骨條件培養(yǎng)基在骨再生工程中的研究進展

何苑菲 孟令強

理想的骨移植材料需具備三個特性：骨傳導性、成骨性和骨誘導性，目前自體骨仍是傳統(tǒng)意義上骨移植材料的“金標準”[1]。除了這三種特性外，自體骨組織還具有容易被忽視的第四種特性—旁分泌性[2]。通過旁分泌作用，移植的自體骨組織將各種細胞因子、生長因子釋放到缺損區(qū)的周圍環(huán)境中，促進缺損區(qū)的組織再生。有學者研究發(fā)現，自體骨移植物可通過旁分泌作用[3]將生長因子釋放到培養(yǎng)基中，得到骨條件培養(yǎng)基（bone-conditioned medium，BCM），這種培養(yǎng)基的上清液可能是促進骨再生自體生長因子的新來源。

早在20世紀90年代初期就有關于“骨條件培養(yǎng)基”概念的闡述[4]，并在近期的一些研究中指出BCM與骨替代材料聯合應用有較好的成骨效果，同大量移植自體骨相比，BCM與骨替代材料的聯合應用有望減少移植的自體骨體積和其他損傷；與目前常用的幾種生長因子相比，如濃縮生長因子（concentrate growth factors，CGF）[5]、成品的骨形態(tài)蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)[6]、間充質干細胞的條件培養(yǎng)基（MSCs-conditioned medium，MSCs-CM）[7]，BCM來源于自體骨組織，可避免免疫排斥反應及倫理問題，并且更易于制備和經濟實惠。因此，本文就BCM的相關研究進展做一綜述，旨在為BCM應用于臨床提供依據。

一、BCM的概述

1.BCM的制備、儲存

目前根據制備BCM時加入的培養(yǎng)基不同分為兩種，首先收集皮質骨屑：剝離骨面軟組織，使用鋒利的骨刮刀取下盡可能長的皮質骨屑，將其置入培養(yǎng)皿中；其次加入培養(yǎng)基，其中一種方式是加入杜爾貝科改良Eagle培養(yǎng)基（dulbecco's modification of eagle's medium，DMEM），另一種為加入生理溶液與自體血清1：1的混合溶液，在加入培養(yǎng)基的同時加入1%的抗生素和抗真菌藥保持活性，每5 g離體骨屑加入10 ml培養(yǎng)基及1%抗生素和抗菌藥物，置于37°C環(huán)境中，培養(yǎng)時間從10 min到3 d不等；最后將培養(yǎng)基混合物在200×g下離心10 min，去除骨碎屑后無菌過濾（0.2 nm），得到BCM，-80°C冷凍保存[8～10]。

2.BCM中富含生長因子

骨缺損區(qū)釋放的細胞因子和生長因子通過吸引、募集骨源性間充質細胞激活缺損區(qū)骨整合和骨再生。研究顯示，在BCM中檢測到了與MCMs-CM類似的天然皮質骨分泌蛋白混合物，有學者將其稱為“分泌體”[11]。

目前已檢測到BCM的分泌體中含有175種不同的蛋白質，其中包括43種生長因子和細胞外基質蛋白質[8，12]。如骨硬化蛋白（sclerostin，SOST）、成纖維細胞生長因子-23（fibroblast growth factor-23，FGF-23）、血小板因子-4（platelet factor-4，PF-4）、胰島素樣生長因子結合蛋白-5（insulin-like growth factor-bindinc protein-5，IGFBPs-5）、血管生成素（angiogenin，ANG）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、成骨刺激因子-1（osteoblaststimulating factor-1，OSF-1）、半乳糖凝集素-1（galectin-1，Gal-1）等。其中SOST和FGF-23是骨細胞分泌的特有的生長因子，BCM的分泌體中檢測到這兩種生長因子驗證了自體骨具有旁分泌性[2]。血管生成素和VEGF可促進血管內皮細胞遷移、增殖和血管形成[13]；TGF-β1參與細胞的增殖、分化、遷移和凋亡，促進成骨細胞的早期分化，在骨重塑中具有核心作用[14]；OSF-1可以促進人骨祖細胞的體外黏附、遷移、擴增和分化[12]；Gal-1是一種廣泛表達的β-半乳糖苷結合蛋白，具有多向生物學功能，由成骨細胞和骨髓間充質細胞表達[12]。以上表明BCM可能對細胞遷移、增殖、血管形成及成骨功能具有重要影響。

3.制備過程中影響B(tài)CM活性的因素

BCM中含有多種生長因子，但其中生長因子的活性與含量同制備時的多種因素有關。與單獨使用生理溶液相比，在自體血清與生理溶液1:1混合作為培養(yǎng)基制備的BCM中，檢測到TGF-β在放入骨屑的10分鐘內大量且快速釋放，BMP-2在40分鐘后延遲釋放。除培養(yǎng)基外，培養(yǎng)時長也會影響B(tài)CM中生長因子的活性與含量：短期（10、20或40 min）收集的BCM可顯著增加細胞的增殖活性和膠原基質的產生，長期（1、3或6天）收集的BCM主要作用于成骨細胞分化和成熟的后期階段[9，10]。

骨屑的采集和處理方式與BCM的旁分泌功能密切相關。與骨磨、壓電裝置、取骨鉆相比，由骨刮刀收集的骨屑制備的BCM中VEGF和BMP-2等生長因子的表達顯著更高[15，16]，不過骨刮刀切割刀片的角度對制備的BCM活性影響不大[17]。骨刮刀收集的骨屑，在能夠保證長度和較大體積離體骨的同時，也可保持相對較高的細胞活力，這可能是使用骨刮刀制備BCM更佳的原因[18]。經低溫冷凍或巴氏殺菌法處理的骨屑對BCM旁分泌信號的釋放影響不大，但高壓滅菌會使BCM旁分泌信號釋放受損[19]。骨屑經120 Gy的輻射后制備的BCM也不影響其旁分泌信號釋放，且輻射能誘導激活潛在的TGF-β，但會導致血管生成明顯減少[20]。不同胚胎起源的骨被認為具有不同的特性[21]，但研究表明由顱骨、下頜骨和脛骨的骨屑制備的BCM具有相似的性能，都可以增加TGF-β1靶基因白細胞介素11（interleukin 11，IL11）、NADPH氧化酶4（NADPH oxidase 4，NOX4）和蛋白糖4（proteoglycan 4，PRG4）的表達[22]。

二、BCM的特性

1.BCM可調控細胞的粘附、增殖及分化

骨祖細胞聚集、附著、增殖并分化為成熟的成骨細胞，標志著組織成骨。研究表明使用添加小鼠顱骨塊的全骨條件培養(yǎng)液培養(yǎng)顱骨細胞，染色檢測顯示成骨標志物Runt相關轉錄因子2（runt-related transcription factor 2，Runx2）、骨鈣蛋白（osteocalcin，OC）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）的表達顯著增高，并且發(fā)生細胞聚集、細胞增殖[4]。即使將離體骨進行脫鈣處理，其提取出的BCM在體外仍可促進骨髓間充質干細胞的增殖、分化[23]。多種研究表明，骨組織、骨細胞的培養(yǎng)基上清液中含有可能來自于成熟成骨細胞產生的促進細胞增殖、分化的活性因子，骨細胞、間充質細胞及纖維細胞這三種不同類型的細胞在經過BCM浸泡的DBBM及Bio-gide中都表現出了不同程度增加的粘附、增殖及分化特性[10，24～26]。

2.BCM的活性與TGF-β關系密切

TGF-β是一種多效性分子，不僅能降低小鼠骨髓基質細胞（bone mesenchymal stem cells of mice，ST2）的ALP活性，并可抑制小鼠胚胎成纖維細胞即前脂肪細胞（3T3-Swiss albino，3T3-L1）成脂分化。使用BCM培養(yǎng)ST2細胞及3T3-L1細胞，觀察到ST2的ALP活性及3T3-L1細胞成脂分化程度降低，經Westernblot實驗證實，其成骨及成脂分化需要TGF-β-R1信號傳導，認為BCM具有TGF-β1活性[27]。當牙周成纖維細胞暴露于BCM后，受TGF-β受體I型激酶（activin-like kinase，ALK5）影響，BTB/POZ結構域蛋白11（BTB/POZ Domain Containing 11，BTBD11）、IL11和NOX4的表達上調，且向BCM中加入ALK5的抑制劑—BMPI型受體激酶抑制劑（LDN193189）后，觀察到BCM的活性顯著降低，驗證了BCM通過ALK5傳導活性[28]。Zimmermann等人[29]的研究得出了類似的結果，他們發(fā)現骨源性成纖維細胞在BCM的刺激下，通過調節(jié)腎上腺髓質素（adrenomedullin，ADM）、五聚蛋白3（pentraxin 3，PTX3）、BTBD11、IL11和NOX4的表達，激活TGF-β1受體信號通路的顯著反應。骨的形態(tài)和維持是成骨細胞和破骨細胞作用的動態(tài)平衡，破骨細胞負責清除壞死的骨碎片，它的出現是骨移植術中骨再生的第一步，研究表明BCM在體外激活間充質細胞TGF-β信號轉導，從而誘導破骨細胞生成時下游調節(jié)因子原癌基因蛋白（c-fos proto oncogene，c-fos）的表達，增加鼠骨髓培養(yǎng)物中破骨細胞的生成[30]。這些實驗研究都證實了BCM的活性與TGF-β密切相關，為將來研究BCM的作用機制提供了方向。

三、BCM聯合骨替代材料應用的實驗性研究

與間充質干細胞條件培養(yǎng)基類似，不少學者認為將含有骨源性生長因子的溶液與骨支架類材料聯合應用有良好前景，并對此做了許多實驗研究。使用單獨脫蛋白牛骨礦物質（deprot-einized bovine bone minerals，DBBM）和涂布BCM的DBBM分別培養(yǎng)小鼠ST2細胞，對比研究發(fā)現具有BCM涂層的DBBM顯著促進了ST2細胞的遷移、粘附及礦化程度，并且在接種細胞3天后觀察到成骨細胞分化標志物的顯著表達[24]。Parisi等人[10]研究表明與單獨使用生理溶液林格氏液（ringer's solution，RS）作為培養(yǎng)基相比，使用林格氏液（RS）和自體血清（serum，S）1：1的混合溶液培養(yǎng)骨屑20min時，在BCM-RS+S組檢測到對間充質細胞ST2、前成骨細胞MC3T3-E1和原代人骨衍生細胞的細胞黏附及誘導增殖能力顯著增強，同時RT-PCR實驗證明在20 min制備的BCM-RS+S顯著增強了ST2間充質細胞向成骨細胞分化時成骨細胞分化標志物的表達。BCM與膜類材料聯合應用也觀察到類似結果，膠原膜浸泡于BCM中1分鐘即可吸附來自BCM的生長因子，并在4小時后達到平臺期[26]。Fujioka等人[25]在增加BCM預涂層的Bio-gide上觀察到了ST2細胞附著數量增加了4倍以上，5天后ST2細胞成骨分化標志物的mRNA水平顯著提高，14天后Bio-gide的茜紅素染色程度增加5倍，提示ST2細胞在體外礦化程度增加。這些體外實驗表明骨支架類材料能夠吸附BCM中的生長因子，并顯著增加體外成骨細胞的附著、分化和礦化，進一步改善骨支架類材料的骨傳導性。而在動物實驗中，使用BCM浸泡的膠原膜修復小鼠顱骨缺損，發(fā)現在缺損處形成了不與宿主骨相連的骨島[31]，由于目前對體內BCM成骨機制研究較少，此現象尚無合理的解釋，因此這也是我們需要進一步研究的方向。

這些實驗表明BCM在臨床診療過程中具有廣闊的應用場景，例如：種植手術時在頰側翻瓣區(qū)收集正常骨組織的皮質骨屑，并在種植床預備期間按1g/2ml的比例將骨屑培養(yǎng)于自體血液和生理溶液的混合液中以制備BCM，收集的骨量按最終制備的BCM能完全浸沒骨替代材料為準，盡管會造成新的創(chuàng)傷，但對骨外形影響不大，且出血量不多，進行骨增量時將骨替代材料浸入于BCM后再植入骨缺損處，以改善缺損區(qū)成骨效果?；蛘咴陬M骨骨折或頜骨腫物患者術中，按照上述方式制備BCM，待骨折復位固定或腫物切除后使用BCM混合其他止血材料浸泡創(chuàng)區(qū)一定時間，以獲得更好的術后恢復效果。

四、總結與展望

新鮮皮質骨屑制備骨條件培養(yǎng)基中含有由大量生長因子和細胞因子構成的分泌體，在體外實驗中顯示出其對細胞增殖、遷移、分化的積極影響。BCM的優(yōu)勢在于制備時間短且誘導成骨能力顯著[10]。但是，目前對BCM制備方式尚未形成統(tǒng)一意見，關于BCM誘導成骨機制的認識也有一定的不足；同時，在臨床應用時對于浸潤性腫瘤患者是否可以使用BCM聯合骨替代材料的方式，該如何避免腫瘤細胞的引入還有待研究，并且大面積骨缺損患者所需骨替代材料也較大，制備BCM時所需的自體骨量也更多，其應用仍存在一定的局限性。我們應繼續(xù)積極探索BCM制備過程中的“最優(yōu)條件”和體內成骨機制，以及不同的骨替代材料被完全浸潤時所需BCM的最小量，從而為BCM的臨床應用提供依據。