兩種操作方法在EBER原位雜交染色中的比較與應用

李真真，王九菊，馬鈺*

（1陜西省人民醫(yī)院病理科，西安 710068；2陜西省人民醫(yī)院血研室，西安，710068）

EB 病毒 ( Epstein-Barr virus，EBV) 越來越受到人們的關注，這不僅因為它以潛伏感染的形式廣泛存在于健康人群，更重要的是它與越來越多的惡性腫瘤關系密切[1]。EB病毒編碼的小RNA(Epstein–Barr virus-encoded small RNAs，EBER)在被感染的細胞核中以高拷貝數(shù)存在[2]。因此，EBER的相關檢測已經成為EB病毒最重要的檢測手段。EBER 顯色原位雜交技術（chromogenicin situhybridization，CISH）具有定位作用，能夠確定病毒與組織和細胞關系，EBER 原位雜交已成為公認的標準方法[3]。目前在各大中型醫(yī)院中，EBER原位雜交主要采用的是手工染色的方法。隨著全自動免疫組化染色機的廣泛應用，EBER原位雜交也逐漸應用全自動免疫組織化學染色機進行。我們通過對兩種不同染色方法的對比研究，發(fā)現(xiàn)應用全自動免疫組織化學染色機的方法用時短，定位準確，對比鮮明，明顯優(yōu)于手工染色。

材料與方法

1 標本來源

選取陜西省人民醫(yī)院病理科EBER原位雜交陽性病例35例，其中胃髓樣癌1例，鼻咽癌16例，NK/T細胞淋巴瘤5例，Burkitt淋巴瘤2例，胃腺癌2例，彌漫大B細胞淋巴瘤2例，血管免疫母細胞T細胞淋巴瘤2例，經典型霍奇金淋巴瘤2例，淋巴組織不典型增生2例，急性重癥EBV感染1例。每例切片兩張，厚度4μm，分為儀器組和手工組。儀器組用全自動免疫組織化學染色機進行染色，手工組用手工染色的方法進行染色。

2 儀器設備

全自動免疫組織化學染色儀購自羅氏診斷公司，儀器型號為BenchMark XT。孵育盒、恒溫箱、雜交儀。

3 試劑

儀器組試劑為羅氏診斷公司生產的ISH Protease 3、INFORM EBER Probe、iVIEW Blue Detection、ISH Red Counterstain。手工組試劑為福州邁新公司生產的EBER檢測試劑盒。

4 EBER原位雜交全自動免疫組織化學染色機操作方法

①將切片經65℃烤片20min；②在電腦上選定染色項目為EBER，并輸入相應的病理號，打印標簽；③將標簽貼于對應的切片上，將貼好標簽的玻片放置于全自動免疫組化染色機的染色板上；④將染色過程所需要的試劑放置于染色架上，并檢查試劑瓶口是否有空氣柱和試劑結晶，檢查后將染色架放于染色機相應位置上；⑤開始運行程序，染色機全程自動染色，時長約5h；⑥染色結束后將切片從染色機中取出，充分洗滌，晾干后封片。

5 EBER原位雜交全自動免疫組織化學染色機染色程序

①脫蠟；②羅氏CC1緩沖液環(huán)境下細胞修復60min；③加入ISH Protease 3，消化20min；④加入EBER探針；⑤加入iVIEW blue試劑盒：Ivew Anti-fluorescein 孵育 20min，iview blue biotinylated lg孵育8min，iview blue SA-AP, 孵育16min；Ivew blue enhancer 孵育8min；Ivew blue NBT和BCIP孵育32min；⑥加入紅染試劑 Red Stain，孵育4min；⑦常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，樹膠封片。

6 EBER原位雜交手工染色方法

①將切片經65℃烤片20min；②切片經二甲苯和梯度酒精脫蠟至水；③組織滴加適量的消化酶，室溫下在濕盒中孵育3～7min（具體消化時間根據(jù)組織而定）；④蒸餾水漂洗，梯度乙醇脫水（75%、90%、100%各2min）;⑤組織干燥后，在切片樣本區(qū)域滴加適量的EBER探針，加蓋蓋玻片，并密封蓋玻片；⑥置于雜交儀或恒溫箱孵育盒中，37℃孵育14～18h；⑦移去蓋玻片，PBS緩沖液漂洗后滴加適量的鼠抗地高辛抗體，37℃濕盒中孵育30min；⑧PBS沖洗，滴加適量DAB顯色液，室溫下濕盒中孵育5min，自來水洗去顯色液；⑨蘇木素復染，脫水，透明，封片。

結 果

對兩組切片的染色效果進行比較發(fā)現(xiàn)，儀器組（圖A1、B1、C1、D1）35例染色均為陽性，陽性信號位于細胞核，為藍色，背景色為淡紅色，位于細胞質，顏色對比鮮明，較易判讀。手工組（圖A2、B2、C2、D2）35例染色均為陽性，陽性信號位于細胞核，呈棕黃色，背景色為淡藍色，同樣位于細胞核，背景色與陽性信號位于同一部位，對于陽性信號較弱的病例不易判讀。比較同一病例的儀器組和手工組的染色結果，可以看出，信號較強時，兩種方法都可以比較容易的判斷出陽性的結果，并計算出拷貝數(shù)。但在信號較弱時，手工組由于背景的影響，判讀和計數(shù)都較儀器組困難（圖C2）。

對兩種染色方法用時比較顯示，儀器組全程染色時間約5h，整個流程均由儀器獨立完成，無需技術人員操作，耗時短，且節(jié)約人力。手工組全程染色時間約為16h，每隔20～30min需要技術人員滴加各種試劑，且需要37℃過夜孵育最少14h，當天無法完成染色，與儀器組比較更加耗時耗力。

討 論

圖1 兩組切片的染色效果進行比較。A，Burkitt淋巴瘤標本EBER原位雜交陽性；B，胃髓樣癌標本EBER原位雜交陽性；C，鼻咽癌標本EBER原位雜交陽性；D，NK/T細胞淋巴瘤標本EBER原位雜交陽性（A1，B1，C1，D1為儀器組，A2，B2，C2，D2為手工組）；比例尺，100μmFig.1 Comparison of two methods in EBER staining. A, EBER is positive for in situ hybridization in Burkitt lymphoma specimens; B, EBER is positive for in situ hybridization in medullary carcinoma; C, EBER is positive for in situ hybridization in NPC specimens; D, EBER is positive for in situ hybridization in NK/T cell lymphoma specimens (A1-D1 is the instrument aided group, A2-D2 is the manual group); scale bar, 100μm

愛潑斯坦-巴爾病毒( Epstein-Barr virus，EBV)是一種廣泛存在的γ-皰疹病毒[4]，主要感染人類口咽部的上皮細胞和B淋巴細胞。它不僅以潛伏感染的形式廣泛存在于健康人群，更重要的是它與越來越多的惡性腫瘤關系密切[1]。有研究顯示，在扁桃體炎患者的扁桃體組織內可以檢測到EBV的基因[5]。另一些研究顯示，在鼻竇內翻性乳頭狀瘤患者中，有30%的病變組織中檢測到EBV病毒[6]。 更多的研究表明，EBV與某些類型的淋巴瘤有密切的關系。幾乎所有的結外NK/T細胞淋巴瘤為EBV陽性，在血管免疫母細胞T細胞淋巴瘤中也是如此。地方性Burkitt淋巴瘤幾乎在所有病人的惡性細胞中均可發(fā)現(xiàn)EBV的復制，霍奇金淋巴瘤的惡性細胞—R-S細胞中的EBV陽性率為40%[7]。最近的研究顯示，EBV陽性的彌漫大B細胞淋巴瘤，未特指型（DLBCL,NOS）是一種與EBV感染相關的淋巴瘤，標準化療方案預后不良[8]。除了淋巴瘤外，有研究顯示EBV感染是胃癌的另一個危險致病因素，病毒蛋白、EBER非編碼RNA和EBV miRNAs可以通過調節(jié)宿主基因組甲基化和基因表達而參與腫瘤的發(fā)生[9]。另外，有研究顯示，一種少見的肺腫瘤-原發(fā)性肺淋巴上皮瘤樣癌與EBV感染密切相關，與鱗癌相比，預后較好[10]。綜上所述，EBV的檢測不僅越來越多的應用于部分疾病的診斷，同時也能起到提示預后、指導治療的作用，因此，日益受到重視。目前，EBV病毒的檢測已經成為病理科用于某些疾病的輔助診斷，以及淋巴結反應性增生、淋巴瘤診斷分型的重要手段之一。

EBER特異序列的單鏈DNA探針能特異性地與EBER靶序列互補雜交，從而檢測EBV是否存在，且此方法用于檢測石蠟組織切片中的EBV具有極高的特異性和靈敏性。因此EBER原位雜交已成為組織和細胞中EBV的標準檢測方法[1]。EBER原位雜交是一項要求較高的實驗室技術，過程繁瑣，存在不穩(wěn)定因素和人為差異[11]。此項技術應用的初期，大部分實驗室采用手工的方法進行染色，隨著科學技術的發(fā)展，各大中型醫(yī)院病理科的儀器設備自動化程度越來越高，隨著病理工作量不斷增長，傳統(tǒng)的手工操作已經難以滿足工作需要，逐步被全自動化儀器操作取代[12]。

自動免疫組織化學染色機在EBER染色中的應用實現(xiàn)了自動化、規(guī)范化、標準化，避免了手工染色的人為誤差，使染色結果更加穩(wěn)定。手工染色的靈活性更高一些，可以根據(jù)不同的組織類型在染色過程中進行適當?shù)恼{整，與機器染色相比較，更加的節(jié)省試劑。機器染色和手工染色各有其優(yōu)缺點。①染色信號：儀器組染色結果陽性信號呈藍色，位于細胞核，背景呈紅色，位于細胞質。顏色對比鮮明，色差明顯，不易誤判。手工組染色結果陽性信號呈棕色，背景呈藍色。陽性信號與背景色著色部位均在細胞核。如蘇木素復染過深則容易將弱陽性信號覆蓋，導致誤判。②染色時間：儀器組染色全程約需要5h，手工組染色全程約需要16h。儀器染色不僅縮短了染色時間，而且可以在做EBER染色的同時進行免疫組化染色，提高了工作效率，有利于診斷報告的及時發(fā)出。③染色流程：儀器組在設定好染色程序之后，所有切片的染色流程均按照染色程序嚴格執(zhí)行，每一張切片均有獨立控溫加熱板，能夠保證染色過程中溫度與時間的控制，且切片不易被污染，實驗結果一致性較高。手工組進行染色時實驗操作人員易受外界因素的干擾，標本量較多時無法保證每一例標本的消化時間完全相同，因此容易造成人為誤差；我們的實驗中，就出現(xiàn)過因為操作人員實驗條件和過程的把控失誤造成手工染色失敗的情況。④試劑的使用量：羅氏全自動免疫組織化學染色機采用油膜封蓋技術，每張切片單種試劑的加樣量為100μl，此技術可保證試劑均勻覆蓋于整張切片上，無論組織大小與多少，均能保證切片的染色質量。手工組染色試劑直接滴加于組織上，如組織取材過大，則試劑的消耗量也相應的增加。⑤試劑成本：儀器組試劑成本比較昂貴，且需要借助于全自動免疫組化染色儀進行染色。手工組試劑相對價格比較低廉，更適合于基層醫(yī)院開展。⑥粘附載玻片的要求：儀器組對載玻片要求較高，只有正離子濃度較高的粘附載玻片才能達到最理想的染色效果，一般的粘附載玻片在染色前需經脫脂奶粉處理增加正離子濃度后才可進行上機染色，否則容易出現(xiàn)假陰性結果。手工組則對粘附載玻片沒有太多的要求，只要在染色過程中有足夠的粘附性，不掉片即可。⑦陽性及陰性對照的設置[13]，無論是儀器組還是手工組均需設置陽性對照和陰性對照，儀器組可以將對照組織與待測組織裱于同一張玻片上，相同的試劑量可以保證所有組織的染色，手工組則需要在對照組織和待測組織上分別滴加試劑，每一批次都會增加兩份試劑的使用量。

綜上所述，EBER檢測結果對一些疾病的診斷及治療有重要的指導意義，在病理科的日常工作中的應用越來越廣泛。快速、準確的檢測是相關病理診斷的必要條件。儀器染色和手工染色各有其優(yōu)缺點，我們在實際工作中可以根據(jù)各自實驗室的具體條件合理選擇適合自己的染色方法。儀器染色適合標本量大，技術人員少的醫(yī)院開展，手工染色則比較適合基層醫(yī)院開展。