縫隙連接蛋白在牙周組織中的表達(dá)及與牙周疾病的關(guān)系

胡麗霞 管翠強(qiáng)

牙周組織包括牙齦、牙周膜、牙槽骨和牙骨質(zhì)。牙周疾病是特指只發(fā)生在牙周組織上的各種疾病。目前發(fā)現(xiàn)牙周炎成為牙脫落的首要因素[1]，缺失牙齒越多，與口腔相關(guān)生活質(zhì)量也就相應(yīng)下降[2]。近期有學(xué)者通過孟德爾隨機(jī)化研究法還發(fā)現(xiàn)牙周疾病可能增加患者對新型冠狀病毒的易感性及其嚴(yán)重性[3]。由此可見，牙周組織的健康對于全身健康及其疾病預(yù)防的重要性。因此了解影響牙周組織健康及疾病的具體機(jī)制顯得至關(guān)重要?？p隙連接蛋白（connexins，Cx）參與各組織細(xì)胞間連接，與細(xì)胞營養(yǎng)代謝、增殖分化、組織修復(fù)以及炎癥反應(yīng)相關(guān)[4]。其中牙周組織生長發(fā)育過程受到Cx調(diào)控，且Cx在牙周組織炎癥性疾病以及牙齦創(chuàng)傷愈合過程中的作用已受到廣泛關(guān)注。

一、縫隙連接蛋白

1.Cx的結(jié)構(gòu)

Cx含有四個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域、兩個(gè)細(xì)胞外環(huán)、一個(gè)細(xì)胞質(zhì)環(huán)，其羧基端和氨基端位于細(xì)胞質(zhì)中。依據(jù)分子量大小對其進(jìn)行命名，目前在人體已發(fā)現(xiàn)21種Cx，其中Cx43是體內(nèi)表達(dá)最廣泛的Cx[5]。每6個(gè)桿狀的Cx分子圍成一個(gè)連接小體，來自相鄰細(xì)胞的兩個(gè)連接小體在細(xì)胞外相互對接，形成一個(gè)完整的細(xì)胞間交通管道，即縫隙連接。縫隙連接允許小分子通過，例如離子、環(huán)磷酸腺苷、三磷酸腺苷、葡萄糖、氨基酸、維生素等[6]。

2.Cx的功能

Cx的功能與其形成的連接小體及縫隙連接相關(guān)。正常情況下縫隙連接是開放的，連接小體是關(guān)閉的;但病理?xiàng)l件可能會(huì)限制縫隙連接的通信，促進(jìn)連接小體的開放，從而擾亂微妙的細(xì)胞通信平衡[5]。研究發(fā)現(xiàn)，Cx不僅可以維持細(xì)胞間通信平衡，還幾乎參與了細(xì)胞的整個(gè)生命周期，包括細(xì)胞的生長、增殖、分化以及凋亡等[7]；Cx作為電偶聯(lián)的基礎(chǔ)，介導(dǎo)了神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞等可興奮細(xì)胞之間電信號(hào)的傳導(dǎo)[8，9]；Cx有助于組織細(xì)胞創(chuàng)傷修復(fù)[10]；而且Cx在機(jī)體免疫及其內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)等方面發(fā)揮重要作用[11]。

二、Cx與牙周組織

1.牙齦

牙齦是覆蓋在牙槽突表面和牙頸部周圍的口腔咀嚼黏膜，牙齦上皮依據(jù)形態(tài)和功能被劃分為3個(gè)區(qū):結(jié)合上皮、溝內(nèi)上皮和口腔上皮[1]。Zhang等[12]發(fā)現(xiàn)健康小鼠牙齦上皮Cx43主要表達(dá)于結(jié)合上皮和溝內(nèi)上皮，并在口腔上皮中有少量表達(dá)。但是Hatakeyama等[13]通過免疫熒光檢查接受翻瓣手術(shù)患者的健康牙齦上皮中Cx43的表達(dá)，其在口腔上皮、溝內(nèi)上皮呈陽性表達(dá)，在結(jié)合上皮中為弱陽性表達(dá)，并且主要分布在棘層。Cx43是牙齦成纖維細(xì)胞表達(dá)的主要Cx[14，15]。小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA)可抑制Cx43的表達(dá)，通過siRNA作用于牙齦成纖維細(xì)胞，結(jié)果顯示Cx43 mRNA表達(dá)下調(diào)80%，且Cx43免疫反應(yīng)性明顯降低[16]。

2.牙周膜

牙周膜是圍繞牙根連接牙根和牙槽骨的致密結(jié)締組織[1]。有研究表明Cx43強(qiáng)烈表達(dá)于牙周膜[17]。在牙周膜成纖維細(xì)胞中可表達(dá)Cx32、Cx40、Cx43、Cx45[18]。有學(xué)者[19]研究發(fā)現(xiàn)牙周膜成纖維細(xì)胞受力后，Cx43 mRNA及蛋白的表達(dá)隨受力時(shí)間的增加而明顯上調(diào)，并證明周期性牽張力可以通過Cx43介導(dǎo)的信號(hào)通路調(diào)節(jié)其細(xì)胞的成骨、破骨相關(guān)生物因子的變化，從而有利于了解正畸牙移動(dòng)機(jī)制。Yu等[20]在大鼠模型中發(fā)現(xiàn)在牙周膜細(xì)胞移植后有明顯的牙槽骨和牙周膜再生，免疫組化顯示移植的牙周膜細(xì)胞附近骨橋蛋白和縫隙連接蛋白染色增強(qiáng)。在牙周膜干細(xì)胞中Cx43是表達(dá)最廣泛的Cx[21]。有實(shí)驗(yàn)[22]表明微小RNA（microRNA，miRNA）-125b可以靶向抑制Cx43，當(dāng)使用miRNA-125b轉(zhuǎn)染人牙周膜干細(xì)胞后，其細(xì)胞活性降低，細(xì)胞毒性增加，堿性磷酸酶活性、鈣水平和成骨相關(guān)基因表達(dá)明顯降低。因此說明Cx43可能參與調(diào)節(jié)牙周膜干細(xì)胞的功能及作用。

3.牙槽骨

牙槽骨是頜骨包圍和支持牙根的部分，是牙周組織中代謝、改建最活躍的部分[1]?？p隙連接參與骨修復(fù)、骨再生。Cx缺失會(huì)導(dǎo)致骨折延遲愈合、骨形態(tài)改變[23]。研究[24]表明牙釉質(zhì)基質(zhì)蛋白顯著增加了Cx43的表達(dá)，從而增強(qiáng)了成骨細(xì)胞的分化和礦化活性，刺激牙周組織包括牙周膜、牙骨質(zhì)和牙槽骨的再生。編碼Cx43的基因突變是眼牙指發(fā)育不良綜合征的原因，Moore等[25]學(xué)者建立眼牙指發(fā)育不良綜合征小鼠模型并通過顯微計(jì)算機(jī)斷層掃描成像，并對下頜形狀及尺寸進(jìn)行分析，顯示編碼Cx43基因突變的小鼠下頜骨畸形，下頜骨體積較小，且組織學(xué)分析顯示，與野生型同窩小鼠相比，突變小鼠下頜骨膜內(nèi)骨的骨化不足。

Cx與牙槽骨的機(jī)械力傳導(dǎo)有關(guān)。Moore等[25]發(fā)現(xiàn)Cx43基因突變小鼠最大的表型差異集中在暴露于機(jī)械力的區(qū)域，如牙槽骨、肌肉附著部位和關(guān)節(jié)表面。實(shí)驗(yàn)[18]結(jié)果表明，機(jī)械張力可增加Cx43的表達(dá)，進(jìn)一步上調(diào)成骨細(xì)胞信號(hào)分子（如Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2），和下調(diào)破骨細(xì)胞信號(hào)分子（如細(xì)胞核因子κB受體活化因子配體），從而促進(jìn)骨形成。相反，通過siRNA抑制Cx43基因可抑制成骨細(xì)胞相關(guān)分子的增加，但增強(qiáng)破骨細(xì)胞信號(hào)分子的表達(dá)。因此，周期性機(jī)械張力可能通過Cx43參與調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞的分化。但同時(shí)Plotkin[26]發(fā)現(xiàn)，成骨細(xì)胞中表達(dá)的Cx43對機(jī)械刺激的反應(yīng)并不是必需的。Takemura等[27]通過培養(yǎng)骨細(xì)胞，并使用鈦板模擬種植體周的咬合負(fù)荷，在此負(fù)荷下Cx43的表達(dá)顯著增加且凋亡骨細(xì)胞數(shù)明顯增多;在大鼠模型中植入鈦種植體作為負(fù)荷組，發(fā)現(xiàn)其骨細(xì)胞Cx43表達(dá)增加、骨細(xì)胞凋亡增加以及抗酒石酸酸性磷酸酶陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增加。Lim等[28]使用剪切應(yīng)力刺激牙槽骨來源間充質(zhì)干細(xì)胞的生長及成骨分化，且與對照組相比刺激組的Cx43水平升高。

4.牙骨質(zhì)

在小鼠模型中刺激磨牙形成新牙骨質(zhì)，其牙骨質(zhì)細(xì)胞中有Cx43的表達(dá)[17]。Miron等[24]證明Cx43表達(dá)增強(qiáng)會(huì)促進(jìn)牙骨質(zhì)再生?？p隙連接α-1（gap junction alpha-1，GJA1）可編碼Cx43蛋白，Kobayashi[29]使用來自牙齦卟啉單胞菌的脂多糖長期刺激成牙骨質(zhì)細(xì)胞，可誘導(dǎo)GJA1 DNA甲基化，并導(dǎo)致成牙骨質(zhì)細(xì)胞的低礦化，這表明Cx43基因突變可能會(huì)影響牙骨質(zhì)生長發(fā)育。

三、Cx與牙周疾病

1.牙齦炎、牙周炎

細(xì)胞間通訊在牙周組織炎癥中發(fā)揮重要作用。Abe等[30]發(fā)現(xiàn)Cx在牙周炎的牙齦組織中顯著下調(diào)，這可能與牙周炎期間細(xì)胞間通訊障礙有關(guān)。張鵬等[12]證實(shí)高血糖可誘導(dǎo)牙齦上皮炎癥，激活牙齦上皮炎癥小體（如NOD樣受體蛋白3、核效應(yīng)蛋白4等），并通過免疫組織化學(xué)法顯示糖尿病小鼠炎癥性牙齦上皮中結(jié)合上皮、齦溝上皮和口腔上皮幾乎沒有Cx43的表達(dá)，因此Cx43可能在與糖尿病相關(guān)的牙周炎中起重要作用。吳劍豪等[31]發(fā)現(xiàn)口腔病原菌感染患者其血清Cx40、Cx44、Cx45、Cx46水平較對照組降低，而口腔致病菌感染會(huì)導(dǎo)致牙齦炎、牙周炎等疾病，因此Cx水平異?？赡芘c牙周組織炎癥性疾病相關(guān)。

2.牙齦創(chuàng)傷

牙齦創(chuàng)傷愈合期間牙齦成纖維細(xì)胞中Cx43水平降低且呈動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)。Cx43的抑制導(dǎo)致結(jié)締組織細(xì)胞間通訊網(wǎng)絡(luò)破壞，并在創(chuàng)傷后逐漸恢復(fù)到正常水平[14]。牙齦創(chuàng)傷愈合相對于皮膚病程更短且無瘢痕，這可能是由于牙齦中Cx43只有一小部分組裝成連接小體[15]。研究[32]表明在培養(yǎng)的人牙齦成纖維細(xì)胞中阻斷Cx43可以顯著調(diào)控創(chuàng)傷愈合相關(guān)基因的表達(dá)。Tarzemany[15]通過使用模擬肽選擇性阻斷Cx43縫隙連接通道導(dǎo)致體外培養(yǎng)的牙齦成纖維細(xì)胞中抗纖維化基因的明顯上調(diào)和促纖維化基因的下調(diào)。

3.牙周致病菌破壞Cx參與牙周疾病

牙周致病菌主要包括伴放線聚集桿菌、牙齦卟啉單胞菌、福賽坦納菌等。研究表明，牙周致病菌可通過破壞縫隙連接，從而參與牙周疾病的發(fā)生發(fā)展[33]。Belibasakis[34]使用牙齦卟啉單胞菌等10種細(xì)菌組成的齦下菌斑生物膜培養(yǎng)人牙齦上皮細(xì)胞，24小時(shí)候后觀察到Cx26、Cx30較對照組表達(dá)降低，這可能提示牙周致病菌可以抑制Cx的表達(dá)而造成牙周組織破壞。

伴放線聚集桿菌與侵襲性牙周炎關(guān)系密切。伴放線聚集桿菌的外膜蛋白29可減少人牙齦上皮細(xì)胞縫隙連接通訊，降低Cx43的表達(dá)[35]。Fujita等[36，37]通過實(shí)驗(yàn)在培養(yǎng)的人牙齦上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-8在伴放線聚集桿菌降低縫隙連接和Cx43的表達(dá)中起重要作用，同時(shí)證明了IL-1β可降低Cx43的表達(dá)。因此，當(dāng)牙周感染刺激機(jī)體免疫細(xì)胞產(chǎn)生白介素等炎癥因子時(shí)，這些炎癥因子可能通過降低Cx的表達(dá)，進(jìn)一步造成牙周組織破壞。

牙齦卟啉單胞菌的主要致病因子包括脂多糖、牙齦素等，其中脂多糖起著黏聚分子的作用[1]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)脂多糖長期刺激成牙骨質(zhì)細(xì)胞，可誘導(dǎo)Cx43 DNA甲基化，從而導(dǎo)致成牙骨質(zhì)細(xì)胞低礦化[29]。有眾多研究表明，DNA甲基化在慢性牙周炎中起重要作用[38]，這也提示了牙周致病菌引起的Cx43 DNA甲基化可能是慢性牙周炎的相關(guān)分子機(jī)制。

四、總結(jié)與展望

綜上所述，Cx在牙齦、牙周膜、牙槽骨、牙骨質(zhì)的生長發(fā)育過程中以及牙齦炎、牙周炎、牙齦創(chuàng)傷愈合的發(fā)生發(fā)展中有著重大意義，并且研究表明牙周致病菌及其毒力因子可通過刺激機(jī)體免疫而抑制Cx的表達(dá)以及通過促進(jìn)Cx43 DNA甲基化等機(jī)制參與牙周疾病。目前牙周治療主要為牙周基礎(chǔ)治療以及牙周手術(shù)治療，對于重度牙周炎患者很難恢復(fù)其牙周組織，因此，牙周組織再生成為我們需要攻克的難題。我們可以通過調(diào)控Cx的表達(dá)水平，促進(jìn)牙周膜、牙槽骨、牙骨質(zhì)的再生，近期有學(xué)者發(fā)現(xiàn)結(jié)締組織生長因子可上調(diào)牙周膜干細(xì)胞Cx43的表達(dá)，這有助于我們研發(fā)促進(jìn)牙周組織再生的誘導(dǎo)因子[21]，但需要加強(qiáng)研究Cx對牙周膜干細(xì)胞成骨分化的機(jī)制，以及對Cx參與牙周組織及疾病的具體作用機(jī)制尚需進(jìn)行深入研究，從而為臨床牙周病的治療提供新思路。