• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    SPE-UPLC-MS/MS法鑒別含龜鱉甲的中成藥

    2022-02-25 09:56:02劉宇文鄒耀華
    中成藥 2022年2期
    關(guān)鍵詞:龜鱉甲類(lèi)專(zhuān)屬性

    劉宇文, 伍 勛, 諶 宇, 鄒耀華, 侯 娜

    (杭州市食品藥品檢驗(yàn)研究院,浙江 杭州 310022)

    鱉甲、龜甲均收載于2020年版《中國(guó)藥典》一部,均為單一來(lái)源中藥,分別為鱉的背甲和烏龜?shù)谋臣准案辜譡1],本課題組前期研究和有關(guān)文獻(xiàn)均顯示當(dāng)前混偽情況在龜鱉甲類(lèi)中藥中較多[2-3],這些混偽品有可能會(huì)轉(zhuǎn)移到中成藥中,因此其質(zhì)量如何也需要研究人員密切關(guān)注。

    傳統(tǒng)的性狀鑒別是龜鱉甲類(lèi)藥材的主要鑒別手段,但對(duì)于含該類(lèi)藥材的中成藥并不適用,分子鑒定技術(shù)在龜鱉甲類(lèi)藥材的報(bào)道較多,推廣到中成藥也還不成熟[4-7]。近年來(lái),特征肽段專(zhuān)屬性鑒別方法在膠類(lèi)藥材監(jiān)管中應(yīng)用成熟[8-13],課題組結(jié)合相關(guān)研究,擬將超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法與固相萃取小柱(SPE)聯(lián)合應(yīng)用,建立可用于檢測(cè)中成藥中11種龜鱉甲(烏龜、巴西紅耳龜、花龜、黃喉水龜、黃緣閉殼龜、緬甸陸龜、小鱷龜、印度楞背龜、鱉、角鱉、珍珠鱉)類(lèi)成分的專(zhuān)屬性方法。

    1 材料

    1.1 儀器 G6495B型超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)Agilent公司),配置MPP(MassProfiler Professional)(Ver.B.14.00)、MassHunter (Ver.B.10.00);XS205型電子天平(瑞士Mettler-Toledo公司);TW-8型恒溫水浴鍋(深圳市優(yōu)博萊科技有限公司)。

    1.2 試劑 Oasis 親生親油平衡固相萃取柱(美國(guó)Waters公司,批號(hào)150A37158B);測(cè)序用胰蛋白酶(美國(guó)Sigma公司,批號(hào)SLBZ8570)。碳酸氫銨(分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào)20190911);乙腈(美國(guó)Tedia公司,批號(hào)AS1122-001,質(zhì)譜純);甲酸(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司,批號(hào)100291,質(zhì)譜純);水為超純水。

    1.3 藥材 鱉TrionyxsinensisWiegmann、烏龜Chinemysreevesii(Grsy)、巴西紅耳龜Trachemysscriptaelegans(Wied.)、黃喉水龜Clemmysmutica(Cantor)、花龜Ocadiasinensis(Gray)、小鱷龜Chelydraserpentina(Linnaeus)、黃緣閉殼龜CyclemysflavomarginataGray.、緬甸陸龜Testudoelongate(Blyth)、印度楞背龜Kachugatectum(Gray)、角鱉Apalonespinifera、珍珠鱉Apaloneferox(Schneider)對(duì)照藥材經(jīng)杭州市食品藥品檢驗(yàn)研究院諸葛隴副主任中藥師鑒定為正品,標(biāo)本保存于杭州市食品藥品檢驗(yàn)研究院中藥天然藥物檢驗(yàn)所標(biāo)本室中。35批市售中成藥涉及19個(gè)品種,其中18批含鱉甲類(lèi)成分,17批含龜甲類(lèi)成分,具體見(jiàn)表1。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 分析條件

    2.1.1 色譜 Eclipse Plus十八烷基硅烷鍵合硅膠填料色譜柱(2.1 mm×150 mm,1.8 μm);流動(dòng)相乙腈(A)-0.1%甲酸(B),梯度洗脫,程序見(jiàn)表2;體積流量0.3 mL/min;柱溫35 ℃;進(jìn)樣量1 μL。

    2.1.2 質(zhì)譜 ESI+離子源;MRM模式,正負(fù)離子切換掃描;毛細(xì)管電壓4 kV;錐孔電壓166 V;源區(qū)溫度325 ℃;干燥氣溫度200 ℃;體積流量 14 L/min;霧化器壓力50 psi(1 psi=6.895 kPa);霧化氣、碰撞氣N2。

    2.1.3 特征離子對(duì)MRM條件建立 本課題組提取11種龜鱉甲的蛋白溶液,以胰蛋白酶酶解對(duì)照藥材溶液,利用高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(HPLC-Q-TOF)與化學(xué)統(tǒng)計(jì)分析相結(jié)合進(jìn)行分析,獲得的質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理,以分子特征提取模式提取保留時(shí)間和質(zhì)荷比(m/z)參數(shù),作為一個(gè)數(shù)據(jù)對(duì)(EMRT數(shù)據(jù)對(duì)),并剔除異常數(shù)據(jù)結(jié)果,保存為CEf文件。總離子流圖CEf文件采用MPP軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,11種龜鱉甲各自特征肽段信息被查找到,再將特征肽段信息導(dǎo)入安捷倫定性分析軟件Agilent Qualitative Analysis B.10.00進(jìn)行再驗(yàn)證確認(rèn),最終確定了11種龜鱉甲的專(zhuān)屬性特征肽段[3,14-15]。針對(duì)篩選出的特征肽段,通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜平臺(tái)建立MRM方法,詳細(xì)信息見(jiàn)表3。

    表1 中成藥信息

    表2 梯度洗脫程序

    表3 特征離子MRM采集參數(shù)

    2.2 對(duì)照藥材溶液制備 取對(duì)照藥材(粉碎,過(guò)4號(hào)篩)各約1 g,精密稱定,置于150 mL具塞錐形瓶中,加入50 mL超純水,稱定質(zhì)量,室溫浸泡1 h,加熱回流1 h,放冷,超純水補(bǔ)足減失的質(zhì)量,加入0.5 g NH4HCO3,使溶解并搖勻,濾過(guò),精密量取續(xù)濾液1 mL至5 mL量瓶中,加新制胰蛋白酶溶液1 mL(1 mg/mL 1%NH4HCO3溶液),1%NH4HCO3溶液稀釋?zhuān)ㄈ葜量潭?,搖勻,37 ℃酶解12 h,即得[3]。

    2.3 供試品溶液制備 取35批樣品(固體粉碎并過(guò)4號(hào)篩,液體適量混勻)適量,加入超純水混勻(約相當(dāng)于處方中原藥材1 g),精密稱定質(zhì)量,置于150 mL具塞錐形瓶中,按“2.2”項(xiàng)下方法制備,再用HLB固相萃取小柱凈化酶解液,即得。

    2.4 陰性樣品溶液制備 按照處方制備不含龜鱉甲類(lèi)成分的陰性樣品適量,按“2.3”項(xiàng)下方法制備,即得。

    2.5 肽段純化及條件優(yōu)化 采用HLB固相萃取小柱凈化酶解液[16],先進(jìn)行HLB固相萃取小柱活化(依次用1 mL甲醇、1 mL 1%甲酸活化),然后取1 mL 對(duì)照品酶解液加到SPE小柱上,再依次用5%甲醇、1%甲酸進(jìn)行洗脫,用1 mL含1%甲酸-乙腈(80∶20)溶液分次洗脫,收集洗脫液,洗脫液用氮?dú)獯蹈?,?00 μL含0.1%甲酸-乙腈(95∶5)復(fù)溶,為進(jìn)一步考察固相萃取過(guò)程對(duì)目標(biāo)特征多肽的損失,分別取11種龜鱉甲對(duì)照藥材酶解溶液過(guò)HLB柱,結(jié)果見(jiàn)表4。

    表4 對(duì)照藥材特征肽固相萃取純化效果(n=3)

    2.6 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 按“2.4”項(xiàng)下方法制備大補(bǔ)陰丸的陰性樣品溶液,再以龜甲對(duì)照藥材、含龜甲類(lèi)成分中成藥為陽(yáng)性對(duì)照,按“2.3”項(xiàng)下方法制備相應(yīng)陽(yáng)性對(duì)照藥材溶液,選擇龜甲(烏龜)特征離子對(duì)m/z442.7(雙電荷)~631.3和m/z442.7(雙電荷)~560.3,在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)圖1。由此可知,在與陽(yáng)性對(duì)照藥材溶液色譜圖中相應(yīng)位置上,陰性樣品未出現(xiàn)相應(yīng)特征離子對(duì)色譜峰,表明該方法具有良好的專(zhuān)屬性。同法對(duì)其他中成藥進(jìn)行專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn),也得到類(lèi)似結(jié)果。

    2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取對(duì)照藥材適量,按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,于0、6、12、18、24、48 h在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定,測(cè)得烏龜甲、鱉甲、巴西紅耳龜甲、花龜甲、黃喉水龜甲、黃緣閉殼龜甲、緬甸陸龜甲、小鱷龜甲、印度楞背龜甲、角鱉甲、珍珠鱉甲峰面積RSD分別為6.6%、5.4%、4.9%、7.1%、6.6%、8.2%、5.3%、5.8%、5.7%、6.2%、4.7%,表明溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    注:1為質(zhì)荷比442.7(雙電荷)~560.0,2為質(zhì)荷比442.7(雙電荷)~631.0。圖1 龜甲類(lèi)成分的特征分子離子峰色譜圖

    2.8 檢測(cè)限 將對(duì)照藥材溶液逐級(jí)稀釋后,在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定,以信噪比3∶1為檢測(cè)限,測(cè)得烏龜甲、鱉甲、巴西紅耳龜甲、花龜甲、黃喉水龜甲、黃緣閉殼龜甲、緬甸陸龜甲、小鱷龜甲、印度楞背龜甲、角鱉甲、珍珠鱉甲檢測(cè)限分別為0.04、0.1、0.1、0.8、2、1、0.1、1、1、0.5、0.1 g/L。

    2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批大補(bǔ)陰丸6份(批號(hào)181014),按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,采用龜甲(烏龜)的特征離子對(duì)m/z442.7(雙電荷)~631.3和m/z442.7(雙電荷)~560.3,在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定,測(cè)得上述特征離子對(duì)峰均有檢出,表明該方法重復(fù)性良好。

    2.10 結(jié)果分析 18批含鱉甲的中成藥均檢出鱉甲(鱉)類(lèi)成分,其中還有1批檢出珍珠鱉甲類(lèi)成分;17批次含龜甲類(lèi)成分中成藥中有2批只檢出龜甲(烏龜)類(lèi)成分,6批只檢出巴西紅耳龜甲類(lèi)成分,4批同時(shí)檢出龜甲、巴西紅耳龜甲類(lèi)成分,3批同時(shí)檢出龜甲、巴西紅耳龜甲、小鱷龜甲類(lèi)成分,1批同時(shí)檢出龜甲、巴西紅耳龜甲、小鱷龜龜甲、緬甸陸龜甲、花龜甲及鱉甲類(lèi)成分,1批未檢出龜甲類(lèi)成分,可能未投料或投料量太少。由此可知,含龜甲的中成藥大多存在偽品混充或者摻偽情況,僅12%的原料藥材基源符合2020年版《中國(guó)藥典》規(guī)定,提示各有關(guān)部門(mén)應(yīng)對(duì)該類(lèi)中成藥的質(zhì)量控制引起足夠重視,雖然含鱉甲的中成藥情況稍好,但有關(guān)部門(mén)也需加強(qiáng)監(jiān)管。

    3 討論

    龜鱉甲類(lèi)藥材在我國(guó)使用歷史悠久,均具有補(bǔ)陰益氣的功效,也是眾多中成藥的原料,例如大補(bǔ)陰丸、小兒肺咳顆粒、龜鹿二仙膏、化癥回生片、龜鱉丸、鹿龜酒等。前期研究發(fā)現(xiàn),龜甲摻偽情況較為嚴(yán)重,例如,巴西紅耳龜、小鱷龜、中華花龜?shù)?,常有混入龜鱉甲藥材中。由于龜鱉甲類(lèi)藥材品種基源的混亂,必然會(huì)造成含龜鱉甲的中成藥質(zhì)量的不可控,不利于該類(lèi)中成藥的系統(tǒng)深入研究,也將增加監(jiān)管的和風(fēng)險(xiǎn)和難度,同時(shí),國(guó)家已出臺(tái)一些列法律法規(guī)加強(qiáng)對(duì)野生動(dòng)物的保護(hù),如何防止諸如緬甸陸龜?shù)缺Wo(hù)野生進(jìn)入中藥領(lǐng)域,也是急需研究的課題。

    龜鱉甲類(lèi)藥材傳統(tǒng)性狀鑒別存在著很大的局限性,而中成藥中的龜鱉甲類(lèi)成分已粉碎或提取過(guò),性狀鑒別更是無(wú)能為力。龜鱉甲類(lèi)藥材報(bào)道較多的DNA分子鑒定技術(shù),應(yīng)用于中成藥尚有一定難度。蛋白質(zhì)、多肽等成分在龜鱉甲類(lèi)藥材占主要部分,也是其重要的活性成分之一,利用串聯(lián)質(zhì)譜識(shí)別不同種源的龜鱉甲類(lèi)藥材酶解后的溶液,可達(dá)到鑒別的目的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合前期相關(guān)研究,最終建立了適合多種含龜鱉甲類(lèi)中成藥的串聯(lián)質(zhì)譜特征肽專(zhuān)屬性檢測(cè)方法。本實(shí)驗(yàn)所建立的串聯(lián)質(zhì)譜特征肽檢測(cè)方法專(zhuān)屬性強(qiáng),可用于含龜鱉甲類(lèi)成分中成藥質(zhì)量控制,鑒于每種中成藥中龜鱉甲類(lèi)藥材的投料比例有所不同,建議檢測(cè)時(shí)適當(dāng)調(diào)整取樣量,本課題組下一步將擬研究建立含龜鱉甲類(lèi)成分中成藥特征離子含量測(cè)定方法,用于該類(lèi)中成藥的控制質(zhì)量。

    研究發(fā)現(xiàn),由于多為生粉投料,含龜鱉甲類(lèi)成分中成藥采用超聲法提取效率不高[17-18],最終確定采用加熱回流提取法提取,效果較好。研究還發(fā)現(xiàn),對(duì)照品酶解液含較多雜質(zhì)會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果有影響,可用固相萃取小柱來(lái)凈化,先用5%甲醇可清洗極性大的蛋白質(zhì)等物質(zhì)和鹽,也可以防止孔堵塞,再20%酸性乙腈可洗脫目標(biāo)物,非目標(biāo)物留在固相萃取小柱上,達(dá)到了凈化酶解液的目的。

    從實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析,由于龜甲價(jià)格遠(yuǎn)高于巴西紅耳龜甲,龜甲類(lèi)成分中成藥中主要混偽品為巴西紅耳龜甲[3],質(zhì)量不容樂(lè)觀,建議急需加強(qiáng)監(jiān)管。另外,含鱉甲類(lèi)成分中成藥檢測(cè)結(jié)果,僅1批檢出混淆珍珠鱉甲類(lèi)成分,表明質(zhì)量狀況尚好,可能因?yàn)轺M養(yǎng)殖量已經(jīng)非常大,成熟的養(yǎng)殖技術(shù)完全能夠滿足臨床用藥需要。

    猜你喜歡
    龜鱉甲類(lèi)專(zhuān)屬性
    推動(dòng)龜鱉產(chǎn)業(yè)精深加工發(fā)展
    妨害傳染病防治罪:澄清、辯護(hù)與設(shè)想
    亞洲首次發(fā)現(xiàn)侏羅紀(jì)早期有甲類(lèi)恐龍
    云南玉溪發(fā)現(xiàn)迄今最完整的覆遁甲類(lèi)恐龍化石——科式玉溪龍
    龜鱉類(lèi)不可能是新冠病毒的中間宿主
    來(lái)自一線的聲音! 泥鰍、牛蛙、龜鱉等被一刀切禁售,整條產(chǎn)業(yè)鏈?zhǔn)苤貏?chuàng)
    婚禮主持文案的四種特性
    藝海(2018年2期)2018-08-29 00:04:46
    建立柴連口服液中柴胡鑒別的薄層色譜法
    高效液相色譜法定性鑒別人參口服液中人參皂苷Rg1、Re的方法研究
    跨組織網(wǎng)絡(luò)中的知識(shí)流動(dòng)性與知識(shí)專(zhuān)屬性對(duì)創(chuàng)新績(jī)效的影響研究
    男女床上黄色一级片免费看| 欧美国产精品va在线观看不卡| 大码成人一级视频| 国产精品偷伦视频观看了| 性色av乱码一区二区三区2| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 少妇 在线观看| 黄色毛片三级朝国网站| 大型av网站在线播放| 国产精品.久久久| 丝瓜视频免费看黄片| 欧美不卡视频在线免费观看 | 亚洲 欧美一区二区三区| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 这个男人来自地球电影免费观看| 午夜福利在线免费观看网站| 国产蜜桃级精品一区二区三区 | 国产精品.久久久| 国产精品久久久人人做人人爽| 国产精品国产高清国产av | 国产精品久久久av美女十八| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 看免费av毛片| 在线av久久热| 国产精品成人在线| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 丁香欧美五月| 好男人电影高清在线观看| 亚洲欧美激情在线| 精品福利观看| 曰老女人黄片| 成年人午夜在线观看视频| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 性少妇av在线| 在线观看日韩欧美| 一区二区三区精品91| 99re6热这里在线精品视频| 国产av一区二区精品久久| 一级a爱片免费观看的视频| 欧美日韩av久久| 高清av免费在线| 欧美丝袜亚洲另类 | 母亲3免费完整高清在线观看| 丝袜美腿诱惑在线| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 十八禁网站免费在线| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 丰满饥渴人妻一区二区三| 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲精品乱久久久久久| 久久这里只有精品19| 18在线观看网站| 一夜夜www| 91精品三级在线观看| 黄片小视频在线播放| 国产高清激情床上av| 国产在线观看jvid| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 国产成人免费无遮挡视频| 人人澡人人妻人| 精品一区二区三区av网在线观看| 大片电影免费在线观看免费| 老司机福利观看| 日本vs欧美在线观看视频| 日本wwww免费看| 欧美日韩视频精品一区| 高清黄色对白视频在线免费看| 国产一区二区激情短视频| 国产免费现黄频在线看| 男女床上黄色一级片免费看| 一级a爱片免费观看的视频| 精品视频人人做人人爽| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 日本欧美视频一区| 婷婷精品国产亚洲av在线 | 在线天堂中文资源库| 捣出白浆h1v1| 国产欧美日韩精品亚洲av| 欧美黄色片欧美黄色片| 欧美午夜高清在线| 欧美黑人精品巨大| 日韩成人在线观看一区二区三区| 中文字幕制服av| 午夜视频精品福利| 日本黄色视频三级网站网址 | 欧美在线黄色| 在线观看一区二区三区激情| 精品亚洲成国产av| 亚洲精品在线观看二区| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产成人欧美| 国产一区二区三区视频了| 国产99白浆流出| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 看黄色毛片网站| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 真人做人爱边吃奶动态| 久久青草综合色| 中文字幕最新亚洲高清| 国产精品 欧美亚洲| 亚洲免费av在线视频| 久久久久国产一级毛片高清牌| 操美女的视频在线观看| 亚洲人成伊人成综合网2020| av片东京热男人的天堂| 免费在线观看亚洲国产| 大码成人一级视频| 正在播放国产对白刺激| 国产在线精品亚洲第一网站| 淫妇啪啪啪对白视频| 中文字幕av电影在线播放| 国产激情欧美一区二区| 亚洲精品av麻豆狂野| 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲中文日韩欧美视频| 黄色毛片三级朝国网站| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 免费日韩欧美在线观看| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 99国产综合亚洲精品| 免费人成视频x8x8入口观看| 人成视频在线观看免费观看| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 51午夜福利影视在线观看| 交换朋友夫妻互换小说| 大型av网站在线播放| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 午夜福利在线免费观看网站| 大香蕉久久网| 十八禁网站免费在线| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 亚洲五月婷婷丁香| 大型av网站在线播放| 一级片免费观看大全| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 天堂√8在线中文| 久久久水蜜桃国产精品网| 精品久久久久久久毛片微露脸| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 亚洲欧美色中文字幕在线| 国产一区有黄有色的免费视频| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 午夜福利乱码中文字幕| 国产不卡一卡二| 丰满的人妻完整版| 日韩三级视频一区二区三区| 国产免费现黄频在线看| 人成视频在线观看免费观看| 丝袜人妻中文字幕| 国产av又大| aaaaa片日本免费| www.精华液| 国产精品一区二区在线不卡| xxx96com| 一区二区三区国产精品乱码| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 热re99久久精品国产66热6| 嫩草影视91久久| 久久精品国产a三级三级三级| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| www.999成人在线观看| 五月开心婷婷网| 大陆偷拍与自拍| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 99国产精品一区二区蜜桃av | 怎么达到女性高潮| 不卡av一区二区三区| 久久婷婷成人综合色麻豆| 在线观看免费视频网站a站| 一夜夜www| 操美女的视频在线观看| 国产人伦9x9x在线观看| svipshipincom国产片| 国产99久久九九免费精品| 黑人操中国人逼视频| 国产精品二区激情视频| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 国产精品国产av在线观看| 黄片小视频在线播放| 成人亚洲精品一区在线观看| 成在线人永久免费视频| 久久久久久久午夜电影 | 精品国产国语对白av| 曰老女人黄片| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 超碰97精品在线观看| 一二三四在线观看免费中文在| 黄色 视频免费看| 天天影视国产精品| av欧美777| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 色94色欧美一区二区| 成人亚洲精品一区在线观看| 亚洲国产欧美一区二区综合| 久99久视频精品免费| 国产精品永久免费网站| 超碰成人久久| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 国产亚洲精品久久久久5区| 午夜福利在线免费观看网站| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 亚洲av熟女| 色精品久久人妻99蜜桃| 男女下面插进去视频免费观看| 亚洲精华国产精华精| 操出白浆在线播放| 最新在线观看一区二区三区| 国产片内射在线| 9色porny在线观看| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产乱人伦免费视频| 国产一区二区三区视频了| 日韩成人在线观看一区二区三区| 国产一卡二卡三卡精品| 成人亚洲精品一区在线观看| 黄色视频,在线免费观看| 日韩大码丰满熟妇| 99香蕉大伊视频| 黑人猛操日本美女一级片| 窝窝影院91人妻| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 不卡一级毛片| videos熟女内射| 国产精品免费一区二区三区在线 | 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 亚洲熟妇熟女久久| 国产精品 国内视频| 国产亚洲欧美98| 中文字幕最新亚洲高清| 中文字幕高清在线视频| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 飞空精品影院首页| 国产一区在线观看成人免费| avwww免费| 天天操日日干夜夜撸| aaaaa片日本免费| 黄色a级毛片大全视频| 亚洲一区二区三区不卡视频| 国产成人欧美| 亚洲第一青青草原| 男女之事视频高清在线观看| 国产麻豆69| 脱女人内裤的视频| a级毛片黄视频| 搡老岳熟女国产| av有码第一页| 欧美日韩成人在线一区二区| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 国产激情欧美一区二区| 国产视频一区二区在线看| 国产xxxxx性猛交| 人妻一区二区av| 母亲3免费完整高清在线观看| 成年女人毛片免费观看观看9 | 99热网站在线观看| xxxhd国产人妻xxx| 黄色成人免费大全| 欧美av亚洲av综合av国产av| 1024香蕉在线观看| 亚洲av欧美aⅴ国产| 人成视频在线观看免费观看| 黄片小视频在线播放| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 午夜视频精品福利| 亚洲男人天堂网一区| 成人手机av| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 在线观看免费视频日本深夜| 久热这里只有精品99| 人成视频在线观看免费观看| 中文字幕色久视频| 曰老女人黄片| 在线观看一区二区三区激情| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 欧美一级毛片孕妇| 成年版毛片免费区| 国产主播在线观看一区二区| 这个男人来自地球电影免费观看| 久久久久久久久免费视频了| 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 一区在线观看完整版| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国产亚洲一区二区精品| 久久久水蜜桃国产精品网| 亚洲人成电影免费在线| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲精品国产区一区二| 亚洲熟妇熟女久久| 免费不卡黄色视频| 欧美乱码精品一区二区三区| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 嫁个100分男人电影在线观看| 久久 成人 亚洲| 国产精品久久久av美女十八| 麻豆av在线久日| 国产高清国产精品国产三级| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 1024香蕉在线观看| tocl精华| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产成人欧美| 啦啦啦 在线观看视频| 久久香蕉激情| 色播在线永久视频| 午夜福利欧美成人| 亚洲五月婷婷丁香| 脱女人内裤的视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 日本a在线网址| 中出人妻视频一区二区| 下体分泌物呈黄色| 久久久久精品人妻al黑| 日韩中文字幕欧美一区二区| 精品一区二区三卡| 高清毛片免费观看视频网站 | 十八禁人妻一区二区| 国产成人精品久久二区二区免费| 精品久久久久久,| 男女下面插进去视频免费观看| 欧美国产精品一级二级三级| 国产99白浆流出| av有码第一页| 十分钟在线观看高清视频www| 成年版毛片免费区| www.999成人在线观看| 性少妇av在线| 欧美日韩黄片免| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 亚洲三区欧美一区| 午夜福利,免费看| 午夜老司机福利片| 亚洲av片天天在线观看| 男女午夜视频在线观看| 亚洲国产欧美一区二区综合| 久久青草综合色| 村上凉子中文字幕在线| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产三级黄色录像| 大片电影免费在线观看免费| 国产精品98久久久久久宅男小说| 欧美黄色片欧美黄色片| 美女 人体艺术 gogo| 老司机亚洲免费影院| 黄片小视频在线播放| 操出白浆在线播放| 搡老熟女国产l中国老女人| 久久中文看片网| aaaaa片日本免费| 欧美不卡视频在线免费观看 | 丰满迷人的少妇在线观看| 成人av一区二区三区在线看| 中文字幕人妻丝袜制服| 美女扒开内裤让男人捅视频| 在线观看www视频免费| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| www.熟女人妻精品国产| 丝袜在线中文字幕| 亚洲av日韩在线播放| 我的亚洲天堂| 91字幕亚洲| 久久久久国内视频| 中文字幕最新亚洲高清| 男人舔女人的私密视频| 电影成人av| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 人人澡人人妻人| 国产在线观看jvid| 丝袜人妻中文字幕| 午夜91福利影院| 宅男免费午夜| 极品人妻少妇av视频| 九色亚洲精品在线播放| 午夜福利在线免费观看网站| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 久久久久久人人人人人| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 91九色精品人成在线观看| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 日韩中文字幕欧美一区二区| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 久久热在线av| 一级a爱片免费观看的视频| 久久性视频一级片| 欧美国产精品va在线观看不卡| 一二三四社区在线视频社区8| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 亚洲精品中文字幕在线视频| 欧美日韩乱码在线| www.熟女人妻精品国产| av线在线观看网站| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 欧美日本中文国产一区发布| 成人国语在线视频| 亚洲成人免费电影在线观看| 久久中文字幕一级| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产高清激情床上av| 久久这里只有精品19| 精品福利观看| 天堂动漫精品| 夫妻午夜视频| 色在线成人网| 午夜精品久久久久久毛片777| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 免费观看人在逋| 精品一区二区三区av网在线观看| 精品久久久久久,| 无人区码免费观看不卡| 97人妻天天添夜夜摸| 日本黄色日本黄色录像| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 国产成人免费无遮挡视频| 日本欧美视频一区| 男人操女人黄网站| 一二三四在线观看免费中文在| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 国产成人av激情在线播放| 国产xxxxx性猛交| 黄色片一级片一级黄色片| 又紧又爽又黄一区二区| 久久精品国产亚洲av高清一级| 成人精品一区二区免费| 深夜精品福利| 免费av中文字幕在线| 乱人伦中国视频| 男人操女人黄网站| 亚洲一区中文字幕在线| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 一级毛片高清免费大全| 久久中文看片网| 亚洲avbb在线观看| 国产日韩欧美亚洲二区| 91国产中文字幕| 亚洲专区字幕在线| 99国产精品免费福利视频| 午夜久久久在线观看| 精品亚洲成国产av| 国产国语露脸激情在线看| 精品国产亚洲在线| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 午夜福利影视在线免费观看| 久久久国产精品麻豆| 免费观看精品视频网站| avwww免费| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 不卡av一区二区三区| 美女高潮到喷水免费观看| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 午夜福利乱码中文字幕| 99久久精品国产亚洲精品| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 超色免费av| 下体分泌物呈黄色| 精品免费久久久久久久清纯 | 欧美黑人欧美精品刺激| www.精华液| 丁香欧美五月| av片东京热男人的天堂| 亚洲精品中文字幕在线视频| 天天操日日干夜夜撸| 中文字幕高清在线视频| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 亚洲美女黄片视频| 大码成人一级视频| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 久99久视频精品免费| 久久久精品区二区三区| 久久精品成人免费网站| 757午夜福利合集在线观看| 亚洲九九香蕉| 亚洲av片天天在线观看| 岛国毛片在线播放| 国产99久久九九免费精品| 亚洲男人天堂网一区| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 亚洲片人在线观看| 色综合欧美亚洲国产小说| 村上凉子中文字幕在线| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 激情视频va一区二区三区| 国产成人影院久久av| 欧美精品啪啪一区二区三区| 久久中文字幕人妻熟女| 91在线观看av| 美女高潮到喷水免费观看| xxxhd国产人妻xxx| 日韩欧美三级三区| av天堂久久9| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 99久久人妻综合| 老司机午夜十八禁免费视频| ponron亚洲| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 欧美日韩亚洲高清精品| 91国产中文字幕| 在线观看www视频免费| 亚洲国产欧美一区二区综合| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 91精品三级在线观看| 9色porny在线观看| 午夜福利,免费看| 国产成人av激情在线播放| 久久久久精品人妻al黑| 黑人欧美特级aaaaaa片| 高清视频免费观看一区二区| 最近最新中文字幕大全电影3 | 亚洲,欧美精品.| 国产片内射在线| 一区二区日韩欧美中文字幕| av网站在线播放免费| 在线视频色国产色| 亚洲精品乱久久久久久| 新久久久久国产一级毛片| 国产区一区二久久| 91成人精品电影| 两人在一起打扑克的视频| videos熟女内射| 国产成人欧美在线观看 | 亚洲欧美激情综合另类| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 国产麻豆69| av天堂在线播放| 免费不卡黄色视频| 18禁观看日本| 三级毛片av免费| 亚洲 国产 在线| 三级毛片av免费| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 日本wwww免费看| 精品亚洲成a人片在线观看| 99久久精品国产亚洲精品| 日本五十路高清| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 精品亚洲成国产av| 成年女人毛片免费观看观看9 | 天堂中文最新版在线下载| 欧美性长视频在线观看| 人成视频在线观看免费观看| 欧美精品亚洲一区二区| a在线观看视频网站| 亚洲精品国产区一区二| 久久香蕉激情| 亚洲全国av大片| 免费不卡黄色视频| av在线播放免费不卡| 日韩欧美在线二视频 | 法律面前人人平等表现在哪些方面| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 热99久久久久精品小说推荐| 久久人妻av系列| 国产欧美日韩精品亚洲av| 99国产精品99久久久久| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | videosex国产| 色综合婷婷激情| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 精品国产国语对白av| 狠狠狠狠99中文字幕| 手机成人av网站| 久久久久国内视频| 一区二区三区激情视频| 一区在线观看完整版| 老熟女久久久| 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲国产看品久久| 欧美另类亚洲清纯唯美| 宅男免费午夜| 国产成人免费无遮挡视频| 老司机影院毛片| 老司机亚洲免费影院| 视频在线观看一区二区三区| 精品国产亚洲在线| 久9热在线精品视频| 中文字幕制服av| 免费不卡黄色视频| 一a级毛片在线观看| 91大片在线观看| 美女高潮到喷水免费观看| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 极品教师在线免费播放| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 日韩大码丰满熟妇| 老汉色∧v一级毛片| 国产成人av教育| 丁香欧美五月| 亚洲综合色网址| 国产91精品成人一区二区三区| av国产精品久久久久影院| 国产av精品麻豆| 曰老女人黄片| 午夜精品在线福利| 99国产极品粉嫩在线观看| 人妻久久中文字幕网| 国产精品免费一区二区三区在线 | 欧美亚洲日本最大视频资源| 热99re8久久精品国产| 搡老岳熟女国产|