嗜黏蛋白阿克曼氏菌ATCC BAA-835腸道益生作用的體外評價

吳艷麗，劉朋，蘇詠欣，李恒,2*，耿燕,2，任怡琳，許泓瑜，許正宏,4，史勁松,2*

1(江南大學(xué) 生命科學(xué)與健康工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)2(糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)3(糧食發(fā)酵與食品生物制造國家工程研究中心，江蘇 無錫，214122)4(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansiamuciniphila，Akk)是定植于腸道黏液層中可特異性降解黏蛋白的革蘭氏陰性厭氧菌[1]。研究發(fā)現(xiàn)，Akk具有良好的調(diào)節(jié)代謝的能力，口服Akk可改善動物脂代謝和腸道通透性，起到預(yù)防肥胖和改善脂多糖內(nèi)毒素血癥的作用[2]。初步的臨床實驗也表明，Akk安全性良好，適量補(bǔ)充可顯著降低超重和肥胖患者的胰島素分泌和總膽固醇水平，減輕胰島素抵抗[3]。此外，在炎癥性腸病[4]、糖尿病[5]、自閉癥[6]、癲癇[7]、高血壓[8]等疾病中也相繼報道了Akk改善疾病癥狀的作用。Akk與機(jī)體腸道生態(tài)、代謝、神經(jīng)等生理狀態(tài)密切相關(guān)，具有良好的腸道益生作用。

借助大規(guī)?；蚪M測序分析，Akk發(fā)揮腸道益生作用的機(jī)制與其顯著調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)之間的關(guān)聯(lián)已逐步揭示。多項人體與動物實驗研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肥胖、糖尿病、炎癥和代謝紊亂等疾病的發(fā)生發(fā)展均伴隨不同程度的Akk豐度的降低[9]。不僅如此，Akk對腸道上皮細(xì)胞良好的黏附作用以及自聚集能力，有利于在腸道菌群中形成優(yōu)勢占位[10]，這也為其參與調(diào)節(jié)代謝穩(wěn)態(tài)及相關(guān)途徑基因表達(dá)提供基礎(chǔ)。目前，有關(guān)Akk益生性能的研究大多采用測序的方法從群落水平上進(jìn)行分析，鮮有研究從菌株水平進(jìn)行探討。本研究即借助微生物純培養(yǎng)與細(xì)胞模型等體外研究方法，對Akk進(jìn)行益生性能的考查和評價，進(jìn)一步了解Akk發(fā)揮腸道益生作用的微生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 實驗材料

Akk模式菌株，購自ATCC菌種保藏庫(ATCC BAA-835)；Caco-2細(xì)胞，江南大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤研究所殷媛博士饋贈。

甘露寡糖(聚合度2～7)，成都永安緣和生物科技有限公司；殼寡糖(聚合度2～7)，揚州日興生物科技有限公司；褐藻寡糖(聚合度2～7)，實驗室自行制備；溶菌酶、胰蛋白酶、腦心浸液(brain heart infusion，BHI)、黏蛋白、L-半胱氨酸、3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid，DNS)、丙三醇、氫氧化鈉，美國sigma公司。

1.1.2 培養(yǎng)基及溶液配制

BHI培養(yǎng)基(g/L)：BHI 37.0、黏蛋白5.0、L-半胱氨酸0.3。121 ℃，滅菌20 min后備用。

低聚糖培養(yǎng)基：甘露寡糖、殼寡糖和褐藻寡糖分別配制1 mg/mL母液，采用0.22 μm濾膜過濾除菌，加入BHI培養(yǎng)基中分別配制低聚糖質(zhì)量濃度為250、500、1 000 μg/mL的3種含糖培養(yǎng)基，滅菌備用。

膽鹽培養(yǎng)基：BHI培養(yǎng)基中加入膽鹽，使膽鹽在液體培養(yǎng)基中的最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.0%、1.2%、1.4%、1.6%，滅菌備用。

Akk培養(yǎng)條件：厭氧工作站培養(yǎng)，37 ℃，氣體組成為80% CO2，10% H2，10% N2。

1.1.3 溶液配制

人工胃液的配制：用鹽酸調(diào)整蒸餾水的pH值至3.5，加入胃蛋白酶，使其質(zhì)量濃度為10 mg/mL，用0.22 μm的濾膜進(jìn)行過濾除菌后得到人工胃液。

人工腸液的配制：取磷酸二氫鉀6.8 g，加水500 mL溶解，用0.4%氫氧化鈉溶液調(diào)整pH值至7.0；另取胰蛋白酶10 g，加水適量溶解，將兩液混合后，加水稀釋至1 000 mL，0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌后制得人工腸液。

DNS的配制：稱取244.4 g酒石酸鉀鈉于500 mL去離子水中，45 ℃加熱溶解。向溶液中加入21 g氫氧化鈉，然后加入DNS 6.3 g，溶解后分別加入5 mL苯酚和5 g亞硫酸氫鈉，待溶液冷卻后定容至1 L，置于棕色瓶中避光貯存1周后備用。

1.1.4 儀器與設(shè)備

DG250厭氧培養(yǎng)工作站，Don Whitley Science公司；酶標(biāo)儀，Bio-Rad公司；UltiMate3000高效液相色譜儀，戴安(中國)有限公司；SU8220場發(fā)射掃描電子顯微鏡(field emission scanning electron microscope，F(xiàn)ESEM)，日本HITACHI公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化與培養(yǎng)

在超凈工作臺中，蘸取保存管中的菌液，平板劃線后在厭氧工作站中37 ℃靜置過夜培養(yǎng)。挑取平板上的單菌落接種于液體培養(yǎng)基中活化24 h，再按 5.0%的接種量進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2.2 Akk對模擬胃腸環(huán)境耐受性評價

模擬胃腸液耐受性：將Akk發(fā)酵液按體積比1∶10加至模擬胃液中，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)，分別計數(shù)0、0.5、1、2、4 h時混合液中的Akk活菌數(shù)；在模擬胃液中作用4 h的懸濁液進(jìn)一步以體積比1∶10加至模擬腸液中，在0、0.5、1、2、4 h分別取樣計活菌數(shù)。每組3個平行，實驗重復(fù)3次。以存活率評價Akk分別對模擬胃腸液的耐受能力。如公式(1)所示：

(1)

式中：Ni為不同時間點樣品中的活菌數(shù)；N0為初始活菌數(shù)。

膽鹽耐受性：向膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.0%、1.2%、1.4%、1.6%的BHI培養(yǎng)基中分別加入體積分?jǐn)?shù)1.0%的Akk發(fā)酵液，37 ℃下靜置培養(yǎng)，在0、3、6、9、24 h分別取樣進(jìn)行活菌計數(shù)，并按公式(1)計算存活率，以菌株存活率來評價Akk對膽鹽的耐受能力。

1.2.3 低聚糖對Akk生長的影響

以10%的接種量將Akk發(fā)酵液接種到不同濃度的3種低聚糖培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)。分別在0、12、24、36、48、60 h時間點取樣，在600 nm處測定OD值。

1.2.4 Akk利用低聚糖產(chǎn)短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFAs)的分析

1.2.4.1 糖耗曲線測定

采用DNS法測定Akk在低聚糖培養(yǎng)基不同發(fā)酵時間樣品的還原糖濃度[11]。取1 mL發(fā)酵樣品與1 mL DNS沸水浴反應(yīng)10 min后，加去離子水9 mL終止反應(yīng)，以時間為橫坐標(biāo)，還原糖含量為縱坐標(biāo)，繪制Akk對不同低聚糖的消耗曲線。

1.2.4.2 SCFAs分析

將Akk在不同低聚糖培養(yǎng)基中的發(fā)酵液樣品12 000 r/min離心5 min，上清液用0.22 μm濾膜過濾，采用HPLC檢測SCFAs，色譜柱：Waters XBridge C18(5 μm)，流動相：30%乙腈、70%水(0.05%磷酸)，柱溫35 ℃，流速0.5 mL/min，進(jìn)樣體積20 μL。

1.2.5 FESEM觀察

Caco-2細(xì)胞在RPMI 1640中連續(xù)培養(yǎng)21 d后，通過離心收集細(xì)胞重懸培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1.0×107CFU/mL。Akk發(fā)酵液離心收集菌體，PBS緩沖液洗滌3次后配制懸浮液，調(diào)節(jié)菌體濃度為1.0×107CFU/mL。添加至Caco-2細(xì)胞中孵育6 h后，在含3%戊二醛磷酸鹽緩沖液中固定24 h，然后PBS洗滌3次，每次15 min，在60 ℃下96%乙醇脫水6 h，室溫干燥。最后，用金-鈀(約2～4 nm厚)進(jìn)行等離子涂層，并通過FESEM在0.1～30 kV的加速電壓下以納米圖像分辨率進(jìn)行分析。

1.2.6 生物膜的測定

將Akk接種到不同濃度的低聚糖液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h結(jié)束后，將菌濃度調(diào)為1.0×107CFU/mL 置于 96孔板里培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基，加入0.2 mL 1%結(jié)晶紫作用30 min，用蒸餾水漂洗后加入0.2 mL 95%的乙醇，所得有色溶液在590 nm測量吸光度，重復(fù)試驗 3次并取平均值記為OD值。以Akk在不含低聚糖的培養(yǎng)基中同等波長下的吸光度做為對照，重復(fù)3次試驗并記錄平均值為D。以對照的平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差作為生物膜形成的界定值Dc(D+3S)，將OD與Dc進(jìn)行比較，判定細(xì)菌形成生物膜能力：OD≤Dc，無生物膜形成能力；Dc4Dc，強(qiáng)生物膜形成能力[12]。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

實驗分析采用OriginPro 9.1軟件進(jìn)行，實驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，每組3個平行，實驗重復(fù)3次。使用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)統(tǒng)計，不同組間比較采用單因素方差分析進(jìn)行差異顯著性分析，P<0.05表示差異顯著，用*表示，P<0.01表示差異極顯著，用**表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 Akk對模擬消化液耐受性評價

經(jīng)過消化系統(tǒng)到達(dá)腸道是益生菌發(fā)揮益生作用的基礎(chǔ)。因此，Akk在胃腸液和膽鹽等高滲透壓環(huán)境的耐受能力是評價其是否能夠作為益生菌應(yīng)用的重要指標(biāo)之一。從模擬胃液中Akk存活率來看(圖1)，Akk在模擬胃液中0.5 h存活率高達(dá)92.16%，隨后開始下降，在1～2 h間趨于平穩(wěn)；在2～4 h內(nèi)Akk存活率持續(xù)下降，但仍能維持在80%以上。隨后進(jìn)入模擬腸液后，Akk存活率下降幅度平緩，總體處于較穩(wěn)定的水平，存活率接近77%，說明Akk具有耐受模擬胃腸液的能力。

圖1 Akk對模擬胃腸液的耐受性Fig.1 Tolerance of Akk to simulated gastrointestinal fluids

進(jìn)一步評價Akk對膽鹽的耐受能力。由圖2可知，Akk存活率隨膽鹽處理時間無明顯差異，膽鹽濃度增加Akk存活率表現(xiàn)小幅度降低，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%膽鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后存活率為83.7%，在1.4%及1.6%膽鹽的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h存活率分別為80.3%和78.1%，說明Akk具有較好的膽鹽耐受性能力。文獻(xiàn)中報道了該模式菌株與植物乳桿菌Lactobacillusplantarumsubsp.plantarumATCC14917胃腸耐受性的對比。Akk本身表現(xiàn)出比植物乳桿菌更優(yōu)良的耐受能力，而當(dāng)利用黃原膠和結(jié)冷膠包埋菌體后，植物乳桿菌耐受性更強(qiáng)。Akk良好的耐受能力不僅與包埋介質(zhì)相關(guān)，也與其自有的耐酸系統(tǒng)有關(guān)[13]。

圖2 Akk在含不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)膽鹽培養(yǎng)基中生長情況Fig.2 Growth of Akk in media containing bile salts with different concentrations

2.2 Akk黏附性

腸道微生物對宿主腸道上皮細(xì)胞的黏附能力是微生物定植腸道并與宿主互作的重要性質(zhì)。以Caco-2細(xì)胞模擬腸上皮細(xì)胞，采用FESEM觀察Akk對細(xì)胞的黏附。從圖3可直觀觀察到，Akk能較好地附著于分化狀態(tài)的Caco-2細(xì)胞微絨毛尖端上。這與文獻(xiàn)中采用熒光染色觀察的結(jié)果一致。Akk對不同分化狀態(tài)的Caco-2細(xì)胞均有一定的黏附能力，共培養(yǎng)時跨上皮電阻顯著提高，增加了腸上皮細(xì)胞的完整性[14]。Akk黏附能力可能與其良好的自聚能力有關(guān)[15]，自聚能力強(qiáng)的益生菌通常具有較強(qiáng)的上皮細(xì)胞黏附能力[16]。

a-Caco-2細(xì)胞;b-Akk與Caco-2細(xì)胞孵育圖3 Akk對Caco-2細(xì)胞黏附性的FESEM圖Fig.3 FESEM images for adhesion ability of Akk to Caco-2 cells

2.3 Akk對低聚糖的利用與代謝產(chǎn)SCFAs分析

2.3.1 低聚糖對Akk生長影響

作為調(diào)節(jié)腸道微生物的益生元，低聚糖具有促進(jìn)益生菌增殖等作用?？疾榫陮Φ途厶堑睦媚芰Τ蔀樵u價益生菌性能指標(biāo)之一[17]。結(jié)合目前關(guān)于低聚糖類益生元的研究現(xiàn)狀，我們選擇分別具有陰離子、陽離子、中性特征的褐藻寡糖、殼寡糖與甘露寡糖3種低聚糖進(jìn)行評價，考查Akk對其利用與代謝能力，輔助了解Akk與低聚糖益生元的作用。整體分析Akk生物量隨時間的變化可知，Akk在12 h以內(nèi)均可以快速利用3種低聚糖生長，并在12 h達(dá)到最大；12～60 h，Akk對褐藻寡糖和殼寡糖的利用基本維持不變(圖4-a、圖4-b)，對甘露寡糖的利用能力略有增加(圖4-c)。比較不同種類的低聚糖利用情況發(fā)現(xiàn)，3種低聚糖中，以殼寡糖對Akk生長促進(jìn)作用相對明顯，1 000 μg/mL的殼寡糖培養(yǎng)基中OD值最高，約0.7。不同低聚糖對益生菌生長的影響可能與菌株對糖的利用偏好性有關(guān)[18]。低聚糖的濃度對Akk的生長情況影響不顯著，3組濃度對應(yīng)的生長曲線幾乎重合。

a-褐藻寡糖;b-殼寡糖;c-甘露寡糖圖4 Akk在不同低聚糖培養(yǎng)基中生長情況Fig.4 Growth of Akk in media containing various oligosaccharides with different concentrations

2.3.2 Akk對低聚糖的利用

通過培養(yǎng)基中剩余還原糖的含量測定考查Akk對低聚糖的利用情況。圖5可以看出，12 h以內(nèi)還原糖含量迅速降低，說明Akk可快速利用3種低聚糖；12 h后，還原糖的含量基本趨于穩(wěn)定，這與上述Akk在3種低聚糖培養(yǎng)基中的生長曲線一致。比較3種低聚糖的利用情況，Akk對褐藻寡糖和殼寡糖的利用程度相當(dāng)，略高于甘露寡糖。研究發(fā)現(xiàn)，Akk可表達(dá)多種多糖降解酶，包括β-半乳糖苷酶、α-巖藻糖苷酶、α-唾液酸酶、β-氨基己糖苷酶等，輔助其對不同結(jié)構(gòu)母乳寡糖的降解利用[19]。除Akk外，其他益生菌對糖類底物的利用也有報道。如雙歧桿菌在胃腸道的定植能力很大程度上依賴于對碳水化合物的利用[20]，且不同菌株對糖的利用情況不同，如青春雙歧桿菌優(yōu)先利用半乳糖、甘露糖、葡萄糖、低聚果糖和菊粉，而對N-乙酰半乳糖胺偏好性則較低[21]。Akk菌對糖利用與代謝的機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

圖5 Akk糖耗曲線Fig.5 Consumption curve of reducing sugars for Akk

2.3.3 Akk利用低聚糖產(chǎn)SCFAs

SCFAs是腸道菌利用益生元產(chǎn)生的一類有助于調(diào)節(jié)能量代謝和腸道穩(wěn)態(tài)的代謝物，SCFAs有助于腸道穩(wěn)態(tài)和能量代謝的調(diào)節(jié)，與代謝性疾病[22]、血腦屏障的通透性調(diào)節(jié)[23]、抗病毒免疫有密切的聯(lián)系[24]，乙酸、丙酸和丁酸是主要種類[25]，其中，乙酸產(chǎn)生量最大，可作為腸外周細(xì)胞的能量來源，為機(jī)體生理活動提供能量；丙酸可影響肝臟和膽固醇代謝，丁酸是結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞的主要能量來源，均與結(jié)腸健康狀態(tài)密切相關(guān)[26]。圖6結(jié)果顯示，Akk在不添加低聚糖培養(yǎng)基中幾乎不產(chǎn)SCFAs，總酸含量低于10 mg/mL；添加3種低聚糖后SCFAs產(chǎn)量顯著提高，主要集中于乙酸、丁酸、丙酸和戊酸，其中，含量最高的均為乙酸(P<0.01)，約是丙酸含量的50倍，其次是丁酸(P<0.05)，戊酸最少。進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)，Akk利用3種低聚糖代謝產(chǎn)生的SCFAs比例不盡相同。Akk利用褐藻寡糖產(chǎn)丁酸的能力高于其他2種低聚糖(P<0.05)，而利用殼寡糖產(chǎn)乙酸的能力最強(qiáng)(P<0.01)，質(zhì)量濃度為(51.62±0.23)mg/mL。這一方面可能與不同種類低聚糖的糖基組成及結(jié)構(gòu)有關(guān)[27]，另一方面，與益生元利用相關(guān)的基因往往是誘導(dǎo)表達(dá)，從而會引起代謝物的不同[28]。研究表明，包括Akk在內(nèi)的腸道益生菌可表達(dá)多種糖苷水解酶以降解聚糖或低聚糖等膳食纖維，進(jìn)而通過多種生物途徑最終產(chǎn)生乙酸、丙酸和丁酸等SCFAs，為宿主代謝提供能量[29]。

圖6 Akk產(chǎn)SCFAs情況Fig.6 Production of SCFAs of Akk注：*表示P<0.05，**表示P<0.01(下同)

2.4 Akk形成生物膜能力分析

微生物為了適應(yīng)所處環(huán)境，通過分泌胞外多糖和凝膠狀黏液使菌體相互黏連進(jìn)而形成生物膜。生物膜的形成是益生菌形成優(yōu)勢占位、發(fā)揮益生作用的重要途徑。如圖7-a所示，Akk在未添加低聚糖的培養(yǎng)基中有一定的自聚集能力，但未形成明顯的生物膜。低聚糖的添加可顯著促進(jìn)Akk形成生物膜，其中，在添加褐藻寡糖培養(yǎng)基中，Akk周圍包裹致密黏液層，形成較為致密的生物膜(圖7-b)，而在含殼寡糖和甘露寡糖的培養(yǎng)基中，Akk能形成較為明顯的生物膜，但致密與連續(xù)程度不及褐藻寡糖(圖7-c、圖7-d)。

a-Akk組;b-Akk添加褐藻寡糖組;c-Akk添加殼寡糖組;d-Akk添加甘露寡糖組圖7 Akk在不同低聚糖培養(yǎng)基中形成生物膜的FESEM圖Fig.7 FESEM images of biofilm for Akk in media with various oligosaccharides

進(jìn)一步結(jié)合染色結(jié)果進(jìn)行比較。如圖8所示，Akk在有無低聚糖添加的培養(yǎng)基中能形成少量生物膜，成膜能力較弱(圖8-a)。這與文獻(xiàn)報道結(jié)果一致。文獻(xiàn)中采用結(jié)晶紫染色法測定Akk和植物乳桿菌生物膜的形成情況，結(jié)果表明，植物乳桿菌具有強(qiáng)生物膜形成能力，而Akk生物膜形成能力較弱[14]。3種低聚糖均可顯著提高Akk的成膜能力至中等，OD590顯著升高(P<0.05)，低聚糖質(zhì)量濃度在0～500 μg/mL時，生物膜形成能力隨濃度增加而增加；在500～1 000 μg/mL，生物膜形成能力隨低聚糖濃度增加而降低，可能是較高濃度的低聚糖未能發(fā)揮協(xié)同Akk生長的效果，其中以500 μg/mL褐藻寡糖中的Akk生物膜形成效果最好(P<0.01)，OD值為1.996±0.01。因此，低聚糖的添加顯著增加了Akk生物膜的形成能力。

a-Akk在BHI培養(yǎng)基中的生物膜形成能力;b-Akk在低聚糖BHI培養(yǎng)基中的生物膜形成能力圖8 Akk生物膜形成能力Fig.8 The ability of biofilm formation for Akk

3 結(jié)論

本研究以Akk模式菌株ATCC BAA-835為研究對象，通過體外靜置培養(yǎng)的方式探討了該菌株在胃腸液中的耐受情況，以及對Caco-2細(xì)胞的黏附性，并且探究了Akk對3種低聚糖的利用特性以及生物膜形成能力。研究結(jié)果表明，Akk具有較好的耐受胃酸、腸液與膽鹽的特性，能夠黏附在分化的Caco-2細(xì)胞上。培養(yǎng)基中添加3種低聚糖均有利于Akk的快速生長，12 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，其中以殼寡糖培養(yǎng)基中Akk生長情況最好，結(jié)果與糖耗曲線相互吻合。Akk利用低聚糖產(chǎn)SCFAs中含量最高的均為乙酸，其次為丁酸，且利用褐藻寡糖產(chǎn)丁酸的能力最高，利用殼寡糖產(chǎn)乙酸的能力最強(qiáng)。Akk自身具有弱生物膜形成能力，低聚糖可顯著提高生物膜形成能力至中等，其中Akk在添加褐藻寡糖培養(yǎng)基中生物膜形成能力較好，可以看出低聚糖促進(jìn)了Akk生物膜的形成。這些結(jié)果表明，本研究利用體外評價手段，從微生物性能角度探討了Akk腸道益生作用的潛在機(jī)制，豐富了對Akk作為腸道益生菌的認(rèn)知。