牙齦卟啉單胞菌GroEL在牙周炎及心血管疾病中的研究進(jìn)展

閆銳 馬哲

牙周炎（periodontitis，PD）是一種與口腔菌群失調(diào)相關(guān)的慢性炎癥性疾病，屬于全球第六大流行性疾病，世界上約11%的人口患有嚴(yán)重的PD[1，2]。牙周疾病的研究中發(fā)現(xiàn)PD與全身50多種系統(tǒng)性疾病和狀態(tài)有關(guān)，如心血管疾?。╟ardiovascular disease，CVD）、癌癥、肥胖及阿爾茲海默癥等[3]。近年來PD與CVD的關(guān)系也已成為研究熱點(diǎn)。CVD是心臟疾病和血管疾病的總稱，是全世界發(fā)病率和死亡率最高的疾病，其最主要的特征性改變?yōu)閯?dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）[4，5]。AS最初被認(rèn)為是脂肪和纖維物質(zhì)積累的結(jié)果，然而越來越多的研究者認(rèn)為它是一種慢性炎癥性疾病，一些感染性疾病，如PD，與AS的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[6，7]。

牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.g）是導(dǎo)致牙周組織發(fā)生破壞的最重要的優(yōu)勢菌。大量研究表明P.g不僅參與牙周病期間的炎癥和組織破壞，還通過上皮和淋巴管的潰瘍進(jìn)入血液系統(tǒng)，從而與遠(yuǎn)端身體器官的炎癥病理相關(guān)，如AS和阿爾茨海默病等[8，9]。P.g發(fā)揮致病作用的毒力因子主要包括菌毛、脂多糖、GroEL及蛋白酶等。近年來隨著人們對(duì)GroEL的研究越來越多，發(fā)現(xiàn)它作為局部及全身炎癥的有效誘導(dǎo)劑，可能在PD與AS發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，但未有研究對(duì)其進(jìn)行過系統(tǒng)性論述。因此，本綜述重點(diǎn)探討P.g GroEL在PD及CVD中的作用及相關(guān)機(jī)制，為深入了解P.g在PD與AS中的致病機(jī)制和指導(dǎo)臨床治療提供有力的理論依據(jù)。

一、GroEL生物學(xué)特性

GroEL為細(xì)菌內(nèi)部的伴侶蛋白60或熱休克蛋白60（heat shock protein 60,HSP60），在細(xì)菌受到高溫、紫外線、炎癥及組織損傷等刺激時(shí)產(chǎn)生，其氨基酸序列具有高度保守性。GroEL在蛋白質(zhì)折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)、變性蛋白修復(fù)和線粒體生物發(fā)生過程中都起著重要作用[10]。由于進(jìn)化過程中高度保守，細(xì)菌GroEL與人HSP60之間可存在55%的同源性，在573個(gè)氨基酸的結(jié)構(gòu)域上保守序列可達(dá)72%[11]。GroEL被廣泛認(rèn)為是各種細(xì)菌感染和自身免疫性疾病中的重要分子，已有研究發(fā)現(xiàn)一些口腔致病菌的代謝產(chǎn)物GroEL能夠刺激促炎細(xì)胞因子和黏附因子的的產(chǎn)生。如伴放線聚集桿菌產(chǎn)生的GroEL可刺激單核細(xì)胞分泌白介素-10（Interleukin-10，IL-10）、白介素-12（Interleukin-12，IL-12）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α），從而造成牙槽骨吸收[12]。福賽坦氏菌產(chǎn)生的GroEL通過促進(jìn)炎癥因子IL-6、IL-8以及前列腺素的分泌，引起人牙齦成纖維細(xì)胞和牙周膜干細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[13]。Lee等人[14]在ApoE-/-小鼠腹膜內(nèi)注入具核梭桿菌GroEL，可導(dǎo)致IL-6、C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein,CRP）和低密度脂蛋白水平（low-density lipoprotein，LDL）升高，高密度脂蛋白水平（high-density lipoprotein，HDL）降低，從而使AS病變進(jìn)展顯著。P.g GroEL也可以刺激人單核細(xì)胞和牙齦成纖維細(xì)胞產(chǎn)生IL-6和IL-8等炎性細(xì)胞因子，并能上調(diào)細(xì)胞間黏附分子-1（intracellular adhesion molecule-1，ICAM-1）和血管間黏附因子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）等黏附分子的表達(dá)[15]。這些研究表明，細(xì)菌產(chǎn)生的GroEL在疾病的發(fā)生和進(jìn)展中起著重要作用。

P.g GroEL是P.g在疾病感染期所分泌的免疫原性致病因子，被認(rèn)為是PD患者的一種關(guān)鍵的顯性抗原。在PD患者的所有牙齦炎癥組織及血清中抗GroEL抗體滴度均較健康對(duì)照者顯著增高，而在牙周治療后血清中抗P.g GroEL的抗體降低，表明PD患者對(duì)GroEL有免疫應(yīng)答[16]。由于P.g GroEL與人HSP60在進(jìn)化過程中具有高度的相似性，使人HSP60抗體與P.g GroEL能夠發(fā)生交叉反應(yīng)，機(jī)體免疫系統(tǒng)在攻擊GroEL的同時(shí)也能攻擊高表達(dá)HSP60的內(nèi)皮細(xì)胞，造成內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，并加速AS的形成[17]。同時(shí)P.g GroEL作為全身炎癥的誘導(dǎo)劑，也能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子和黏附因子的產(chǎn)生。這些都說明了P.g GroEL作為細(xì)菌感染的重要分子，不僅可以造成牙周組織損傷，在以AS為基礎(chǔ)的CVD中也起著重要作用，它可能是連接PD和自身免疫性AS的觸發(fā)分子。所以研究P.g的代謝產(chǎn)物GroEL為PD與AS之間的聯(lián)系提供有力的理論依據(jù)。

二、P.g GroEL對(duì)牙周炎的致病作用

P.g GroEL是一種重要的免疫顯性抗原，導(dǎo)致牙周組織炎癥發(fā)生。GroEL基因在齦下斑塊中的轉(zhuǎn)錄激活已被證明與PD的探診深度和疾病狀態(tài)有關(guān)。同時(shí)，在Lee等人[18]研究中發(fā)現(xiàn)，針對(duì)P.g GroEL的疫苗可以減少PD相關(guān)牙槽骨的丟失。近年來P.g GroEL對(duì)PD的影響多集中在細(xì)胞層面，現(xiàn)將P.g GroEL對(duì)牙周細(xì)胞的影響分述如下。

1.P.g GroEL對(duì)牙周膜干細(xì)胞的影響

Lin等人[19]研究發(fā)現(xiàn)，P.g GroEL可以通過激活NF-κB轉(zhuǎn)錄活性通道來促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞分泌炎癥因子IL-6和IL-8，從而可能造成牙周組織破壞。它也可以顯著誘導(dǎo)牙周膜干細(xì)胞的遷移，這主要通過激活整合素α1、α2和細(xì)胞骨架的重構(gòu)所引起的。GroEL可能通過激活JNK/MAPK和NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞定向成脂分化，并競爭性地抑制其定向成骨分化[20]，這為細(xì)菌可以影響干細(xì)胞的分化提供了證據(jù)，并揭示了GroEL對(duì)組織再生的潛在影響。

2.P.g GroEL對(duì)骨細(xì)胞的影響

破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞是牙槽骨吸收和形成之間高度動(dòng)態(tài)平衡的主要成分。牙周炎中骨丟失的機(jī)制不僅涉及破骨細(xì)胞活性的增強(qiáng)，還涉及成骨細(xì)胞活性的減弱，從而加劇了牙槽骨的進(jìn)行性破壞[21，22]。在牙周組織中，P.g GroEL能以濃度依賴性方式誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分泌骨吸收炎癥因子IL-6和IL-8，從而加速牙槽骨的破壞。這是由于激活了炎癥通路P38/JNK MAPK，進(jìn)而刺激成骨細(xì)胞下游的炎癥反應(yīng)，但是對(duì)成骨細(xì)胞的活力并沒有影響[23]。在對(duì)大鼠體內(nèi)研究中發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，P.g GroEL注射組顯著誘導(dǎo)了牙齦中破骨細(xì)胞的發(fā)生。同時(shí)該團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)P.g GroEL可以從mRNA水平上調(diào)核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB Ligand,RANKL）和抑制堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）的表達(dá)來參與破骨細(xì)胞分化[19]。RANKL是TNF家族的成員，可啟動(dòng)破骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，從而刺激了破骨細(xì)胞的形成和分化，增強(qiáng)牙槽骨的吸收[24]。ALP是一種參與各種礦化組織鈣化的保守因子，已被用作骨組織中成骨細(xì)胞活性的指標(biāo)[25]。這些數(shù)據(jù)表明，GroEL不僅影響破骨細(xì)胞分化的激活，而且影響成骨細(xì)胞活性的抑制。

三、P.g GroEL對(duì)心血管疾病的致病作用

P.g GroEL不僅對(duì)牙周組織具有破壞性，而且可以誘發(fā)和加重全身炎癥。其主要通過內(nèi)皮功能障礙、誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)及脂代謝紊亂和分子擬態(tài)這三個(gè)途徑參與AS的發(fā)生發(fā)展。

1.內(nèi)皮功能障礙

內(nèi)皮功能障礙是指內(nèi)皮細(xì)胞各種功能的非適應(yīng)性變化，被認(rèn)為是AS的早期病理改變，存在于AS發(fā)生發(fā)展的整個(gè)過程。血管張力調(diào)節(jié)障礙和粘附分子的表達(dá)異常是內(nèi)皮功能障礙的兩個(gè)重要表現(xiàn)[26]。

Huang等人[27]用P.g GroEL刺激人冠狀內(nèi)皮細(xì)胞8 h、16 h、24 h和48 h，結(jié)果表明其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖活性沒有影響，但顯著增加了ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)。這些黏附因子的升高能夠激發(fā)單核細(xì)胞及白細(xì)胞與內(nèi)皮結(jié)合并入侵血管壁，并最終分化成巨噬細(xì)胞，從而參與粥樣斑塊的形成和發(fā)展[28]。WU等人[29]研究發(fā)現(xiàn)，P.g GroEL可以通過下調(diào)HUVEC中重要的血管內(nèi)皮鈣黏蛋白（vascular endothelial cadherin,VE-cadherin）和內(nèi)皮型一氧化氮合成酶（endothelial nitric oxide synthase,eNOS）的表達(dá)水平，并促進(jìn)caspase-3的切割，從而誘導(dǎo)HUVEC功能障礙和凋亡。其中eNOS能夠調(diào)節(jié)NO這種舒血管因子的產(chǎn)生，進(jìn)而在調(diào)節(jié)血管張力、抑制白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞粘附和平滑肌增殖等方面發(fā)揮著重要的生理作用[30]。VE-cadherin定位于粘附連接，通過其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域與α-連環(huán)蛋白、β-連環(huán)蛋白結(jié)合，在調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞通透性、新血液的遷移和組裝中起著重要作用[31]。

2.誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)及脂代謝紊亂

大量流行病學(xué)調(diào)查、臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，以脂肪功能紊亂為特征的代謝失調(diào)和炎癥反應(yīng)在AS病理生理過程中發(fā)揮著重要作用。脂代謝紊亂包括循環(huán)中一種或多種類型的脂質(zhì)的不健康水平，如高水平甘油三酯、總膽固醇、小而致密的LDL顆粒數(shù)量和低水平的HDL[32]。

Huang等人[27]發(fā)現(xiàn)P.g GroEL可能通過上調(diào)人冠狀內(nèi)皮細(xì)胞膜表面Toll樣受體4（Toll-like receptors 4,TLR4）的表達(dá)來調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的AS現(xiàn)象。已知TLR4作為一種經(jīng)典的跨膜蛋白，是先天免疫識(shí)別和結(jié)合細(xì)菌代謝產(chǎn)物的主要受體，體內(nèi)外配對(duì)后通過級(jí)聯(lián)反應(yīng)，可以激活下游NF-κB和MAPK等轉(zhuǎn)錄因子，產(chǎn)生炎癥免疫反應(yīng)，從而促進(jìn)AS的發(fā)生[33]。同時(shí)該團(tuán)隊(duì)在對(duì)小鼠的體內(nèi)研究中發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，P.g GroEL注射組可顯著增加小鼠血清中總膽固醇和LDL等AS危險(xiǎn)因素，從而促進(jìn)粥樣斑塊的形成[27]。Joo等人[34]的一項(xiàng)研究表明，來自P.g HSP60的肽（Peptide,Pep）19誘導(dǎo)LDL氧化的能力與P.g HSP60驅(qū)動(dòng)的LDL氧化相當(dāng)，都顯著大于對(duì)照組，這說明了P.g HSP60中的Pep19可作為LDL氧化的誘導(dǎo)劑。氧化LDL是AS的一個(gè)危險(xiǎn)因素，它作為巨噬細(xì)胞的清道夫受體，可誘發(fā)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞。此外氧化LDL還可以通過氧化應(yīng)激誘導(dǎo)內(nèi)皮功能損傷、平滑肌細(xì)胞遷移，從而在AS中發(fā)揮重要的作用[35]。

3.分子擬態(tài)

分子擬態(tài)是指結(jié)構(gòu)相似的表位可能通過交叉性免疫反應(yīng)在疾病過程中發(fā)揮作用。病原微生物和同源宿主蛋白之間的分子擬態(tài)是導(dǎo)致自身免疫性AS發(fā)生的可能機(jī)制之一[36，37]。

正常情況下，人血管內(nèi)皮細(xì)胞上不表達(dá)HSP60，但在各種應(yīng)激條件刺激下，線粒體HSP60易位至細(xì)胞質(zhì)，然后表達(dá)至細(xì)胞表面。由于P.g GroEL與人HSP60在進(jìn)化過程中氨基酸具有高度的相似性，使人HSP60抗體與P.g GroEL能夠發(fā)生交叉反應(yīng)，機(jī)體免疫系統(tǒng)在攻擊GroEL的同時(shí)亦能攻擊高表達(dá)HSP60的內(nèi)皮細(xì)胞，造成內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，從而加速AS的發(fā)生[38，39]。Jeong等人[40]發(fā)現(xiàn)，P.g HSP60中不同表位Pep可能在AS中分別作為自身免疫反應(yīng)的效應(yīng)因子和調(diào)節(jié)因子，用Pep14免疫的小鼠斑塊/脂滴面積和血清總膽固醇水平較對(duì)照組顯著降低，而用Pep19免疫的小鼠則明顯相反。

四、P.g GroEL疫苗在牙周炎及心血管疾病中的治療及預(yù)防價(jià)值

目前的研究已證明了P.g GroEL作為一種重要的毒力因子，能夠加速PD及AS的進(jìn)展。而P.g GroEL免疫可能會(huì)誘導(dǎo)PD及AS的保護(hù)反應(yīng)，所以其在治療及預(yù)防疾病中的相關(guān)研究也受到越來越多的關(guān)注。

Chang等人[41]對(duì)BALB/c小鼠注射P.g之前，先對(duì)其舌下免疫了P.g GroEL及CpG-ODN佐劑，結(jié)果顯示，舌下免疫GroEL組與對(duì)照組相比，可以有效抑制牙槽骨的吸收及炎癥因子TNF-α、IL-6的分泌，這與Lee等人[18]的研究結(jié)果相一致。這說明了P.g GroEL可以作為一種有效的牙周疫苗來治療及預(yù)防PD的發(fā)生。Joo等人[42]在最近的研究中發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，鼻免疫P.g HSP60 Pep14可使ApoE-/-小鼠粥樣斑塊明顯減少。此外，Hagiwarar等人[43]在對(duì)ApoE-/-小鼠進(jìn)行了舌下免疫GroEL后，顯著減少了主動(dòng)脈竇粥樣斑塊的形成，并降低了血清中CRP、MCP-1和氧化LDL水平。這些研究結(jié)果表明，雖然P.g GroEL引起AS的機(jī)制尚未完全清楚，但設(shè)計(jì)一種基于GroEL的疫苗可能是治療及預(yù)防P.g相關(guān)性AS的可行策略。

五、總結(jié)與展望

綜上所述，GroEL作為P.g重要的毒力因子，不僅與PD密切相關(guān)，在全身性疾病如AS的發(fā)生發(fā)展中也有著重要的作用，但目前對(duì)P.g GroEL的研究還處于初級(jí)階段，具體發(fā)病機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。近年來除了研究P.g GroEL對(duì)PD和AS的影響，還發(fā)現(xiàn)了其在腫瘤發(fā)展中的作用。Lin等人[44]通過研究攜帶C26癌細(xì)胞的BALB/c小鼠，發(fā)現(xiàn)P.g GroEL可以加速BALB/c小鼠的腫瘤生長并增加了死亡率，這是由于eNOS的產(chǎn)生和p38/MAPK的激活介導(dǎo)所引起的，但對(duì)P.g GroEL與全身其它系統(tǒng)性疾病的研究仍存在大量空白。這些研究的開展會(huì)有助于我們更深入理解牙周炎與全身系統(tǒng)性性疾病的關(guān)聯(lián)，從而能為臨床上提供新的治療思路，并提高人們對(duì)口腔健康的重視程度。