混合培養(yǎng)基模式培養(yǎng)雜交瘤細胞表達單克隆抗體

黃亞杰，朱光凱，劉 珊，趙永強，謝 波，劉道軍

(1.汕頭大學 醫(yī)學院，汕頭 515041；2.中國科學院過程工程研究所 生化工程國家重點實驗室，北京 100190)

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混合培養(yǎng)基模式培養(yǎng)雜交瘤細胞表達單克隆抗體

黃亞杰1,2，朱光凱2，劉 珊2，趙永強2，謝 波2，劉道軍1

(1.汕頭大學 醫(yī)學院，汕頭 515041；2.中國科學院過程工程研究所 生化工程國家重點實驗室，北京 100190)

采用混合培養(yǎng)基模式將雜交瘤細胞進行減血清懸浮馴化培養(yǎng)，通過優(yōu)化提高單克隆抗體的表達量，并進行抗體的分離純化。在雜交瘤細胞懸浮培養(yǎng)優(yōu)化過程中，最終確定的血清濃度為2%胎牛血清，培養(yǎng)基配比為RPM1640：SFM4CHO：OptiCHO(4.5：4.5：1)，接種密度為3×105cells/mL，采用批次補料流加培養(yǎng)，每2 d流加1次，每次流加量為初始體積的3%，抗體的表達量從原始的84 mg/L提高到168 mg/L。將其進一步在5 L攪拌式生物反應(yīng)器中進行培養(yǎng)，離心后上清經(jīng)protein A親和層析純化，確定抗體的產(chǎn)量為240 mg/L。

雜交瘤細胞培養(yǎng)；單克隆抗體；懸浮馴化；親和層析

單克隆抗體具有特異性強、成分均一可控等優(yōu)勢，廣泛應(yīng)用于疾病治療、醫(yī)學診斷、生物免疫檢測和蛋白純化等領(lǐng)域[1-3]。雖然雜交瘤細胞表達的單抗鼠源性限制了鼠單抗藥物的縱深發(fā)展，但作為分析診斷等用途仍占有相當大的市場，且其作為表面抗原的研究，蛋白的親和純化，組織相容性檢測和放射免疫測定等方面的應(yīng)用有著廣闊的前景[4-5]。

隨著動物細胞培養(yǎng)規(guī)模的擴大和單抗需求的增長，雜交瘤細胞的培養(yǎng)工藝和方法得到了不斷地改進[6-7]，包括培養(yǎng)基的優(yōu)化[8-9]，培養(yǎng)工藝的設(shè)計[10-11]，純化方法的選擇等[12-13]。但是雜交瘤細胞的體外培養(yǎng)表達量仍普遍較低[14]。而且雜交瘤細胞的培養(yǎng)常用基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入高濃度(10%～20%)的血清[15-16]，這樣不但增加了雜交瘤細胞培養(yǎng)的成本，而且血清的存在提高了引入內(nèi)毒素的風險，同時給下游的分離純化帶來很大困難[17]。雜交瘤細胞的無血清懸浮培養(yǎng)需要加入血清替代物，對細胞生長和抗體表達影響并不顯著[18-20]。雖然對培養(yǎng)基成分進行優(yōu)化可以改善雜交瘤細胞的生長和提高抗體表達量，但培養(yǎng)基一般由60～80種成分組成，繁瑣的優(yōu)化設(shè)計實驗對雜交瘤細胞生長密度和表達量的提高空間有限[21-22]。

本研究在對雜交瘤細胞進行減血清懸浮馴化培養(yǎng)的同時，嘗試采用了幾種培養(yǎng)基混合培養(yǎng)的模式，對雜交瘤細胞培養(yǎng)和制備工藝進行了優(yōu)化，以期提高雜交瘤細胞培養(yǎng)的密度和抗體產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雜交瘤細胞(北京三元基因工程有限公司提供)；RPMI1640(Gibco，RPMI1640TMbasic)；SFM4CHO(HyClone，SFM4CHOTM)；OptiCHO(Gibco，OptiCHOTM)；Protein A(GE Healthcare，MabSelect SuReTM)；FD004(中國科學院過程工程研究所生化工程國家重點實驗室研制)；Tris、Tris-HCl、NaCl、乙酸均為西隴化工股份有限公司，分析純試劑；胎牛血清(天津康源生物技術(shù)有限公司)；其他均為市售分析純試劑。

1.2 實驗儀器

5 L細胞反應(yīng)器(Applikon Biotechnology，5 L ez-control)；二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Scientific，HERA CELL 240i)；細胞計數(shù)儀(Invitrogen，CountessTMautomated cell counter)；倒置顯微鏡(OPTEC，BDS200)；低溫高速離心機(Thermo Scientific，SORVALL Biofuge Stratos)；常溫低速離心機(上海安亭科學儀器廠，DL4000B)；Protein Purify System (PPS，中國科學院過程工程研究所生化工程國家重點實驗室)；層析柱(上海華美實驗儀器廠，BOMEXTM3.5×30 cm)；酶標儀(Thermo Scientific，VARIOSKAN FLASH 3001)

1.3 實驗方法

1.3.1 雜交瘤細胞減血清懸浮馴化培養(yǎng)

將細胞復(fù)蘇后接種于T75方瓶中(3×105cells/mL的接種密度，培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的RPMI1640，37℃，5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng))。每2 d傳代(細胞長滿90%以上，胰酶消化細胞)，細胞穩(wěn)定后，減血清為8%，逐次培養(yǎng)和遞減血清濃度至4%。此時從T75方瓶中取出生長期的細胞，1200 r/min離心4 min，棄去上清，分別培養(yǎng)于添加含有4 mmol/L Gln，4%胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基RPM1640、SFM4CHO、OptiCHO、RPM1640：SFM4CHO(1：1)、RPM1640：OptiCHO(1：1) 、RPM1640：SFM4CHO：OptiCHO(3：4：3)、RPM1640：SFM4CHO：OptiCHO (4.5：4.5：1)。以40 mL培養(yǎng)體積，3×105cells/mL的接種密度接種于125 mL搖瓶中，放置于5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)搖床中，37℃，125 r/min轉(zhuǎn)速培養(yǎng)。每隔2 d換液傳代，細胞穩(wěn)定后，減血清為2%。

1.3.2 雜交瘤細胞培養(yǎng)工藝的研究

1)細胞接種密度考察。

采用不同接種密度考察其對雜交瘤細胞生長及抗體表達的影響。將不同密度0.3×106、0.5×106、0.8×106和1×106cells/mL細胞接種于125 mL的搖瓶中(基礎(chǔ)培養(yǎng)基為4 mmol/L Gln，2% FBS的RPMI1640：SFM4CHO(1：1)40 mL，125 r/min轉(zhuǎn)速，37℃，5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)搖床培養(yǎng))。流加培養(yǎng)基FD004，每次流加液體積為初始體積的5%，流加2次，分別于第3天，第6天流加。每天檢測細胞密度和活率，培養(yǎng)結(jié)束留樣測定抗體含量。

2)細胞培養(yǎng)過程中混合培養(yǎng)基的配比。

通過不同培養(yǎng)基的配比篩選，考察不同培養(yǎng)基對雜交瘤細胞生長與抗體表達的影響。將雜交瘤細胞以0.3×106cells/mL的接種密度接種于125 mL搖瓶中(125 r/min轉(zhuǎn)速，37oC，5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)搖床培養(yǎng))。流加培養(yǎng)基FD004，每次流加液體積為初始體積的5%，流加2次，分別于第3天，第6天流加?；A(chǔ)培養(yǎng)基分別為含4 mmol/L Gln，2%FBS的RPM1640、SFM4CHO、OptiCHO、RPM1640：SFM4CHO(1：1)、RPM1640：OptiCHO(1：1) 、RPM1640：SFM4CHO：OptiCHO(3：4：3)、RPM1640：SFM4CHO：OptiCHO (4.5：4.5：1)各40 mL。每天檢測細胞密度和活率，培養(yǎng)結(jié)束留樣測定抗體含量。

3)細胞培養(yǎng)過程中流加量與流加時間的確定。

雜交瘤細胞以40 mL含4 mmol/L Gln，2%FBS的RPMI1640：SFM4CHO：OptiCHO(4.5：4.5：1)為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，0.3×106cells/mL的接種密度接種于125 mL搖瓶中(125 r/min轉(zhuǎn)速，37℃，5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)搖床培養(yǎng))。以FD004為流加液，采用表1中3種流加方案。每天檢測細胞密度和活率，培養(yǎng)結(jié)束留樣測定抗體含量。

表1 細胞培養(yǎng)流加方案

4)雜交瘤細胞培養(yǎng)反應(yīng)器工藝的探索。

1.3.3 細胞培養(yǎng)上清液親和層析純化工藝的確定

1)洗脫pH值的篩選。

將凍存上清液在37℃水浴中解凍，加入2 mol/L NaCl；采用的柱子填料為Mab Select Sure (GE healthcare)，體積為200 mL，平衡液(2 mol/L NaCl，25 mmol/L Tris(Tris 0.73 g/L；Tris-HCl 2.98 g/L)，pH 7.7)平衡2個柱體積(CV 50 mL)，流速6 mL/min；上樣500 mL，流速5 mL/min；平衡液作為淋洗液，淋洗2個柱體積，流速6 mL/min；洗脫液(不同pH 3.0、3.5、4.0的醋酸溶液)，收集洗脫峰；用1 mol/L Tris中和目的蛋白濃縮液至pH 6.0；平衡液作為沖洗液，沖洗2個柱體積，流速6 mL/min；純水沖洗2個柱體積，流速6 mL/min，20%乙醇沖洗2個柱體積，4℃保存。

表2 反應(yīng)器工藝參數(shù)

2)平衡緩沖液中鹽濃度的考察。

在篩選出的pH值條件下考察含1 mol/L和2 mol/L NaCl上清液和平衡液對純化效果的影響。純化步驟同上。

1.3.4 檢測方法

1)細胞計數(shù)。

取10 μL細胞樣品，加入10 μL 0.4%臺盼藍染液染色，吹打混勻，用移液槍吸取10 μL，打入一次性細胞計數(shù)板中，在細胞計數(shù)儀中計細胞密度與活率。

2)抗體濃度檢測。

樣品上清中的抗體濃度采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定。首先將抗原吸附在96孔板上，然后添加抗體標準品和待測樣品分別與抗原結(jié)合，最后添加熒光標記的二抗，通過顯色劑顯色，用酶標儀D450 nm做出標準曲線，通過計算得出上清中的抗體濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交瘤細胞減血清懸浮馴化培養(yǎng)

雜交瘤細胞是非貼壁依賴性細胞，在有細胞貼壁因子存在的條件下，可以貼在方瓶瓶壁之上，但細胞胞體呈圓球形，故雜交瘤細胞在有血清存在下會貼壁生長，因為血清中含有貼壁因子，隨著血清濃度的降低，在4%血清時開始出現(xiàn)懸浮細胞。隨著血清濃度減至2%以下時，細胞的生長狀態(tài)變差。細胞的最大密度降低，維持周期變短。故最終考慮保留血清濃度在2%。細胞穩(wěn)定傳代后，細胞清亮透明，形狀規(guī)整，基本無死細胞的存在。

2.2 雜交瘤細胞培養(yǎng)工藝的研究

2.2.1 細胞接種密度的考察

以0.3×106、0.5×106、0.8×106和1×106cells/mL 4種不同的接種密度接種細胞于125 mL搖瓶培養(yǎng)8 d。圖1為不同接種密度下細胞的生長情況，結(jié)果可知，以0.3×106cells/mL、0.8×106cells/mL獲得的最高活細胞密度達到2.0×106cells/mL高于其他兩種接種密度的獲得的最高活細胞密度；以0.3×106cells/mL接種的細胞在第6天達到最高活細胞密度，細胞活率第7天維持在70%，以0.8×106cells/mL接種的細胞在第3天達到最高活細胞密度，細胞活率在第6天下降至60%。圖2總結(jié)了不同接種密度下活細胞密度對時間的累積積分值(IVCC)和最終獲得的抗體含量值，4種不同接種密度下以0.3×106cells/mL、0.8×106cells/mL的IVCC值最高為11.7×106/mL·d和11.95×106/mL·d，而以0.3×106cells/mL接種的細胞最終獲得抗體含量最高為78.83 mg/L，而其他3種情況抗體產(chǎn)量相當。

圖1 不同接種密度的細胞生長曲線

Note: Solid line-VCD; Short dot line-Viability

2.2.2 細胞培養(yǎng)過程中混合培養(yǎng)基的配比選擇

圖3為不同培養(yǎng)基條件下細胞的生長情況，對比1(RPM1640)、2(SFM4CHO)、3(OptiCHO)、4(RPM1640+SFM4CHO)、5(RPM1640+OptiCHO)、6[RPM1640：SFM4CHO：OptiCHO(3：4：3)]、7[RPM1640：SFM4CHO：OptiCHO(4.5：4.5：1)]等7種基礎(chǔ)培養(yǎng)基，單一培養(yǎng)基(除OptiCHO培養(yǎng)基外)與混合培養(yǎng)基相比，混合培養(yǎng)基可以達到更高的細胞生長密度；細胞生長周期維持更長時間。其中混合培養(yǎng)基RPM1640：SFM4CHO：OptiCHO(4.5：4.5：1)的最高活細胞密度為3.4×106cells/mL。雖然單一OptiCHO培養(yǎng)基的最高活細胞密度與RPM1640：SFM4CHO：OptiCHO(4.5：4.5：1)混合培養(yǎng)基相當，但其活細胞密度對時間的累積積分值(IVCC)和最終獲得的抗體表達量相對于混合培養(yǎng)基較低(圖4)，OptiCHO培養(yǎng)基的IVCC值和抗體表達量分別為15.42×106/mL·d和114.31 mg/L，而RPM1640+OptiCHO、RPM1640：SFM4CHO：OptiCHO(3：4：3)、RPM1640：SFM4CHO：OptiCHO(4.5：4.5：1)等混合培養(yǎng)基的抗體表達量相當，依次為127.21 mg/L、124.57 mg/L和127.78 mg/L，綜合考慮單一OptiCHO培養(yǎng)基的成本較高，因此選擇RPM1640：SFM4CHO：OptiCHO(4.5：4.5：1)混合培養(yǎng)基更為經(jīng)濟、合理。

圖2 不同接種密度條件下活細胞密度對時間的積分和抗體表達量

Note: Solid line-IVCC; Bar graph-Titer

圖3 不同培養(yǎng)基的細胞生長曲線

Note: Solid line-VCD; Short dot line-Viability；1：RPM1640；2：SFM4CHO；3：OptiCHO；4：RPM1640：SFM4CHO(1：1)；5：RPM1640：OptiCHO(1：1)；6：RPM1640：SFM4CHO：OptiCHO(3：4：3)；7：RPM1640：SFM4CHO：OptiCHO(4.5：4.5：1)

2.2.3 批次補料流加培養(yǎng)工藝的優(yōu)化

批次補料流加培養(yǎng)是動物細胞培養(yǎng)中通常采用的培養(yǎng)工藝，采用的流加液流加量、流加次數(shù)和時間是流加工藝中的重要參數(shù)。為了確立雜交瘤細胞較優(yōu)的流加時間和流加量，考察了3種流加方案下，雜交瘤細胞的生長和抗體表達量情況。

從圖5的細胞生長曲線可知，3種流加方案細胞達到的最高活細胞密度依次是4.1×106、3.7×106和3.5×106cells/mL。但方案1細胞活率維持較高水平時間較短，可能是較少的補料量導致雜交瘤細胞的營養(yǎng)不足以維持細胞生長。圖6所示為3種方案下細胞的IVCC值和最終獲得的抗體表達量。3種流加方案的表達量依次為122.62、168.21和145.77 mg/L。方案2可以得到比其他兩種方案更高的抗體表達量。所以最終選擇方案2作為雜交瘤細胞的批次補料流加培養(yǎng)模式。

圖4 不同培養(yǎng)基時活細胞密度對時間的積分和抗體表達量

Note: Solid line-IVCC; Bar graph-Titer；1：RPM1640；2：SFM4CHO；3：OptiCHO；4：RPM1640：SFM4CHO(1：1)；5：RPM1640：OptiCHO(1:1)；6：RPM1640：SFM4CHO：OptiCHO(3：4：3)；7：RPM1640：SFM4CHO：OptiCHO(4.5：4.5：1)

圖5 不同流加時間的細胞生長曲線

Note: Solid line-VCD; Short dot line-Viability

2.2.4 雜交瘤細胞培養(yǎng)反應(yīng)器工藝的確定

根據(jù)雜交瘤細胞培養(yǎng)前期搖瓶實驗結(jié)果進行了5L反應(yīng)器工藝研究，以確定穩(wěn)定的雜交瘤細胞培養(yǎng)工藝。通過前期搖瓶實驗結(jié)果確定反應(yīng)器上罐的接種密度為0.3×106cells/mL，培養(yǎng)基為含2%血清的RPM1640：SFM4CHO：OptiCHO(4.5：4.5：1),流加方案為2、4、6隔天流加，每次流加量為總體積的3%。由于反應(yīng)器中能更好地控制細胞培養(yǎng)的溶氧、溫度和pH值，5L反應(yīng)器中細胞最高活細胞密度可達到5.1×106cells/mL，明顯高于搖瓶實驗結(jié)果，培養(yǎng)第9天細胞活率大于70%(圖7)，IVCC值和最終抗體表達量分別為30.07×106/mL·d，240mg/L(圖8)，反應(yīng)器培養(yǎng)過程中乳酸和銨根離子的含量維持在很低水平。

圖6 不同流加方案時活細胞密度對時間的積分和抗體表達量

Note: Solid line-IVCC; Bar graph-Titer

圖7 5L細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中細胞生長曲線

圖8 細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中活細胞密度對時間的積分和抗體表達量

2.2.5 抗體親和層析純化工藝的確定

鹽濃度和洗脫pH值是影響抗體親和純化的兩個重要參數(shù)。其中，在低鹽濃度下雜交瘤抗體與Protein A的結(jié)合活性較低，故考察含有1、2 mol/L NaCl上清液和平衡液條件下對純化效果的影響。同時考察了不同pH值的洗脫液(pH 3.0、3.5、4.0)對最終洗脫效果的影響。在含2 mol/L NaCl的上清和平衡緩沖液時，在洗脫液pH 3.0、3.5時洗出的蛋白出現(xiàn)渾濁，離心之后，經(jīng)紫外吸收法測得細胞上清抗體濃度分別為97 mg/L，128 mg/L，而pH 4.0的洗脫液洗脫后測得的抗體濃度為224 mg/L(上樣細胞上清抗體濃度為240 mg/L)。洗脫液在pH 4.0，抗體回收率明顯高于pH 3.0和3.5，因此選擇洗脫液pH 4.0。

在篩選出的pH值條件下考察含1 mol/L NaCl的上清和平衡液對抗體純化的影響。最后洗出的細胞上清抗體濃度為188 mg/L。含1 mol/L NaCl上清和平衡液比含2 mol/L NaCl上清和平衡液損失更多的抗體蛋白，故最終選擇洗脫液pH 4.0，2 mol/L NaCl上清和平衡液作為雜交瘤細胞單克隆抗體的親和層析條件。

3 討論與結(jié)論

影響雜交瘤細胞表達抗體的因素很多，其中培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件是其中的兩個主要因素。雖然通過對培養(yǎng)基組成成分進行綜合改進的方法[14]可以有效地提高雜交瘤細胞的生長和抗體表達量，但此方法繁瑣，工作量大，而本研究中通過培養(yǎng)基混合的方式不但提高了雜交瘤細胞的生長和抗體表達量，而且方法簡單，經(jīng)濟、易于實現(xiàn)。雖然雜交瘤細胞無血清培養(yǎng)可以減少一定成本，但在提高細胞生長和抗體產(chǎn)量方面空間有限，而且改變細胞的生長代謝狀況[23]，本研究中通過減血清培養(yǎng)不但提高了雜交瘤細胞的最高生長密度和抗體表達量，而且生物反應(yīng)器中細胞代謝產(chǎn)生的乳酸和銨離子很低，這對于延長雜交瘤細胞的培養(yǎng)周期十分重要。同時，優(yōu)化抗體純化的洗脫緩沖液鹽濃度和pH值[24]，這對于雜交瘤細胞生產(chǎn)單克隆抗體都會提供很好的借鑒和幫助。

綜上所述，本研究以雜交瘤細胞作為單克隆抗體表達細胞，通過培養(yǎng)基篩選、優(yōu)化細胞培養(yǎng)和分離純化工藝，提高抗體表達量，得出如下結(jié)論：

1)確定了雜交瘤細胞培養(yǎng)的接種密度為0.3×106cells/mL，采用的混合培養(yǎng)基為含2%血清的RPM1640：SFM4CHO：OptiCHO(4.5：4.5：1)的培養(yǎng)基。

2)采用的流加培養(yǎng)工藝為細胞培養(yǎng)的第2、4、6天流加，每次3%(初始體積)的流加量可以得到較高的細胞表達量。

3)經(jīng)過搖瓶培養(yǎng)優(yōu)化，最高細胞培養(yǎng)密度從2.2×106cells/mL提高到4.1×106cells/mL，抗體的表達量從84 mg/L提高到168 mg/L。

4)5 L生物反應(yīng)器的實驗結(jié)果顯示，細胞最終抗體濃度可達到240 mg/mL，較搖瓶產(chǎn)量有所提高。

5)采用的親和分離純化工藝為洗脫液pH 4.0，上清和平衡液中加入2 mol/L NaCl。

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Monoclonal antibodies production by hybridoma cellculture based on mixed medium model

HUANG Ya-jie1,2,ZHU Guang-kai2,LIU Shan2,ZHAO Yong-qiang2,XIE Bo2,LIUDao-jun1

(1.Medical College,Shantou University,Shantou 515041; 2.National Key Laboratory of BiochemicalEngineering,Institute of Process Engineering,Chinese Academy of Science,Beijing 100190,China )

In this study,hybridoma cell was adapted to the mixed medium containing less fetal bovine serum through suspension domestication,and the antibody concentration increased largely.The components of mixed medium were RPM1640：SFM4CHO：OptiCHO(4.5：4.5：1) with 2% FBS and the fed-batch fermentation process was carried out,in which the initial inoculation concentration was 3×105cells/mL,and 3% (initial volume) chemical-defined feed medium was added every other day during cultivation.The antibody concentration increased to 168 mg/L from 84 mg/L.The hybridoma cells were further cultured in a 5 L stirred-bioreactor,and the products were purified by protein A affinity chromatography and the purified antibody concentration was 240 mg/L.

hybridoma cell culture; monoclonal antibody; suspension domestication; affinity chromatography

2016-02-26；

2016-03-10

收稿日期：國家863課題資助(2012AA02A406)

黃亞杰，碩士，研究方向生物制藥，E-mail: 1848836411@qq.com

謝 波，博士，研究方向生物制藥，E-mail: bxie@ipe.ac.cn；劉道軍，研究員，研究方向生物醫(yī)用高分子材料，E-mail: liudj@stu.edu.cn

10.3969/j.issn.2095-1736.2016.06.104

R392

B

2095-1736(2016)06-0104-06