應(yīng)用VAN-Clear與低甲醛的病理組織處理改良方法的評價

黃紅浪，李衛(wèi)華，張維，冉靜，張姍姍，付莉

（1廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院 廈門市心血管病研究所；2廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)務(wù)部；3廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，廈門 361003）

病理診斷是臨床診療過程中的金標準[1]，為疾病診治及預(yù)后判斷提供了有力幫助，但承擔巨大的責任與風險。目前，大多數(shù)病理實驗室采用4%中性甲醛和二甲苯進行組織和切片處理，配置通風設(shè)備來降低空氣污染對人體的危害，但是，甲醛、二甲苯及噪聲的污染仍嚴重威脅著病理工作人員的健康，尤其是病理技術(shù)室工作人員[2-5]。另外，不同的研究課題實驗對標本固定液的要求是嚴格的、迥異的，傳統(tǒng)的方法脫水機內(nèi)統(tǒng)一配置4%甲醛已無法同時滿足各種實驗的要求。因此，作者采用低甲醛固定組織，采用VAN-Clear替代二甲苯對組織進行透明，采用VAN-Clear對切片進行脫蠟，旨在探索一種環(huán)保、可替代傳統(tǒng)病理組織脫水、可替代傳統(tǒng)病理切片脫蠟的優(yōu)化方案。

材料與方法

1 材料

選取廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管病研究所10只SD大鼠，分別解剖腦組織、延髓、心臟、肺、胸主動脈、胃、脾臟、肝臟、腹主動脈、結(jié)腸、腸系膜上動脈、腎臟、精囊腺、睪丸等14種組織，共計140例標本，按規(guī)范[4]取材，大小為1cm×1cm×0.30cm，每例均切取3份，隨機分改良中性甲醛組、改良多聚甲醛組和傳統(tǒng)中性甲醛組，均加入10倍體積不同固定液，固定時間為20～24h[4]；3組各制140張進行HE染色，挑選3組的腸系膜上動脈每組各10例做免疫組織化學(xué)染色。大鼠腸系膜上動脈平滑肌細胞炎癥模型標本120例，神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤小鼠模型標本20例，大鼠心梗模型心肌標本60例，大鼠哮喘模型肺組織標本32例。

2 主要設(shè)備及試劑

TP1020組織脫水機（徠卡生物系統(tǒng)上海有限公司，德國），Histo Core Arcadia組織包埋機（徠卡生物系統(tǒng)上海有限公司，德國），RM2245半自動輪轉(zhuǎn)式切片機（徠卡生物系統(tǒng)上海有限公司，德國），分貝噪音測試儀（北京布克世紀科技），博朗通126s甲醛檢測儀家用TVOC苯空氣質(zhì)量自監(jiān)測試儀量盒—室內(nèi)測甲醛儀器PM2.5檢測儀（博朗通醫(yī)療科技）；VAN-Clear（武漢宏茲生物技術(shù)有限公司），HE染液（珠海貝索生物技術(shù)有限公司），Masson三色染色液（珠海貝索生物技術(shù)有限公司），PAS染色液（珠海貝索生物技術(shù)有限公司），濃縮型兔多抗ETA（ab117521）、濃縮型兔多抗ET-B（ab117529）、濃縮型大鼠單抗PD-L1（ab80276）、濃縮型小鼠單抗Integrin avb3（ab7166）及HRP標記的羊抗兔、大鼠或小鼠二抗均采購自Abcam China，4%中性甲醛和4%多聚甲醛均購自廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院制劑科。

3 組織處理方法

改良中性甲醛組采用4%中性甲醛固定，改良多聚甲醛組采用4%多聚甲醛固定，改良組取材后均先采用流水及75%酒精祛除組織的固定液，然后進入梯度酒精及VAN-Clear進行組織處理；傳統(tǒng)中性甲醛組按傳統(tǒng)方法采用4%中性甲醛固定，取材后不祛除組織的固定液，直接進入4%中性甲醛、梯度酒精及二甲苯進行組織處理；組織處理分別在兩臺Leica TP1020組織脫水機內(nèi)完成。所有模型標本均用改良中性甲醛固定。

4 制片

將3組的組織進行包埋、切片，切片厚度均3.50μm，65℃烤箱內(nèi)烤片30min，VAN-Clear脫蠟，降梯度酒精各3 min，自來水沖洗后行HE染色、免疫組織化學(xué)染色和Masson、PAS染色。

5 HE染色

蘇木精染液染12min，流水沖洗，0.8%鹽酸酒精分化1s，流水洗凈、返藍15min，濕片鏡下觀察核染色，伊紅染液染1s，流水洗，梯度酒精各3s，風干后環(huán)保封片膠及蓋玻片封固[1,4]。

6 免疫組織化學(xué)染色

石蠟切片脫蠟、入水后，采用檸檬酸高壓加熱進行抗原修復(fù)，二步法進行ET-B、ET-A、PD-L1和Integrin avb3免疫組織化學(xué)染色[6]。ET-B、ET-A、PD-L1和Integrin avb3一抗稀釋度分別為1:250、1:2000、1:100和1:100，冰箱保鮮4度孵育過夜，HRP標記的二抗1:2000，室溫孵育1h，室溫下DAB顯色3～10min，脫水、透明后環(huán)保封片膠及蓋玻片封固。

7 Masson染色

切片常規(guī)脫水至水洗，Weigert鐵蘇木素染5～10min，鹽酸酒精分化，麗春紅酸性品紅染5～10min，磷鉬酸處理5min，甲苯胺藍復(fù)染3～5min，1%冰醋酸沖洗致無藍色脫出，常規(guī)脫水封片。

8 PAS染色

切片常規(guī)脫水至水洗，高碘酸氧化10min，Schiff試劑染10～15min，蘇木素染核2～5min，鹽酸酒精分化，返藍，常規(guī)脫水封片。

9 判讀標準

根據(jù)規(guī)范的質(zhì)控評分標準，由實驗員、中級技師、高級醫(yī)師共同評分，取中間值。重點評價組織切面完整性，厚薄均一性，松散性，透明度，細胞核與細胞質(zhì)染色對比，其中細胞核與細胞質(zhì)染色對比不合格則認定為不合格。分甲級片（≥90分）、乙級片（75～89分）、丙級片（60～74分）、丁級片（≤59分），優(yōu)良率（甲、乙級切片所占的比例）≥90%，優(yōu)級率（甲級切片所占的比例）≥35%[4,7]。免疫組織化學(xué)重點評價抗體表達、陽性定位，背景[6]。Masson染色結(jié)果為膠原纖維、粘液、軟骨呈藍色，肌纖維、纖維素和紅細胞呈紅色，細胞核呈藍黑色。PAS染色結(jié)果為糖原、中性粘液物質(zhì)呈紅色，細胞核呈藍色。

10 大鼠腸系膜上動脈平滑肌細胞炎癥模型標本

分為LPS（Sigma）注射兩次及LPS注射一次2個實驗組，以注射NS為對照，LPS注射兩次組按大鼠體重腹腔注射LPS兩次，間隔6h，劑量為5mg/kg； LPS注射一次組按大鼠體重腹腔注射LPS一次，劑量為5mg/kg；注射生理鹽水（NS）對照組，按大鼠體重腹腔注射NS一次，劑量同上。3組大鼠均第一次注射后再飼養(yǎng)12h。

11 神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤小鼠模型標本HE染色及免疫組織化學(xué)染色

培養(yǎng)結(jié)腸癌腫瘤MC38細胞株，分別在第1和第4d，同等數(shù)量注射在C57BL/C小鼠的左、右后肢皮下，建立小鼠結(jié)腸腫瘤皮下移植瘤模型（分別為第1、2位腫瘤），第11d將其隨機分為放療聯(lián)合PDL1單抗組和 空白對照組2組。放療聯(lián)合PD-L1單抗組：從第12d 開始每天給予放療（8Gy/次），連續(xù)3d；從第15d開始每3d給予腹腔注射PD-L1單抗1次（200μg/次），共4次?？瞻讓φ战M：不做放療和單抗注射治療。第35d處死小鼠取第2位腫瘤組織做病理檢查，二步法免疫組織化學(xué)檢測PDL1和integrin avb3表達水平差異。

12 大鼠心肌梗死模型制備

10%水合氯醛麻醉，開胸，結(jié)扎大鼠心臟冠狀動脈左前降支，術(shù)后4周取心臟病理檢查。

13 大鼠支氣管哮喘模型制備

采用卵蛋白腹腔注射致敏大鼠后再霧化吸入同一致敏原從而誘發(fā)大鼠哮喘發(fā)作，誘導(dǎo)氣道變應(yīng)性炎癥后處死取肺做病理檢查。

14 實驗室空氣的甲醛及二甲苯檢測

采用博朗通室內(nèi)空氣質(zhì)量檢測儀（BRSmart126S，一鍵式）檢測實驗室空氣的甲醛及二甲苯含量。

15 實驗室環(huán)境噪聲監(jiān)測

采用一鍵式分貝噪音測試儀（北京布克世紀科技）檢測環(huán)境噪聲。

16 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料率的比較采用χ2檢驗；A、B兩組與C組的HE染色評分的組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 改良方法與傳統(tǒng)方法的HE染色評分的平均分及優(yōu)級率均基本一致

改良組與傳統(tǒng)組腦、延髓、心臟、肺、胸主動脈、胃、脾臟、肝臟、腹主動脈、結(jié)腸、腸系膜上動脈、腎臟、精囊腺、睪丸等14種組織切面完整性、厚薄均一性、透明度、細胞核與細胞質(zhì)染色對比度等均取得很好的評價，細胞核漿紅藍鮮艷、對比鮮明，透明度佳，一致性良好，無明顯差異。改良中性甲醛組、改良多聚甲醛組和傳統(tǒng)中性甲醛組3組切片的HE評分結(jié)果分別是：甲級片分別125例、122例和121例， 乙級片分別15例、18例和19例，丙級及丁級切片均為0例。3組優(yōu)良率均為100%，優(yōu)級率分別為89.29%、、87.14%、86.43%，各組優(yōu)級率之間無顯著差異，證實改良方法HE染色質(zhì)量穩(wěn)定、可靠（圖1、2）。

圖1 改良方法與傳統(tǒng)方法HE染色效果比較。比例尺，100μmFig. 1 Comparison of HE staining results between modified methods and traditional method. Scale bar, 100μm

2 改良固定方法不改變大鼠腸系膜上動脈平滑肌細胞炎癥模型平滑肌細胞的HE和免疫組織化學(xué)染色質(zhì)量

改良組與傳統(tǒng)組的腸系膜上動脈HE切片形態(tài)完整，厚薄均一，紅藍鮮艷，核質(zhì)對比鮮明，透明度好，一致性良好。3種固定方法固定的腸系膜上動脈的平滑肌細胞的ET-B與ET-A抗體在細胞膜、細胞質(zhì)陽性表達及定位都很準確，背景清晰。無LPS刺激的正常對照組的平滑肌細胞ET-B與ET-A均（-/±）；注射一次LPS的平滑肌細胞的ET-B與ET-A均（++）；注射兩次LPS的平滑肌細胞的ET-B與ET-A均（+++）。平滑肌細胞的ET-B和 ET-A抗體陽性表達隨著炎癥因子LPS刺激次數(shù)的增加呈增強狀態(tài)，且同組間ET-A的陽性表達明顯強于ET-B（圖3）。

3 改良固定方法不改變小鼠結(jié)腸神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤模型的HE和免疫組織化學(xué)染色效果

改良法固定的小鼠結(jié)腸神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤模型標本HE切片染色效果佳； PD-L1和Integrin avb3在大鼠結(jié)腸癌惡性腫瘤MC38模型的腫瘤細胞和淋巴細胞的細胞膜及細胞質(zhì)呈現(xiàn)陽性高表達，而在大鼠結(jié)腸癌惡性腫瘤MC38聯(lián)合治療模型的腫瘤細胞和淋巴細胞的細胞膜及細胞質(zhì)的陽性表達明顯下降，大鼠結(jié)腸癌惡性腫瘤MC38聯(lián)合治療明顯有效（圖4）。3種固定方法固定的標本的HE染色和PD-L1與Integrin avb3免疫組織化學(xué)染色效果無明顯差異。

圖2 改良方法與傳統(tǒng)方法HE染色評分比較（n=140）Fig. 2 Comparison of HE staining scores between the modified and traditional methods (n=140)

4 改良法固定對大鼠心梗模型心肌標本HE和Masson染色效果無影響

在改良法固定的大鼠心梗模型心肌標本中，HE和Masson染色效果好。在Masson染色與HE對比下，Masson染色大鼠模型心肌梗死區(qū)，心肌細胞周圍膠原纖維明顯增生，呈藍色（甲苯胺藍），心肌細胞呈紅色，細胞核呈深藍色（圖5）。3種固定方法固定的心機標本的HE和Masson染色效果無顯著差異。

圖3 改良法固定大鼠腸系膜上動脈的HE及ET-B和ET-A免疫組織化學(xué)染色效果。比例尺，100μmFig. 3 Representative images of HE staining and immunohistochemical staining for ET-B and ET-A of the rat superior mesenteric artery fixed by modified method. Scale bar, 100μm

圖4 改良法固定小鼠結(jié)腸神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤模型的HE及免疫組織化學(xué)染色結(jié)果。比例尺，100μmFig. 4 Representative images of HE staining and immunohistochemical staining for PD-L1 and Integrin avb3 of the mouse colon neuroendocrine tumor model fixed by modified method. Scale bar, 100μm

5 改良法固定不改變大鼠哮喘模型肺組織標本HE染色及支氣管杯狀細胞的PAS染色

在改良法固定的大鼠哮喘模型肺組織標本中，HE染色效果佳；支氣管杯狀細胞及黏液在PAS染色中呈深紅色，強陽性，細胞核呈深藍色，與HE染色形成鮮明的對比（圖6）3種固定方法對肺組織及支氣管杯狀細胞的HE和PAS染色無不同影響。

6 改良法固定顯著減輕實驗室甲醛、二甲苯和噪聲污染

圖5 改良法固定的大鼠心梗模型心肌標本HE及Masson染色結(jié)果。比例尺，100μmFig. 5 Representative images of HE and PAS staining of the modified method fixed myocardial specimens from the rat myocardial infarction model.Scale,100μm

圖6 改良法固定的大鼠哮喘模型肺組織標本的HE及PAS染色結(jié)果，比例尺，150μm。Fig. 6 Representative images of HE and PAS staining of the modified method fixed lung tissue specimens from the rat asthmatic model. Scale,150μm

應(yīng)用改良法固定時，取材室工作時段甲醛濃度為0.15～0.28mg/m3，工作完成30min后檢測值為0 mg/m3；技術(shù)室工作時段（組織脫水、組織包埋、組織切片）及工作完成30min后甲醛濃度檢測值均為0 mg/m3（圖7）。技術(shù)室二甲苯檢測分為組織脫水、組織包埋、組織切片、組織脫蠟4個工作時段，檢測值均為0 mg/m3（圖8）。傳統(tǒng)法固定時，技術(shù)室的甲醛濃度為0.12～0.89mg/m3，二甲苯濃度為0～0.62mg/m3。改良法固定時的甲醛和二甲苯污染院低于傳統(tǒng)法。

對噪聲檢測顯示，工作時段，取材室測得數(shù)據(jù)為22～28dB(A)，技術(shù)室測得數(shù)據(jù)為22～29dB(A)，遠遠低于通風設(shè)備的噪聲標準，達到中國環(huán)境噪聲容許的夜間噪聲標準（圖9）。

圖7 改良法固定時取材室和技術(shù)室甲醛濃度檢測結(jié)果（n=20）Fig. 7 Detection results of formaldehyde concentration in sampling room and operating room when fixation with improved method (n=20)

圖8 改良法固定時技術(shù)室二甲苯濃度檢測結(jié)果（n=20）Fig. 8 Detection results of xylene concentration in operating room when fixation with improved method (n=20)

圖9 改良法固定時取材室和技術(shù)室噪聲測試結(jié)果（n=20）Fig. 9 Noise test results in sampling room and operating room when fixation with improved method (n=20)

討 論

組織處理及制片是病理工作的基礎(chǔ)，HE染色及免疫組織化學(xué)染色是病理診斷最重要環(huán)節(jié)之一。目前，在病理工作中仍大量的使用甲醛、二甲苯及通風設(shè)備，對病理工作者及環(huán)境造成了極大的危害。

甲醛又稱蟻醛，是良好的組織固定劑。其固定原理是在蛋白質(zhì)末端基團之間形成交聯(lián)鏈，組織固定均勻，穿透力強，固有物質(zhì)保存好，組織收縮少，硬化組織有利于石蠟切片；缺點是形成交聯(lián)鏈，行免疫組織化學(xué)檢測時多數(shù)需要抗原修復(fù)等[9]。甲醛氣體相對密度10.67，無色，易揮發(fā)、對人眼及上呼吸道等有刺激作用[10,11]，人體毒性包括致癌、致突變、致敏及刺激作用[12-15]。2017年世界衛(wèi)生組織國際癌研究機構(gòu)將其列為Ⅰ類致癌物。根據(jù)我國關(guān)于工作場所的衛(wèi)生標準甲醛的最高容許濃度（MAC）為 0.50mg/m3[3,16]。

二甲苯是良好的組織透明劑，使組織切片的透明度達到光鏡觀察的要求，同時能脫祛組織中的石蠟為染料與組織結(jié)合創(chuàng)造條件。二甲苯無色透明，易揮發(fā)，對人眼及上呼吸道等有刺激作用，高濃度時，對中樞系統(tǒng)有麻醉作用[3,17]。2017年世界衛(wèi)生組織國際癌研究機構(gòu)將其列為Ⅲ類致癌物。中國居住區(qū)大氣中有害物質(zhì)的最高容許度為0.30mg/m3（一次值）。

VAN-Clear是一種從桔皮等植物中提取的綠色環(huán)保的生物透明脫蠟液，不含芳香族化合物且性質(zhì)穩(wěn)定，對人體沒有危害[18]，是一種環(huán)保透明試劑。VAN-Clear的結(jié)構(gòu)與石蠟相似，與石蠟互溶性好，脫蠟效果好，有利于染料與組織著色[1]。

根據(jù)國際標準化組織（ISO）的調(diào)查，長期較強的噪聲污染使人產(chǎn)生生理、心理、病理的不良影響，會造成耳鳴、耳聾、心血管疾病等疾病[19]。

根據(jù)文獻報道，病理實驗室甲醛濃度普遍偏高，取材室、技術(shù)室、診斷室均超過國家標準限值[3,20]，二甲苯濃度也在技術(shù)室和診斷室嚴重超標。通風設(shè)備在一定程度上降低空氣污染水平，但也存在一些無法避免的問題：甲醛及二甲苯仍嚴重超標[2,3]；而且通風設(shè)備噪音污染、對流時加劇，設(shè)備故障及老化、倒灌，設(shè)備占用大量空間，廢氣排放造成環(huán)境二次污染等。從根本上遏制實驗室甲醛、二甲苯及噪聲污染是保護人體健康及環(huán)境刻不容緩的工作。

本實驗方法減少甲醛環(huán)節(jié)以及采用VAN-Clear替代二甲苯，從源頭上降低實驗室的環(huán)境污染因素[5]。應(yīng)用改良法固定時，將取材室設(shè)置在實驗室最角落處，配置通風設(shè)備；技術(shù)室集中配置組織脫水機、包埋機、切片機、染色設(shè)備及試劑、顯微鏡、電腦等，未配置通風設(shè)備。取材室的甲醛濃度工作時段為0.15～0.28mg/m3，非工作時段檢測值為零；通風設(shè)備工作穩(wěn)定可靠，沒有對流形成渦旋，噪聲明顯下降，僅22～28dB(A)，空氣及噪聲監(jiān)測均達標；病理技術(shù)室未監(jiān)測出甲醛及二甲苯，噪音監(jiān)測數(shù)據(jù)為22～29dB(A)，遠遠低于通風設(shè)備的噪聲標準為≤65 dB(A)，達到中國環(huán)境噪聲容許的夜間噪聲標準≤30dB(A)[8]；技術(shù)室不配備通風設(shè)備，減少了支出，并避免通風設(shè)備尾氣倒灌污染，還節(jié)省大量的實驗室空間。

目前，病理常用的固定液有10余種，都各有不同的優(yōu)缺點，一般根據(jù)不同的實驗要求來選擇。4%中性甲醛仍然是使用最為廣泛的固定液，但會與蛋白質(zhì)形成交聯(lián)鏈，行免疫組織化學(xué)檢測時多數(shù)需要進行抗原修復(fù)[16]；4%多聚甲醛不會與蛋白質(zhì)形成交聯(lián)鏈，因而不會影響抗體及探針進入細胞內(nèi)，主要用于組織化學(xué)、原位雜交、免疫定位等[21,22]。傳統(tǒng)方法只能滿足4%甲醛固定的實驗，無法同時滿足多種實驗的需求。本實驗方法將固定液及固定步驟設(shè)置在脫水機外，脫水機內(nèi)使用75%酒精替代甲醛，不設(shè)置固定液及固定程序，提高組織脫水機的兼容性和機動性，可以同時滿足不同的實驗需求，降低組織脫水機運行的步驟和時間，提高工作效率。

本研究包含了豐富的組織類型，其中有脂肪較多的腦組織、延髓；血液較多的脾臟；組織致密實質(zhì)器官肝臟、腎臟；實質(zhì)與空腔交替的心臟、肺；空腔組織胸主動脈、腹主動脈、腸系膜上動脈、胃、結(jié)腸等；硬度較大的精囊腺以及質(zhì)地柔軟的睪丸，基本模擬了大部分人體不同質(zhì)地的標本[1]。應(yīng)用改良法固定標本，實驗結(jié)果取得優(yōu)秀的表現(xiàn)，平均分均在90分以上，優(yōu)良率均為100%，優(yōu)級率均大于85%以上。此外，改良法固定應(yīng)用到4個科研課題在HE、免疫組織化學(xué)、Masson、PAS等病理常用染色技術(shù)中均取得了滿意的結(jié)果，其中的大鼠腸系膜上動脈平滑肌細胞炎癥模型標本的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果經(jīng)PCR及免疫組織化學(xué)半定量分析也得到很好的證實。

綜上所述，本研究證實所采用的改良方法，即將固定液及固定步驟設(shè)置在組織脫水機外以及采用VAN-Clear取代二甲苯，確實能保證病理制片的質(zhì)量穩(wěn)定及診斷的安全可靠，還能有效的防止甲醛、二甲苯以及噪音對人體的危害，為病理實驗室有效控制空氣及噪音污染提供新的思路。還可以同時滿足不同實驗對固定液個性化要求，適用于多種臨床病理和科研工作；另外，降低設(shè)備的投入、節(jié)省大量的實驗室空間，提高實驗效率，完全可以替代傳統(tǒng)的方法。