培養(yǎng)時間影響，交互作用不明顯（F=0.039，P=0.990），差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。在4 個時間點實驗組，效靶比為10∶1、20∶1 時，NK 細胞殺傷功能（%）兩兩比較，三色法NK 細胞殺傷功能顯著高于雙色法，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。在4 個時間點，效靶細胞共培養(yǎng)4 h 時NK 細胞殺傷功能最強；在不同效靶比實驗組，兩種染色方法都檢測出在效靶比20∶1 時，NK 殺傷功能顯著高于效靶比10∶1。見圖4。

表1 兩種染色方法檢測NK 細胞對靶細胞在不同效靶比及不同時間組的殺傷效果的三因素方差分析Table 1 Three-way ANOVA of two staining methods were used to detect the killing effect of NK cells on target cells in different effect target ratio and different time groups

表2 兩種染色方法檢測NK 細胞在20∶1 和10∶1 效靶比下對靶細胞的殺傷功能（n=20，±s）Table 2 The killing function of NK cells to target cells was detected by two staining methods at 20∶1 and 10∶1 target ratios（n=20，±s）

表2 兩種染色方法檢測NK 細胞在20∶1 和10∶1 效靶比下對靶細胞的殺傷功能（n=20，±s）Table 2 The killing function of NK cells to target cells was detected by two staining methods at 20∶1 and 10∶1 target ratios（n=20，±s）

注：與CFSE/PI 染色方法效靶比為10∶1 組比較，aP＜0.05；與CFSE/PI 染色方法效靶比為20∶1 組比較，bP＜0.05。

染色方法時間組（h）效靶比10∶1 20∶1 10∶1 20∶1 3 2 4 CFSE/PI CFSE/Annexin-V/7-AAD F 值P 值1 31.71±12.89 36.53±14.39 53.53±28.84a 57.15±29.52b 27.577＜0.001 34.88±11.10 39.76±13.20 59.08±25.62a 63.07±26.82b 30.647＜0.001 41.50±11.34 47.72±14.13 63.41±25.30a 67.21±25.62b 30.647＜0.001 44.79±13.28 53.93±12.35 66.74±21.64a 71.01±23.98b 13.914＜0.001

3 討論

近年來，活化的NK 細胞的調節(jié)免疫功能和細胞殺傷作用已成為免疫治療研究的熱點［7-8］。有研究表明，腫瘤患者外周血中NK 細胞活性隨著臨床分期升高呈負相關，因此，NK 細胞活性的檢測對評估腫瘤患者病程和預后都具有重要的指導意義［9］。

目前檢測免疫細胞細胞毒活性常用的方法主要有同位素標記法、酶反應比色法和流式細胞技術三大類，而流式細胞術廣泛用于免疫學研究，在單細胞水平上監(jiān)測細胞信號變化，較其他方法更為準確［10］。研究通過流式細胞術結合示蹤熒光染料CFSE 對靶細胞進行熒光標記，在單細胞水平上根據(jù)CFSE 具有很高的熒光活性和穩(wěn)定性，有效地將靶細胞和效應細胞區(qū)分開，檢測結果不受效應細胞的影響［11-12］。

本研究通過比較CFSE/PI 兩色法和CFSE/Annexin-V/7-AAD 三色法兩種熒光標記染色方法，檢測在不同效靶比、不同共培養(yǎng)時間的NK 細胞殺傷功能，結果顯示三色法更為靈敏。此外，CFSE/PI 兩色法的優(yōu)點是單染色法，上流式調節(jié)補償更為簡便。缺點是雖然能特異性地檢測靶細胞的凋亡，但檢測不到早期凋亡的靶細胞。CFSE/Annexin-V/7-AAD 三色方法不但能檢測出中晚期凋亡細胞，還能檢測早期凋亡細胞。其原理是Annexin-V 是檢測細胞早期凋亡的靈敏指標，Annexin-V/7-AAD 能與細胞凋亡過程中翻轉到膜外的膜磷脂酰絲氨酸（PS）高親和力特異性結合，可以檢測出靶細胞中早期和中晚期凋亡的情況，從而計算出效應細胞的殺傷功能［13-15］。若對靶細胞凋亡需要進一步分析，三色法較兩色法更優(yōu)。

綜上所述，兩種染色方法均能對不同的靶細胞進行有效標記，均能檢測NK 細胞殺傷功能。但由于CFSE/Annexin-V/7-AAD 三色方法早、中晚期凋亡細胞都能區(qū)分開來，有利于后續(xù)的實驗研究。CFSE/Annexin-V/7-AAD 三色方法較CFSE/PI兩色法能更直觀呈現(xiàn)靶細胞凋亡狀態(tài)，且重復性好、靈敏度高。