保留根面牙骨質(zhì)對人牙周韌帶細(xì)胞分化的影響

徐巖，蔡軍(濟(jì)南市口腔醫(yī)院，濟(jì)南250014)

?

保留根面牙骨質(zhì)對人牙周韌帶細(xì)胞分化的影響

徐巖，蔡軍
(濟(jì)南市口腔醫(yī)院，濟(jì)南250014)

目的 觀察保留健康牙骨質(zhì)對人牙周韌帶細(xì)胞分化的影響。方法 取正畸患者拔除的健康前磨牙，從牙根的近中和遠(yuǎn)中面釉牙骨質(zhì)界下2 mm制備對稱的5 mm×4 mm的牙片43對，隨機(jī)分成觀察組(保留牙骨質(zhì))和對照組(去除牙骨質(zhì))各43張。刮取牙周膜組織，按組織塊貼壁法培養(yǎng)牙周韌帶細(xì)胞，分離培養(yǎng)后，取兩組各23張牙片，將細(xì)胞接種到牙片上共培養(yǎng)，制成PDLC-牙片復(fù)合體。7 d后刮除并收集PDLC-牙片復(fù)合體上的細(xì)胞，采用RT-PCR方法檢測成牙骨質(zhì)標(biāo)記物牙骨質(zhì)附著蛋白(CAP)和牙骨質(zhì)蛋白23(CP-23)表達(dá)。取兩組剩余的20張牙片制成細(xì)胞-牙片復(fù)合體放入半透明膜中，植入裸鼠體內(nèi)，8周后比較兩組牙片表面新形成的硬組織情況，并采用免疫組化方法觀察骨橋蛋白(OPN)和骨唾液蛋白(BSP)表達(dá)。結(jié)果 觀察組CAP和CP-23表達(dá)較對照組升高(P均<0.01)。植入裸鼠體內(nèi)，8周后觀察組14張牙片顯示原有牙骨質(zhì)上有牙骨質(zhì)樣基質(zhì)形成；新舊牙骨質(zhì)間并未觀察到裂隙。對照組17張牙片在牙根表面有纖維組織形成，并且新纖維組織和牙本質(zhì)表面間均可觀察到不同寬度的裂隙。新形成的牙骨質(zhì)樣基質(zhì)中，骨橋蛋白和骨唾液蛋白均呈陽性。結(jié)論 保留健康牙根表面的牙骨質(zhì)可能促進(jìn)人牙周韌帶細(xì)胞向成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化，有利于牙周組織愈合。

牙骨質(zhì)；牙周組織；細(xì)胞分化；牙周韌帶細(xì)胞；牙骨質(zhì)細(xì)胞；牙骨質(zhì)附著蛋白；牙骨質(zhì)蛋白23；骨橋蛋白；骨唾液蛋白

牙骨質(zhì)是覆蓋于牙根表面的獨(dú)特礦化組織，是一薄層結(jié)締組織覆蓋根面，其主要作用是鉚釘牙周膜纖維，對于牙齒以及牙周組織的穩(wěn)定有著重要的作用[1]。以往的牙周組織再生實(shí)驗(yàn)以及臨床牙周治療中，一般建議將牙骨質(zhì)完全去除，目的是將病變牙骨質(zhì)完全去除。在牙周炎的過程中，牙骨質(zhì)會(huì)在結(jié)構(gòu)和生化形狀上發(fā)生變化[2]。牙骨質(zhì)中含有一些與牙骨質(zhì)形成、牙周韌帶附著及牙周韌帶細(xì)胞(PDLC)胞外基質(zhì)的合成等有關(guān)的非膠原蛋白質(zhì)。研究顯示，牙骨質(zhì)至少含有兩種特異性蛋白，即牙骨質(zhì)附著蛋白(CAP)[3]和牙骨質(zhì)源性生長因子(CGF)[4]，它們是存在于牙骨質(zhì)基質(zhì)中并能促進(jìn)牙周膜細(xì)胞黏附、增殖、趨化、移行以及成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化等功能的活性物質(zhì)。牙骨質(zhì)蛋白23(CP-23)是鑒別牙骨質(zhì)樣細(xì)胞的標(biāo)記物[5]，能夠在人成牙骨質(zhì)細(xì)胞來源細(xì)胞系的培養(yǎng)基中識(shí)別出來。而PDLC不是單一細(xì)胞類型，其具有多向分化潛能，在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境條件和刺激因素作用下，可以向成骨細(xì)胞和成牙骨質(zhì)細(xì)胞方向分化，形成牙骨質(zhì)和牙槽骨[6]。2006年3月～2007年12月，我們將PDLC細(xì)胞與牙片共培養(yǎng)后，檢測細(xì)胞中CAP、CP-23 mRNA的表達(dá)，并將保留牙骨質(zhì)的牙片與不保留牙骨質(zhì)的牙片制成PDLC-牙片復(fù)合體植入裸鼠體內(nèi)，8周后觀察牙片表面硬組織形成情況，牙片中骨唾液蛋白(BSP)和骨橋蛋白(OPN)表達(dá)情況，探討健康牙根表面的牙骨質(zhì)能否促進(jìn)人PDLC向成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化，探索根面保留牙骨質(zhì)對牙周組織再生的影響，為牙骨質(zhì)的發(fā)育機(jī)制以及影響牙周組織再生的因素提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 收集25例正畸患者拔除的43顆前磨牙，患者年齡12～20歲。4周齡健康裸鼠20只，雌雄不限，購于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物中心，體質(zhì)量18～24 g。DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶(Gibco，USA)；青霉素、鏈霉素(以下簡稱雙抗，華北制藥股份有限公司)；EDTA(華美生物工程公司)；TRIzol(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas，USA)；PCR擴(kuò)增試劑盒(大連寶生物工程有限公司)；兔抗人骨橋蛋白(LF-123)、兔抗人骨唾液蛋白(LF-100)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體(北京金橋國際公司)；實(shí)時(shí)RT-PCR儀；倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)(日本Olympus)。

1.2 PDLC的培養(yǎng) 刮取牙根中1/3部位的牙周膜組織，按組織塊貼壁法，加入含150 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞長滿瓶底的70%～80%，按1∶2傳代。收集第二代PDLC制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL。

1.3 牙片的制備 取43顆前磨牙，刮除根近中和遠(yuǎn)中面的牙周韌帶，將牙根縱劈為兩半，去除牙髓組織。一半徹底刮除根面牙骨質(zhì)，暴露牙本質(zhì)，作為對照組；另一半則保留牙骨質(zhì)，不暴露其下的牙本質(zhì)，作為觀察組。用細(xì)金剛砂車針從牙根鄰面釉牙骨質(zhì)界下2 mm制備對稱的5 mm×4 mm的牙片43對。

1.4 PDLC-牙片復(fù)合體的制備 將兩組牙片放置在培養(yǎng)皿中，表面用EDTA凝膠處理3 min，暴露膠原。取牙片置于48孔板內(nèi)，加入制備好的PDLC懸液，37 ℃、50 mL/L CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育2.5 h。加入含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培育7 d。待細(xì)胞長滿孔板底部，取出PDLC-牙片復(fù)合體，用于以下實(shí)驗(yàn)。

1.5 PDLC中CAP、CP23 mRNA表達(dá)檢測 采用RT-PCR方法。取兩組各23個(gè)PDLC-牙片復(fù)合體，收集牙片上的細(xì)胞。使用TRIzol試劑盒提取RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩Ｒ驭?actin作為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)并合成引物。CAP引物序列：上游5′-CCTGGCTCACCTTCTACGAC-3′，下游5′-CCTCAAGCAAGGCAAATGTC-3′；CP-23引物序列：上游5′-GGCGATGCTCAACCTCTAAC-3′，下游5′-CCTCAAGCAAGGCAAATTC-3′；β-actin引物序列：上游5′-GATGAGATTGGCATGGCTTT-3′，下游5′-CACCTTCACCGTTCCAGTTT-3′。擴(kuò)增條件：95 ℃ 10 min預(yù)變性；95 ℃ 10 s，59 ℃ 5 s，72 ℃ 10 s，循環(huán)45次。標(biāo)準(zhǔn)曲線使用LightCycler 4.0軟件分析，以目的基因與β-actin的灰度比值表示目的基因的相對表達(dá)量。

1.6 PDLC-牙片復(fù)合體的活體植入 取兩組剩余的20個(gè)PDLC-牙片復(fù)合體，放入已消毒的聚四氟乙烯微孔薄膜呈袋狀包被，防止移植后裸鼠細(xì)胞浸潤根片。將裸鼠用氯胺酮5 mg/kg腹膜下注射麻醉，于背部兩側(cè)分別作2個(gè)縱切口，分離、暴露皮下組織。將已包被的PDLC-牙片復(fù)合體植入裸鼠皮下，一側(cè)為牙骨質(zhì)片，另一側(cè)為牙本質(zhì)片，縫合傷口。飼養(yǎng)8周后以斷頸法處死裸鼠，將牙片取出。

1.7 牙片表面新生組織觀察 將牙片用多聚甲醛溶液4 ℃下固定24 h，加入140 g/L EDTA脫鈣液脫鈣，取出牙片沖洗，脫水，石蠟包埋。與牙長軸平行，近遠(yuǎn)中向制作5 μm連續(xù)切片，取經(jīng)過中間部分的切片，行HE染色，倒置相差顯微鏡下觀察牙片表面是否有新生成的組織。

1.8 牙片中BSP、OPN表達(dá)檢測 采用免疫組化方法。將切取的牙片加入一抗(兔抗人OPN、兔抗人BSP)，1∶100稀釋，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體作為二抗，DAB顯色。鏡下觀察牙片中有棕色染色為BSP、OPN陽性。

2 結(jié)果

2.1 兩組PDLC中CAP、CP-23 mRNA表達(dá)比較 與PDLC細(xì)胞共培養(yǎng)7 d后，觀察組PDLC中CAP、CP-23 mRNA的相對表達(dá)量分別為0.004 35±0.000 34、0.000 07±0.000 02，對照組分別為0.002 91±0.000 21、0.000 000 66±0.000 000 04，觀察組CAP、CP-23 mRNA表達(dá)均高于對照組(P均<0.01)。

2.2 兩組牙片新組織形成情況 觀察組中，有14個(gè)牙片在原有的牙骨質(zhì)表面有一層新形成的牙骨質(zhì)樣基質(zhì)(NFC)，而且NFC的密度比較低，部分有細(xì)胞嵌入。在NFC和聚四氟乙烯微孔薄膜之間有疏松的纖維樣組織，空隙較大。而對照組無新的牙骨質(zhì)形成，有新生成的纖維樣組織形成，與根面之間有很大的間隙，并且越靠近根面密度越大。

2.3 觀察組牙片中BSP、OPN表達(dá)情況 BSP在NFC中呈弱陽性，越靠近根面染色越強(qiáng)；在原有的牙骨質(zhì)和牙本質(zhì)中染色不明顯。OPN在NFC中呈陽性，越靠近原有的牙骨質(zhì)陽性越強(qiáng)，在原有牙骨質(zhì)呈中等陽性，在牙本質(zhì)中沒有著色。

3 討論

牙骨質(zhì)除了能夠提供牙周組織的附著，也可以保護(hù)牙本質(zhì)，阻止牙本質(zhì)在病理?xiàng)l件下吸收。即使暴露在牙周袋中，牙骨質(zhì)也不是很容易發(fā)生吸收[7]。在體內(nèi)暴露牙本質(zhì)可以引起破骨細(xì)胞在牙根基面啟動(dòng)吸收過程，這可能喚起趨化因子和激活信號的激活[8]?；谶@一點(diǎn)，牙骨質(zhì)和牙本質(zhì)在調(diào)節(jié)和招募PDLC方面有很大不同。本研究結(jié)果顯示，在體外牙骨質(zhì)和牙本質(zhì)表面出現(xiàn)了PDLC的黏附和生成。

成牙骨質(zhì)細(xì)胞能夠生成牙骨質(zhì)，但是它們同成骨細(xì)胞相似，很難區(qū)分。CAP是一種膠原樣蛋白，可作為成人PDLC中特定的成牙骨質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞的標(biāo)記物[9]。CP-23是鑒別牙骨質(zhì)樣細(xì)胞的標(biāo)記物[5]，能夠在人成牙骨質(zhì)細(xì)胞來源細(xì)胞系的培養(yǎng)基中識(shí)別出來。本研究顯示，接種于牙骨質(zhì)和牙本質(zhì)表面的PDLC中均有CAP、CP-23 mRNA表達(dá)，與對照組比較，觀察組CP-23 mRNA表達(dá)升高，表明先前存在的牙骨質(zhì)可能促進(jìn)PDLC向成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化。

我們將PDLC-牙片復(fù)合體接種到裸鼠皮下，飼養(yǎng)8周后發(fā)現(xiàn)，NFC直接形成在原有的牙骨質(zhì)表面，其密度和結(jié)構(gòu)較原有的牙骨質(zhì)疏松，部分牙片中可見少量細(xì)胞嵌入基質(zhì)內(nèi)。免疫組化染色顯示，NFC中BSP、OPN均呈陽性。BSP、OPN參與組織礦化，在成牙骨質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞向成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化過程中扮演重要角色[11]。其表達(dá)與新的牙骨質(zhì)附著有關(guān)[12]。表明PDLC細(xì)胞在原有牙骨質(zhì)存在的情況下，能夠促進(jìn)其向成牙骨質(zhì)細(xì)胞方向分化。除了在原有的牙骨質(zhì)表面形成NFC，PLDC還可以形成纖維樣組織，且牙骨質(zhì)上的纖維樣組織少于牙本質(zhì)。表明移植到牙骨質(zhì)上的細(xì)胞能夠形成牙骨質(zhì)樣結(jié)構(gòu)和纖維樣結(jié)構(gòu)，而移植到牙本質(zhì)上的細(xì)胞形成了更多的纖維樣組織。這可能解釋了PLDC的異質(zhì)性。

牙周韌帶中包含各種類型的細(xì)胞，包括成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞。因此，體外培養(yǎng)PDLC可能會(huì)形成多樣性的細(xì)胞群，而且PDLC中有一定數(shù)量的干細(xì)胞存在[13]。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)PDLC接種到牙片上時(shí)，牙骨質(zhì)的存留更適合PDLC中干細(xì)胞或成牙骨質(zhì)細(xì)胞的祖細(xì)胞分化為成牙骨質(zhì)細(xì)胞，同時(shí)在PDLC中的成纖維細(xì)胞形成薄的纖維組織。然而牙本質(zhì)表面更適合于成纖維細(xì)胞的生長，形成更多的纖維組織。

在臨床治療牙周炎時(shí)，為了將病變牙骨質(zhì)徹底清除，一般建議將牙骨質(zhì)完全去除。本研究結(jié)果顯示，保留牙根表面部分的牙骨質(zhì)可以促進(jìn)人牙周韌帶細(xì)胞向成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化，形成NFC，有利于牙骨質(zhì)的修復(fù)以及牙周組織的愈合；完全去除牙骨質(zhì)反而不利于牙周組織的再生和愈合。因此建議，在臨床治療中，宜用溫和的力量去除病變牙骨質(zhì)的表面層，只去除牙根表面感染的牙骨質(zhì)而保留大部分牙骨質(zhì)，更有利于患者的預(yù)后。

[1] Foster BL. On the discovery of cementum[J]. J Periodontal Res, 2017. [Epub ahead of print]

[2] Adriaens PA, Adriaens LM. Effects of nonsurgical periodontaltherapy on hard and soft tissues[J]. Periodontology 2000, 2004,36(1):121-145.

[3] Montoya G, Arenas J, Romo E, et al.Human recombinant cementum attachment protein (hrPTPLa/CAP) promotes hydroxyapatite crystal formation in vitro and bone healing in vivo[J]. Bone, 2014,69:154-164.

[4] Yokokoji T, Narayanan AS. Role of D1 and E cyclins in cell cycle progression of human fibroblasts adhering to cementum attachment protein[J]. J Bone Miner Res, 2001,16(6):1062-1067.

[5] Alvarez-Pérez MA, Narayanan S, Zeichner-David M, et al. Molecular cloning, expression and immunolocalization of a novel human cementum-derived protein(CP-23)[J]. Bone, 2006,38(3):409-419.

[6] Han J, Menicanin D, Gronthos S, et al. Stem cells, tissue engineering and periodontal regeneration[J]. Aust Dent J, 2014,59(Suppl 1):117-130.

[7] Menicanin D, Hynes K, Han J, et al. Cementum and periodontal ligament regeneration[J]. Adv Exp Med Biol, 2015,881:207-236.

[8] Nesbitt SA, Horton MA. Trafficking of matrix collagensthrough bone-resorbing osteoclasts[J]. Science, 1997,276(5310):266-269.

[9] Cho MI, Garant PR. Development and general structure of the periodontium[J]. Periodontol 2000,2000,24(1):9-27.

[10] Song AM, Shu R, Xie YF, et al. A study of enamel matrix proteins on differentiation of porcine bone marrow stromal cells into cementoblasts[J]. Cell Prolif, 2007,40(3):381-396.

[11] Foster BL. Methods for studying tooth root cementum by light microscop[J]. Int J Oral Sci, 2012,4(3):119-128.

[12] Harahashi H, Odajima T, Yamamoto T, et al. Immunohistochemical analysis of periodontal reattachment on denuded root dentin after periodontal surgery[J]. Biomed Res, 2010,31(5):319-328.

[13] Tanaka K, Iwasaki K, Feghali KE, et al. Comparison of characteristics of periodontal ligament cells obtained from outgrowth and enzyme-digested culture methods[J]. Arch Oral Biol, 2011,56(4):380-388.

山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研獎(jiǎng)勵(lì)基金(BS2013YY056)。

蔡軍(E-mail: caijun168168@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.26.012

R78

A

1002-266X(2017)26-0041-03

2017-03-01)