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    褐藻膠裂解酶的研究進展

    2016-12-22 09:22:02羅丹丹薛永常
    生物學(xué)雜志 2016年6期
    關(guān)鍵詞:褐藻寡糖位點

    羅丹丹,薛永常

    (大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院,大連 116034)

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    褐藻膠裂解酶的研究進展

    羅丹丹,薛永常

    (大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院,大連 116034)

    褐藻膠是由β-D-甘露糖醛酸及其C5差向異構(gòu)體α-L-古洛糖醛酸結(jié)合而成的線性高分子多糖。褐藻膠裂解酶通過β消去機制能將褐藻膠降解成具有生物活性的褐藻寡糖。褐藻寡糖因具有獨特的促進生長、增強植物抗性、抑菌等生理活性而日益受到人們的關(guān)注。簡要概述了褐藻膠裂解酶的來源分類、結(jié)構(gòu)功能、酶學(xué)性質(zhì)、褐藻寡糖的應(yīng)用等方面的研究進展,為褐藻膠裂解酶在工業(yè)生產(chǎn)的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

    褐藻膠;褐藻膠裂解酶;褐藻寡糖

    褐藻膠是存在于褐藻細(xì)胞壁及細(xì)胞間質(zhì)的水溶性酸性多糖,由β-D-甘露糖醛酸及其C5差向異構(gòu)體 α-L-古洛糖醛酸兩種糖醛酸單體通過1,4糖苷鍵隨機聚合而成[1]。褐藻寡糖是褐藻膠的降解產(chǎn)物,近年來關(guān)于其研究日益增多,研究發(fā)現(xiàn)聚合度為3~6的褐藻寡糖具有較好的促進植物根系生長的活性;聚合度為6.8的褐藻寡糖具有較高的激發(fā)子活性;聚合度為5~23的褐藻寡糖具有較好的抑菌活性;除此之外,還發(fā)現(xiàn)褐藻寡糖具有增強宿主免疫系統(tǒng),提高生物體對腫瘤抗性及抗凝血的能力[2]。褐藻寡糖在促進生長、增強植物抗性、抗腫瘤等方面所具有的生理活性使其在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、飼料等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。用酶法降解褐藻膠取代傳統(tǒng)的物理法、化學(xué)法生產(chǎn)褐藻寡糖已成趨勢,褐藻膠裂解酶作為降解褐藻膠的工具酶,對其研究對于褐藻寡糖的綜合利用具有重要的實際意義。本文從褐藻膠裂解酶的來源分類、酶學(xué)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)功能、褐藻膠裂解酶及褐藻寡糖的應(yīng)用等方面概述了近年來國內(nèi)外褐藻膠裂解酶的研究進展。

    1 褐藻膠裂解酶的來源、分類

    1.1 褐藻膠裂解酶的來源

    褐藻膠裂解酶主要來源海洋藻類、軟體動物、棘皮動物和多種微生物。目前發(fā)現(xiàn)的褐藻膠裂解酶大部分來源于細(xì)菌,如固氮菌Azotobactervinelandii、棒桿菌Corynebacteriumsp.ALY-1、交替假單胞菌Pseudoaltermonaselyakovii等[3]。在皺紋盤鮑、紐西蘭鮑螺等海洋軟體動物的肝胰腺及小球藻病毒中也有褐藻膠裂解酶發(fā)現(xiàn)。相較于來源微生物的褐藻膠裂解酶研究的較多,而來源于海洋動物的褐藻膠裂解酶的研究較少。

    1.2 褐藻膠裂解酶的分類

    根據(jù)褐藻膠裂解酶作用方式的不同,可分為內(nèi)切酶與外切酶,目前發(fā)現(xiàn)的褐藻膠裂解酶大多數(shù)具有內(nèi)切酶活性,外切酶較少見[1]。

    根據(jù)褐藻膠裂解酶降解底物專一性不同可將褐藻膠裂解酶分為3類:專一性裂解多聚甘露糖醛酸(poly M)的裂解酶;專一性裂解多聚古洛糖醛酸(poly G)的裂解酶;兩種多聚糖都可裂解的雙功能裂解酶[3]。褐藻膠裂解酶的作用方式及作用位點見圖1。

    圖1 褐藻膠裂解酶酶切位點及作用方式示意圖

    注:空心箭頭顯示處為外切褐藻膠裂解酶作用位點,實心箭頭顯示處分別為內(nèi)切褐藻膠裂解酶降解poly M、poly MG、poly G作用位點

    根據(jù)其相對分子質(zhì)量的不同可將褐藻膠裂解酶大致分為3類:第1類分子量在 20 ku~35 ku之間;第2類分子量約為40 ku;第3類分子量約為60 ku[1]。

    在多糖裂解酶家族中,根據(jù)酶的氨基酸序列相似性,褐藻膠裂解酶被劃分在PL5、PL7、PL14、PL15等多糖裂解酶家族中。大多數(shù)褐藻膠裂解酶屬于PL5和PL7家族[1]。

    2 褐藻膠裂解酶的酶學(xué)性質(zhì)

    大部分褐藻膠裂解酶的最適pH值是中性或偏弱堿性,少數(shù)為酸性;最適溫度一般處于30℃~50℃之間,褐藻膠裂解酶的來源不同,酶學(xué)性質(zhì)也有一定的差異。如來自交替假單胞菌的Pseudoalteromonassp.CY24[4]的褐藻膠裂解酶的最適 pH值為10.6,海洋細(xì)菌StenotrophomasmaltophiliaKJ-2[5]重組褐藻膠裂解酶最適pH值為9.0,在pH 8.5~10.0范圍內(nèi)穩(wěn)定。海洋細(xì)菌Pseudomonassp.E03[6]的褐藻膠裂解酶pH值穩(wěn)定范圍為6.0~9.0。但是海洋弧菌QY103[7]所產(chǎn)褐藻膠裂解酶在pH 6.0時活性最強,在pH 5.0~9.0之間活性比較穩(wěn)定。褐藻膠裂解酶ALGL[8]的最適pH也是偏酸性為6.6,不過ALGL的酸堿穩(wěn)定性較差,僅能在pH 6.5~7.0環(huán)境中維持穩(wěn)定2 h。QY103產(chǎn)褐藻膠裂解酶及褐藻膠裂解酶ALGL與早期發(fā)現(xiàn)的Azotobactervinelandii[9]產(chǎn)的褐藻膠裂解酶性質(zhì)有些相似,它們的最適pH都是偏酸性的,Azotobactervinelandii產(chǎn)的褐藻膠裂解酶的最適pH值為4.2。大部分褐藻膠裂解酶的最適溫度處于30℃~50℃之間,只有少部分褐藻膠裂解酶的最適溫度會高于50℃,大多數(shù)的褐藻膠裂解酶的溫度穩(wěn)定性都較差,不利于高溫下酶促反應(yīng)的進行。本實驗室最近也篩選一株產(chǎn)褐藻膠裂解酶的海洋細(xì)菌,其最適pH 5.0,pH值在4~8之間酶活穩(wěn)定,最適溫度處于40℃~50℃之間。

    褐藻膠裂解酶活性受金屬離子影響。由于褐藻膠裂解酶的產(chǎn)生菌多是從海洋中篩選,所以Na+對酶活有一定的影響。如Vibriosp.QY105[10]所產(chǎn)褐藻膠裂解酶對Na+有很強的依賴性,在沒有Na+的反應(yīng)體系中幾乎檢測不到酶活。多數(shù)情況下Na+、K+、Ca2+、Mg2+等離子對酶活有促進作用,而SDS、EDTA、Fe2+、Cu2+、Mn2+、Hg2+等對酶活有抑制作用。少數(shù)情況下EDTA對酶活有促進作用,如EDTA對海洋細(xì)菌Vibriosp.QY103[7]及鏈霉菌Streptomycessp.A5[11]所產(chǎn)褐藻膠裂解酶酶活均有促進作用。Zn2+對Vibriosp.W13[12]產(chǎn)褐藻膠裂解酶酶活有抑制作用,而對Pseudomonassp.E03[6]產(chǎn)褐藻膠裂解酶酶活卻有促進作用。

    褐藻膠裂解酶能夠?qū)⒑衷迥z降解為聚合度20以下的褐藻寡糖。海洋細(xì)菌StenotrophomasmaltophiliaKJ-2[5]產(chǎn)褐藻膠裂解酶降解產(chǎn)物為褐藻二糖、三糖、四糖;細(xì)菌Flavobacteriumsp.S20[13]產(chǎn)褐藻膠裂解酶降解產(chǎn)物為褐藻五糖、六糖、七糖,重組酶Alg7D[14]的降解產(chǎn)物主要為褐藻四糖、五糖及少量的二糖和三糖,是多種低聚寡糖的混合物。而海洋弧菌Vibriosp.QY107[15]產(chǎn)褐藻膠裂解酶的降解產(chǎn)物主要為褐藻三糖,只有極少量的二糖生成,降解產(chǎn)物比較單一,這在已發(fā)現(xiàn)的褐藻膠裂解酶中是比較少見的。

    3 褐藻膠裂解酶的結(jié)構(gòu)和功能

    不同褐藻膠裂解酶在初級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)雖有較大差別,但在催化中心的結(jié)構(gòu)和必需氨基酸殘基的種類上卻有一定程度的相似性。如Lys、Arg、His、Ser以及Tyr屬于PL-14家族中褐藻膠裂解酶催化中心的保守氨基酸殘基,參與酶的催化作用并且是重要的催化位點[16];RXELREM和YFKAGXY是屬于PL-7家族中褐藻膠裂解酶催化中心的保守序列。

    目前已有部分褐藻膠裂解酶的結(jié)構(gòu)得到解析。如褐藻膠裂解酶ALY-1[17]的催化位點和結(jié)合位點成口袋狀結(jié)構(gòu),利于與底物結(jié)合而發(fā)生反應(yīng)。蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示為β-折疊,ALY-1具有N端YXRSELREM和C端YEKAGGYTQ共有序列,N端共有序列中R(Arg)為活性中心,C端共有序列中Y(Tyr)為活性位點。其中,R與褐藻膠多糖鏈上的-OH進行反應(yīng),Y和Q與位于反應(yīng)點附近的褐藻膠多糖相互作用,使反應(yīng)環(huán)境穩(wěn)定。而P.syringae[18]褐藻膠裂解酶主要是由螺旋構(gòu)成的柵狀結(jié)構(gòu),酶的活性中心包括 Asn、His、Arg 和Tyr,His位于保守序列中,褐藻膠裂解酶結(jié)構(gòu)中包含一個很深的隧道裂縫結(jié)構(gòu),有利于底物分子的滲入,并與酶催化位點相互作用。此外,LbAly35[19]是屬于PL14家族的褐藻膠裂解酶,在它的催化中心有Lys、Arg、Try保守序列位點,其中Lys是LbAly35的催化活性中心。

    研究還發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量在40 ku左右的褐藻膠裂解酶催化中心是一個隧道樣的裂縫,位于催化中心的Arg、Lys及帶有芳香環(huán)的氨基酸決定了酶的底物專一性。酶活性中心的保守序列、套環(huán)結(jié)構(gòu)等對底物識別和結(jié)合有重大作用。Trp、Lys、His以及Cys是酶活性中心的必需氨基酸殘基,其中Trp參與了底物的結(jié)合,Lys和His直接參與催化反應(yīng)[20]。而分子質(zhì)量在30 ku左右的褐藻膠裂解酶氨基酸序列相似性較低,但這一類褐藻膠裂解酶在 C 端均具有半保守的YFKAGVYNQ氨基酸序列,這一序列參與三維構(gòu)像的維持。30 ku左右的褐藻膠裂解酶具有不同的底物專一性。

    4 褐藻膠裂解酶的應(yīng)用

    褐藻膠裂解酶可以用于褐藻寡糖的制備。其通過β消除反應(yīng)催化褐藻膠降解為褐藻寡糖,作用位點是α-1,4糖苷鍵,并在非還原末端產(chǎn)生不飽和雙鍵。不飽和雙鍵的產(chǎn)生對寡糖的某些生物活性有重要影響,而利用物理法或化學(xué)法降解所獲得的寡糖卻沒有這些特性。這些獨特的生物活性增加了褐藻寡糖的應(yīng)用價值[21]。但是酶法生產(chǎn)褐藻寡糖仍處于研究階段,距離其工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)仍有一段距離。

    此外褐藻膠裂解酶還可以用于生物乙醇制備。近年來關(guān)于褐藻發(fā)酵生產(chǎn)生物乙醇的研究逐漸增多。海藻通過發(fā)酵將褐藻酸鹽降解成低聚寡糖進而轉(zhuǎn)化成生物乙醇[13]。褐藻膠裂解酶是褐藻發(fā)酵生產(chǎn)生物乙醇的關(guān)鍵酶。解決了常見的大腸桿菌不能利用褐藻膠及釀酒酵母和運動發(fā)酵單胞菌也不能直接發(fā)酵褐藻生成乙醇的問題。如果將褐藻膠裂解酶基因及乙醇發(fā)酵途徑轉(zhuǎn)入大腸桿菌,構(gòu)建成可以直接利用褐藻發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的工程菌,就可以實現(xiàn)褐藻到生物乙醇的直接轉(zhuǎn)化。Wargacki等[22]構(gòu)建了可以直接利用褐藻發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的工程菌,其乙醇產(chǎn)量可達(dá)到理論值的 80%,因此降解褐藻生產(chǎn)生物乙醇是未來能源研究的熱點和重點。

    5 褐藻寡糖的應(yīng)用

    5.1 褐藻寡糖在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用

    褐藻寡糖同植物內(nèi)源性寡糖半乳糖醛酸結(jié)構(gòu)相似,并具有類似內(nèi)源性寡糖的信號分子作用,故在促進植物生長、增強植物抗性及抑制植物病原菌方面有很好的效果。早在20世紀(jì)90年代人們就發(fā)現(xiàn)褐藻寡糖能促進植物根系生長,Yoshihisa[23〗[24]發(fā)現(xiàn)褐藻寡糖可以通過提高葉綠素含量、淀粉酶活力及植株根系活力進而促進大麥種子的萌發(fā)和幼苗生長。另外褐藻寡糖對杏鮑菇菌絲體生長速度、生物量及纖維素酶活性均具有促進作用,低濃度寡糖促進作用更明顯[25]。目前,關(guān)于其作用機理尚在研究中并不明確。

    使用褐藻寡糖處理小麥葉片可促進葉片中內(nèi)源性脫落酸(ABA)積累,可能是通過誘導(dǎo)ABA從頭合成途徑中的相關(guān)合成基因TaNCED、TaAOX和TaBG的表達(dá)實現(xiàn)的,最終提高了植株的抗逆性[26]。外施0.4%的褐藻寡糖能明顯緩解毒死蜱引起的小麥葉綠素 a、b及總?cè)~綠素含量的降低,脯氨酸、可溶性蛋白及可溶性糖增加,增強植物對毒死蜱脅迫的抗性,使毒死蜱對小麥幼苗的傷害明顯降低[27]。除此之外,褐藻寡糖還可刺激大豆子葉積累植物抗毒素和丙氨酸解氨酶,抑制銅綠假單胞桿菌。聚合度為6~8的褐藻寡糖對銅綠假單胞菌有抗菌活性。褐藻酸寡糖在誘導(dǎo)大豆獲得最高大豆抗毒素含量時,增加了大豆中異黃酮類化合物含量,提高了大豆蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值[28]。

    褐藻寡糖對植物生理調(diào)節(jié)的多樣化及對某些病原菌的抑制作用使其在農(nóng)業(yè)研究中有很大的開發(fā)潛力。而且與傳統(tǒng)化肥農(nóng)藥相比,褐藻寡糖安全無毒害,不會對生態(tài)環(huán)境造成迫害。用褐藻寡糖生產(chǎn)農(nóng)業(yè)產(chǎn)品,可以為發(fā)展綠色農(nóng)業(yè)提供支撐。

    5.2 褐藻寡糖在醫(yī)藥、食品及飼料領(lǐng)域的應(yīng)用

    隨著對褐藻寡糖生理活性研究的深入,已有以褐藻寡糖為原料的海洋藥物面世。如用于治療腦血栓、腦栓塞疾病的藻酸雙脂鈉,治療艾滋病的新藥硫酸寡糖SPMG及抗腦缺血新藥989等。褐藻寡糖還可以作為飼料添加劑應(yīng)用在飼料領(lǐng)域,相比于傳統(tǒng)的添加劑褐藻寡糖具有能改變動物消化道微生物菌相、提高動物日增重、飼料轉(zhuǎn)化率、抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等致病菌的優(yōu)勢[29];亦有研究表明褐藻寡糖在一定濃度下,可以明顯縮短雙歧桿菌生長的適應(yīng)期,使雙歧桿菌大量生長。是一種有效的雙歧桿菌增長因子,對雙歧桿菌的生長具有明顯的促進作用,故褐藻寡糖可以作為雙歧因子,應(yīng)用于食品領(lǐng)域。關(guān)于褐藻寡糖應(yīng)用于飼料和食品的相關(guān)研究報道較少。

    6 褐藻膠裂解酶的應(yīng)用展望

    近年來,隨著對褐藻膠裂解酶研究的廣泛深入,發(fā)現(xiàn)褐藻膠裂解酶及褐藻寡糖均具有廣泛的用途,這使得褐藻膠裂解酶的商業(yè)價值不斷提升。目前制約其實現(xiàn)商業(yè)化的問題有酶活性低,酶與底物結(jié)合緊密,分離困難,產(chǎn)酶菌株為致病菌等。因此利用基因工程、細(xì)胞工程等手段對產(chǎn)酶菌株進行改造,或是利用固定化技術(shù)對酶進行修飾,突破酶的應(yīng)用限制是褐藻膠裂解酶實現(xiàn)商業(yè)化的重要技術(shù)手段。

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    Advance in alginate lyases

    LUO Dan-dan,XUE Yong-chang

    (School of Biological Engineering,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China)

    Alginate lyases can catalyze the degradation of alginate,a complex copolymer of L-guluronate and its C5 epimer D-mannuronate,with β-elimination mechanism and yield alginate oligosaccharides.Alginate oligosaccharide has many kinds of biological activities,such as promoting growth,enhancing resistance in plant and bacteriostasis,so that they have attracted more and more people′s attention.In this paper some research progress in the classification,structure,function,enzymatic properties of alginate lyase and the application of alginate oligosaccharides were reviewed.It will provide a theoretical basis for its application in industrial production.

    alginate; alginate lyase; alginate oligosaccharides

    2015-12-23;

    2016-01-08

    羅丹丹,碩士生,研究方向為微生物生理,E-mail:luodandan1905@163.com

    薛永常,博士,教授,研究方向為分子生物學(xué),E-mail:xueych@dlpu.edu.cn

    10.3969/j.issn.2095-1736.2016.06.095

    Q939.9

    A

    2095-1736(2016)06-0095-04

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