流式細胞術(shù)和LDH釋放法檢測NK細胞殺傷效能的實用性比較

陽莉，丘秀生，胡元，陳曉燕，陳偉材，盧建溪*

（1中山大學附屬第三醫(yī)院生物治療中心，廣州510000； 2中山大學附屬第三醫(yī)院疫苗研究所，廣州510000；3東莞長安港灣醫(yī)院內(nèi)科，東莞 523000）

自然殺傷細胞（natural killer cell, NK細胞）是機體內(nèi)的固有免疫細胞，負責殺傷老化、受病毒感染、腫瘤等異常細胞，并且無MHC限制性，它能自己識別和攻擊外來病毒、癌細胞和異常細胞[1～3]。目前，NK細胞不僅廣泛用于腫瘤病人的免疫治療，還可應(yīng)用于預(yù)防腫瘤發(fā)生及提高亞健康人群生活質(zhì)量[4]。

檢測NK細胞殺傷活性是評估體外培養(yǎng)的NK細胞生物學功能的主要方法。目前檢測細胞毒性的方法有同位素釋放法、MTT法、CCK-8法、LDH釋放法、Calcein-AM釋放法和流式細胞術(shù)等方法。同位素的方法對設(shè)備要求較高，費用較高，操作繁瑣，又存在放射性污染的問題，使其推廣使用受到限制；而酶反應(yīng)比色法容易受各種因素影響致結(jié)果出現(xiàn)較大差異，重復(fù)性不佳；流式細胞技術(shù)可在單細胞水平分析細胞的自然凋亡和靶細胞的死亡，是近幾年發(fā)展的一種方法[5～7]。本研究選取流式細胞術(shù)和LDH的方法檢測體外培養(yǎng)的NK細胞對K562細胞的殺傷活性，對檢測結(jié)果進行分析，優(yōu)化了細胞濃度和效靶細胞比，為NK細胞功能評估提供穩(wěn)定可靠的檢測方案。

材料與方法

1 樣本來源

白血病細胞株K562為本實驗室保存。14例腫瘤患者外周血均來自中山大學附屬第三醫(yī)院嶺南醫(yī)院，其中男7例，女7例，年齡40～85歲，平均年齡（59.57 ± 3.38）歲，所有患者均簽署知情同意書。

2 主要儀器與試劑

ALYS505NK-AC培養(yǎng)液和ALYS505NK-EX培養(yǎng)液（日本CSTI公司），RPMI1640培養(yǎng)液和胎牛血清（美國Gibco公司），重組人白細胞介素2（山東泉港藥業(yè)），人淋巴細胞分離液（挪威Axis-shield公司），赫賽汀（美國Roche公司），淋巴細胞檢測試劑盒CD45/CD56/CD19/CD3（美國Beckman Coulter公司），PI溶液（美國Sigma公司），羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（5,6-carboxyfluorescein diacetate succinimidy ester，CFSE）（美國 Thermo Fisher Scientific公司），LDH細胞毒性檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），流式細胞分析儀為 CytoFLEX（美國Beckman Coulter公司），酶標儀為 Spark 10M（瑞士TECAN公司），離心機為Centrifuge 5810R（德國Eppendorf公司），二氧化碳培養(yǎng)箱240i（美國Thermo Scientific公司）。

3 細胞培養(yǎng)

3.1 K562細胞株培養(yǎng)

白血病細胞株K562培養(yǎng)于含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3d換液。

3.2 NK細胞培養(yǎng)

用肝素鈉抗凝管采集14份靜脈血，密度梯度離心法分離外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），用 ALYS505NK-AC培養(yǎng)液重懸細胞，調(diào)整細胞密度為（1～3）×106個/ml，加入預(yù)先用赫賽汀包被好的培養(yǎng)瓶中，37. 5℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每隔3d用ALYS505NK-EX培養(yǎng)液對細胞進行補液。培養(yǎng)14d后，收獲細胞，使用淋巴細胞檢測試劑盒CD45/CD56/CD19/CD3在流式細胞儀上測定NK細胞（CD3－CD56+）含量。

4 NK細胞的殺傷功能檢測

4.1 LDH釋放法

培養(yǎng)14d后，對NK細胞進行殺傷功能檢測。以K562細胞作為靶細胞，濃度調(diào)整為1.0×105個/ml，按100μl/孔接種于96孔板；以NK細胞作為效應(yīng)細胞，濃度調(diào)整為4×106個/ml，然后進行倍比稀釋，每組效應(yīng)細胞濃度分別為4×106個/ml、2×106個 /ml、1×106個 /ml和 5×105個 /ml，按 100μl/孔接種于96孔板，最終效應(yīng)細胞與靶細胞的比例（效靶比）（effective target ratio, E/T ratio）分別為40:1、20:1、10:1和5:1，同時設(shè)靶細胞自然釋放對照組和最大釋放對照組，每組設(shè)3個復(fù)孔；250×g，離心5min后，將該96孔板置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4h。取出 96 孔板，400×g，離心 5min，取 120μl上清液，加入到一新96孔板相應(yīng)孔中，按LDH細胞毒性檢測試劑盒說明書進行測定。

計算公式為：靶細胞殺傷率=（實驗組OD值-靶細胞自然釋放孔OD值）/（靶細胞最大釋放孔OD值-靶細胞自然釋放孔OD值）×100%。

4.2 CFSE/PI雙染法流式細胞術(shù)

標記靶細胞：K562細胞濃度調(diào)整為1.0×106個/ml，加入熒光染料CFSE對靶細胞進行標記，37℃避光，染色20min；加5倍體積預(yù)冷的含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)液，冰浴5min，終止染色；調(diào)整細胞濃度至1.0×105個/ml。共培養(yǎng)：加入NK細胞作為效應(yīng)細胞，每組效應(yīng)細胞數(shù)目分別為4×106個/ml、2×106個 /ml、1×106個 /ml和 5×105個 /ml，最終效應(yīng)細胞與靶細胞的比例分別為40:1、20:1、10:1和5:1，同時設(shè)靶細胞對照孔，250×g，離心5min后，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4h；熒光染料PI標記死亡細胞，4℃避光，染色30min；用CytoFLEX流式細胞儀進行檢測及數(shù)據(jù)分析。

計算公式： 靶細胞殺傷率=（靶細胞死亡率－靶細胞自發(fā)死亡率）/（100-靶細胞自發(fā)死亡率）×100%。

5 統(tǒng)計學分析

采用GraphPad Prism 6統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理。各組靶細胞殺傷率用表示，兩組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，組內(nèi)均數(shù)比較采用配對樣本t檢驗，P＜0.05代表差異顯著有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 CFSE對靶細胞高效標記

從培養(yǎng)第5d開始，細胞呈對數(shù)生長。流式細胞術(shù)測定NK細胞含量顯示，CD3-/CD56+細胞第0d時比例為16.14%±2.07%，培養(yǎng)至第14d時，CD3-/CD56+細胞的比例為72.56 %± 4.14%，人外周血NK細胞經(jīng)體外誘導增殖后，純度較高（圖1）。

靶細胞經(jīng)過預(yù)先標記，可明顯與效應(yīng)細胞區(qū)分開來。靶細胞未標記時有少量的自發(fā)熒光（8.07%）；靶細胞經(jīng)CFSE染色后，37℃、5% CO2培養(yǎng)4h，部分細胞發(fā)生增殖，熒光分子隨細胞分裂分配到兩個子代細胞中，故出現(xiàn)兩個峰，可見靶細胞的標記率達99.35%。與效應(yīng)細胞共孵育后，能夠顯著地與未標記的效應(yīng)細胞進行區(qū)分（圖2）。

圖1 PBMCs培養(yǎng)前后NK細胞純度比較。A，培養(yǎng)前；B，培養(yǎng)至14d時Fig.1 Comparison of the purity of NK cells before and after PBMCs culture. A, before culture; B, after cultured for 14d

圖2 CFSE對靶細胞標記率。A，未標記；B，CFSE標記Fig. 2 CFSE labeling rate of target cells. A, unlabeled cells; B, CFSE labeled cells

2 10:1效靶比時LDH法替代流式細胞術(shù)檢測NK細胞體外殺傷效能

靶細胞和效應(yīng)細胞混合孵育后，于倒置顯微鏡下觀察，效靶細胞比為5:1時，細胞之間不能有效接觸；效靶細胞比為10:1時，細胞接觸良好且細胞團很少；效靶比為20:1時，細胞雖接觸良好但細胞團較多；效靶細胞比為40:1時，大量細胞聚集成團,細胞團太多太大，效靶細胞反而不能有效接觸。因此靶細胞濃度為1×105個/ml，效靶比為10:1的細胞密度比較合適（圖3）。

流式細胞術(shù)CFSE/PI雙色熒光標記法以CFSE+細胞進行設(shè)門（圖4中P1門），分析該群細胞PI+的細胞，CFSE+PI－為正常靶細胞，CFSE+PI+為死亡的靶細胞（圖4中P3門）。LDH法和流式細胞術(shù)檢測NK細胞對白血病K562細胞株的殺傷活性顯示，效靶比越大，其殺傷活性越強；其中在5:1低效靶比時，流式細胞術(shù)檢測出的細胞殺傷活性明顯高于LDH釋放法，在10:1、20:1和40:1高效靶比時，兩種方法檢出的靶細胞死亡率無顯著差異（表1）。

圖3 不同效靶比下的細胞形態(tài)。A，5:1；B，10:1；C，20:1；D，40:1；箭頭，細胞團；比例尺，100μmFig.3 Cellular morphology at different E/T ratios. A, 5:1; B, 10:1; C, 20:1; D, 40:1; arrow, cell mass; scale bar, 100μm

討 論

過繼免疫療法是取患者自體淋巴細胞或免疫力強的供者淋巴細胞，經(jīng)體外活化、擴增后，再回輸入患者體內(nèi)發(fā)揮抗腫瘤作用。NK細胞由于獨特的抗腫瘤特點，在腫瘤免疫中的作用越來越受到重視[8-11]。鑒于NK細胞治療的廣闊應(yīng)用前景，亟需建立一種高效的NK細胞培養(yǎng)及質(zhì)量評估的方法，以滿足臨床應(yīng)用的需要。由于腫瘤患者普遍年齡偏大且免疫功能低下，外周血NK細胞比例更低、含量更少且活性較差，體外培養(yǎng)CD3－CD56+細胞比例也較低。

通常根據(jù)對靶細胞的殺傷作用來評估NK細胞的生物學功能，目前的檢測方法有很多種，各有優(yōu)缺點。通過檢測從細胞膜破裂的細胞釋放到培養(yǎng)液中的LDH活性，就可以實現(xiàn)對細胞毒性的定量分析。LDH釋放法被認為是傳統(tǒng)的51Cr釋放法進行細胞膜完整性檢測的安全有效的替代方法。

CFSE是一種穿透細胞膜的熒光染料，進入細胞后可以不可逆地與細胞內(nèi)的氨基結(jié)合偶聯(lián)到細胞蛋白質(zhì)上。當細胞分裂時，CFSE熒光可分配至兩個子代細胞中，因此其熒光強度大約是親代細胞的一半，利用流式細胞儀在488nm 激發(fā)光和FL1檢測通道可對其進行分析，可用于細胞示蹤和細胞增殖研究，同時也用于細胞毒活性的測定[12]。用CFSE標記活細胞，熒光在細胞中維持時間長、不易衰減、穩(wěn)定，且對細胞生理活動沒有影響，對靶細胞的標記率高，熒光強度強，可在流式細胞儀的FL-1通道檢測。PI是一種核酸染料，它不能通過活細胞膜，卻能穿過破損的細胞膜而對核染色在合適波長激發(fā)光的激發(fā)下發(fā)出明亮的紅色熒光，可在流式細胞儀的FL-2通道檢測。CFSE/PI雙色熒光染料標記，能同時對活細胞和死細胞染色，可有效區(qū)分靶細胞和效應(yīng)細胞以及靶細胞的自發(fā)凋亡和死亡[13]。

圖4 CFSE/PI法流式細胞術(shù)檢不同效靶比時NK細胞對K562細胞的細胞毒作用Fig. 4 Flow cytometric analysis (CFSE/PI) for cytotoxicity of NK cells to K562 cells at different E/T ratios

表1 兩種方法檢測NK細胞在不同效靶比下對靶細胞的細胞毒作用Tab.1 Cytotoxicity of NK cells against target cells at different E/T ratios detected by the two different detection methods

本文比較了LDH釋放法及流式細胞術(shù)CFSE/PI雙色熒光標記法在不同效靶比的細胞毒實驗結(jié)果，并探討了LDH法和流式細胞術(shù)的最佳實驗條件。結(jié)果表明，LDH法加入顯色試劑后隨反應(yīng)時間的增加其OD值逐漸增加，30min 以后OD值已不在檢測范圍內(nèi)，最佳檢測時間為加入反應(yīng)試劑后25～30min，時間要嚴格控制，否則結(jié)果誤差很大。在實驗中發(fā)現(xiàn)隨著效靶比的增加，其結(jié)果變異越大，當效靶比為20:1和40:1時，開始出現(xiàn)OD值超出范圍的情況，分析認為當效靶比越高的時候，效應(yīng)細胞貢獻越多的LDH，使結(jié)果產(chǎn)生較大誤差[14]?？梢?，LDH 法雖是常用測定細胞毒活性的簡便方法，具有經(jīng)濟、快速且需要樣本量少等優(yōu)點，但該方法易受溫度、培養(yǎng)液和反應(yīng)時間等因素的影響而導致結(jié)果重復(fù)性差。流式細胞術(shù)相對耗時較長，操作較繁瑣，優(yōu)點是可以明確區(qū)分效應(yīng)細胞和靶細胞及凋亡和死亡細胞，是一種靈敏、特異 、經(jīng)濟和穩(wěn)定的檢測 NK 細胞毒性的方法。綜合比較這兩種方法體外檢測免疫細胞對腫瘤細胞毒活性實驗，在較高的效靶比和較強的細胞毒作用下（10:1、20:1、40:1），兩種方法對靶細胞死亡率檢出的差異不具有統(tǒng)計學意義；但在效靶比弱細胞毒情況下（5:1），流式細胞術(shù)檢測靶細胞死亡率要高于LDH法，具有重復(fù)性好、靈敏度高等特點。

綜上所述，在體外評估NK細胞的殺傷功能實驗中，考慮到所需要的樣本細胞數(shù)量、細胞團的聚集程度以及顯色反應(yīng)的準確度，最優(yōu)的效靶細胞比為10:1。在效靶比為10:1時，LDH釋放法及CFSE/PI雙染色法均可用來檢測NK細胞殺傷活性，在其他效靶比情況下，流式細胞術(shù)要優(yōu)于LDH釋放法。