基于適配體識別-雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)可視化檢測金黃色葡萄球菌

盧春霞，王昌烜，黃巧，陳霞，李紅敏，付家莉，張?jiān)萍t，王雙慧

1(長江師范學(xué)院 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院，重慶，408100)2(蘇州賽飛福德檢測科技有限公司，江蘇 蘇州，215100)3(新疆農(nóng)墾科學(xué)院,分析測試中心，新疆 石河子，832000)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)簡稱金葡菌，屬革蘭氏陽性菌，廣泛分布于自然界，是一種常見的食源性致病菌，常污染肉類、蛋類和乳類等食品，部分菌株產(chǎn)生的金黃色葡萄球菌腸毒素(staphylococcal enterotoxins，SEs)是引起食物中毒的主要致病因子[1]，對公共健康和食品安全帶來巨大威脅。有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，2015年中國大陸由金葡菌引起的食源性疾病占12.6%，僅次于溶血性弧菌和沙門氏菌，是造成食源性疾病的第三大致病菌[2]。鑒于金葡菌的危害，我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)[3]規(guī)定金葡菌的可接受水平和最高安全限量值分別為100、1 000 CFU/g(mL)。因此，如何快速靈敏地檢出金葡菌是預(yù)防食源性疾病的關(guān)鍵技術(shù)和先決條件。

目前，傳統(tǒng)的金葡菌的檢測方法主要包括微生物培養(yǎng)法[3]、分子生物學(xué)檢測方法[4]和免疫分析技術(shù)[5]。微生物培養(yǎng)法是金標(biāo)方法，但該法操作步驟復(fù)雜，耗時(shí)較長(3～5 d)，無法滿足現(xiàn)場快速檢測及批量樣品初篩的需要。分子生物學(xué)檢測技術(shù)靈敏度較高，但該法需要精密儀器和專業(yè)的技術(shù)人員?；诳贵w技術(shù)的免疫學(xué)檢測方法具有簡便、快速等特點(diǎn)，是目前金葡菌常用的快速檢測技術(shù)，市售商品以ELISA試劑盒和試紙條為主，但該類方法需要免疫動物，抗體制備成本較高。

近些年，核酸適配體(aptamer)以制備簡單、生產(chǎn)成本低、應(yīng)用范圍廣、易于修飾和標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)，作為一種新型識別分子廣泛應(yīng)用于食品安全[6]、環(huán)境分析[7]和臨床診斷[8]等領(lǐng)域。在金葡菌檢測方面，目前已篩選出多條識別金葡菌的核酸適配體[9-10]。隨后人們利用這些適配體，結(jié)合納米材料及化學(xué)發(fā)光等技術(shù)，建立了包括比色傳感[11]、熒光傳感[12]、拉曼生物傳感[13]、電化學(xué)傳感[14]等各種生物傳感檢測技術(shù)。本團(tuán)隊(duì)在基于適配體的食源性致病菌檢測領(lǐng)域也做了較多研究[15-16]。

在眾多快速檢測方法中，可視化檢測方法具有簡單、便攜、檢測結(jié)果直觀等優(yōu)點(diǎn)而顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢。但食品樣品通常成分復(fù)雜、干擾大，基質(zhì)效應(yīng)可能影響檢測靈敏度。為實(shí)現(xiàn)對靶標(biāo)的高靈敏檢測，可借助一些信號放大技術(shù)以提高檢測靈敏度。其中，雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(hybridization chain reaction，HCR)作為一種生物放大技術(shù)近年來引起了人們的廣泛關(guān)注。HCR是一種自組裝信號放大的技術(shù)，在常溫下即可進(jìn)行，不需要酶參與，同時(shí)，HCR對外部條件要求簡單，不需要專業(yè)儀器，且輸出信號多樣化。因此，HCR作為一種簡單、有效的新型信號放大策略在分析檢測領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[17]。但目前尚未見到基于適配體和HCR信號放大的金葡菌檢測研究報(bào)道。

因此，本研究基于金葡菌現(xiàn)有檢測技術(shù)的不足，以其適配體為識別分子，建立了一種簡便靈敏的檢測新方法。通過生物素-親和素作用，將生物素-適配體1固定在酶標(biāo)板表面，依次加入靶標(biāo)和檢測探針(含有引發(fā)鏈和適配體2)，在酶標(biāo)板表面形成適配體1/靶標(biāo)/檢測探針夾心復(fù)合物。然后加入生物素-發(fā)夾DNA，約定俗成引發(fā)HCR反應(yīng)，使帶有生物素的發(fā)夾DNA在酶標(biāo)板表面“生長”形成dsDNA長鏈。然后將鏈霉親和素-辣根過氧化物酶(streptavidin-horseradish peroxidase，SA-HRP)標(biāo)記在dsDNA每個節(jié)點(diǎn)上，通過HRP催化3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(tetramethylbenzidine，TMB)顯色實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)的定性及定量檢測。本方法結(jié)合了HCR和酶催化顯色雙重信號放大策略，更大限度地提高了檢測靈敏度，為食品中金葡菌快速檢測提供新的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

金黃色葡萄球菌(S.aureus)ATCC6538、金黃色葡萄球菌ATCC29213、大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)O157:H7 ATCC25922、單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)ATCC19155、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)ATCC14028、阪崎腸桿菌(Bntorobatersakazakii)ATCC29544等菌株由新疆農(nóng)墾科學(xué)院分析測試中心提供。

牛血清白蛋白 (bovine serum albumin, BSA)、吐溫-20(Tween-20)、SA-HRP、三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)、TMB顯色試劑盒,生物工程(上海)股份有限公司；NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、CaCl2、MgCl2·6H2O(分析純),國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鏈霉親和素包被的酶標(biāo)板,蘇州海貍生物醫(yī)學(xué)工程有限公司；禽肉、乳制品,本地超市。

本研究中所用的核酸適配體、檢測探針及發(fā)夾DNA由生物工程(上海)股份有限公司合成并純化，其堿基序列詳見表1。

表1 適配體及發(fā)夾DNA序列Table 1 Sequences of the aptamer and hairpin DNA

1.2 儀器與設(shè)備

Thermo ScientificTMVarioskan Flash全波長掃描式多功能讀數(shù)儀，美國賽默飛公司；5MX 96孔板混勻儀，美國賽洛捷克公司；424R臺式冷凍離心機(jī)，德國艾本德公司；BSD-100培養(yǎng)箱，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；UV-280紫外可見分光光度計(jì)，尤尼柯(上海)儀器有限公司；Milli-Q Reference超純水系統(tǒng)，美國密理博公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌懸液的制備

將各種食源性致病菌分別接種到LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，使其菌懸液的光密度值達(dá)到1.0(OD600nm=0.1，菌落數(shù)約1.0×109CFU/mL)，用生理鹽水將其10倍系列稀釋，然后通過平板計(jì)數(shù)法定量計(jì)算菌落數(shù)。菌懸液于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 基于適配體-HCR檢測金葡菌方法的建立

SA-酶標(biāo)板使用之前用PBST(10 mmol/L PBS，0.05% Tween-20)洗滌。加入100 μL 生物素化適配體1(60 nmol/L)，溫育30 min，PBST洗滌。每孔加入200 μL的10 g/L BSA封閉液，室溫封閉4 h，PBST洗滌。加入100 μL待測樣品或一定濃度的金葡菌溶液，室溫孵育30 min，PBST洗滌。加入100 μL檢測探針(80 nmol/L)，室溫孵育30 min，PBST洗滌。bio-H1和bio-H2使用前95 ℃加熱5 min，室溫冷卻，各取50 μL至反應(yīng)孔中，室溫雜交反應(yīng)60 min，PBST洗滌。然后加入100 μL SA-HRP溶液(體積比1∶40 000)，室溫反應(yīng)10 min，PBST洗滌后加入100 μL TMB顯色液，避光顯色5～7 min。加入100 μL 終止液終止反應(yīng)，通過顏色變化定性檢測金葡菌，并在450 nm處測其吸光度。每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系為適配體篩選緩沖液(20 mmol/L Tris、100 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、1 mmol/L CaCl2、1 mmol/L MgCl2·6H2O，pH 7.4)[9]。

1.3.3 檢測性能評價(jià)

1.3.3.1 線性范圍、檢測限

在優(yōu)化條對下，用篩選緩沖溶液分別將金葡菌稀釋成系列梯度濃度的工作液，采用建立的方法對其進(jìn)行測定，以不同金葡菌濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以各濃度對應(yīng)的OD450nm值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對其進(jìn)行進(jìn)行線性擬合，求得線性方程和相關(guān)系數(shù)。每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3.2 特異性分析

采用建立的方法分別檢測相同濃度(1×104CFU/mL)的金葡菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌、阪崎桿菌，同時(shí)設(shè)置空白對照，以分析方法的特異性。

1.3.3.3 方法的應(yīng)用

采用對空白樣品加標(biāo)實(shí)驗(yàn)考察本方法的準(zhǔn)確性。參照GB 4789.10—2016對樣品進(jìn)行前處理[18]，稱取25 g樣品置于盛有225 mL生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，用拍擊式均質(zhì)器拍打1～2 min，用篩選緩沖液稀釋成1∶10的樣品勻液。取100 μL樣品勻液，分別加入不同濃度的金葡菌，按照上述建立的檢測方法進(jìn)行檢測，計(jì)算樣品中金葡菌的含量、加標(biāo)回收率，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation, RSD)。同時(shí)采用國標(biāo)法[18]進(jìn)行檢測，將檢測結(jié)果對比分析，評價(jià)方法準(zhǔn)確性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差方式表示，采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)方法分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，顯著性水準(zhǔn)為P=0.05[19]，使用Origin 8.5 軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測條件優(yōu)化

2.1.1 適配體1及檢測探針濃度

生物素化適配體1的包被濃度及檢測探針濃度對檢測靈敏度有較大影響。本實(shí)驗(yàn)使用過量的發(fā)夾DNA(100 nmol/L)和SA-HRP(稀釋體積比1∶20 000)，適配體與靶標(biāo)反應(yīng)時(shí)間40 min，HCR雜交時(shí)間2 h，金葡菌檢測濃度為104CFU /mL，考察了不同適配體1包被濃度(10～200 nmol/L)和檢測探針濃度(10～320 nmol/L)對檢測靈敏度的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，隨著適配體1及檢測探針濃度的增加，吸光值逐漸增加，意味著結(jié)合金葡菌的數(shù)量也逐漸增加，當(dāng)兩者濃度分別超過60、80 nmol/L后，吸光值變化趨于平緩(P>0.05)。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)適配體1包被濃度和檢測探針濃度分別選擇60、80 nmol/L。

a-適配體；b-檢測探針圖1 適配體1和檢測探針濃度對檢測性能的影響Fig.1 Effect of concentration of aptamers 1 and detection probe on the detection performance注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.1.2 封閉條件

在酶聯(lián)適配體分析中，封閉酶標(biāo)板上多余結(jié)合位點(diǎn)，降低SA-HRP非特異性吸附較為關(guān)鍵[20]。本實(shí)驗(yàn)固定在適配體1包被濃度60 nmol/L，采用BSA封閉后直接加入SA-HRP(體積比1∶20 000)，觀察BSA封閉濃度和封閉時(shí)間對SA-HRP非特異性吸附的影響。結(jié)果顯示(圖2)，當(dāng)BSA封閉質(zhì)量濃度<5 g/L，吸光值較高，封閉不完全；隨著BSA濃度的進(jìn)一步增加，吸光值逐漸下降，說明SA-HRP非特異性吸附逐漸降低，當(dāng)BSA質(zhì)量濃度>10 g/L后，吸光值變化不顯著(P>0.05)。另外，非特異性吸附隨著封閉時(shí)間的延長而降低，當(dāng)10 g/L BSA封閉時(shí)間超過4 h后，吸光值無明顯變化(P>0.05)。綜上分析，選擇10 g/L BSA封閉4 h。

圖2 不同封閉條件對SA-HRP非特異性吸附的影響Fig.2 The influence of different blocking conditions on non-specific adsorption of SA-HRP注：小寫字母表示同一時(shí)間下不同BSA濃度組間顯著性分析，大寫字母表示同一BSA濃度下不同封閉時(shí)間組間顯著性分析

2.1.3 適配體與靶標(biāo)結(jié)合時(shí)間

為保證靶標(biāo)與適配體充分結(jié)合，本實(shí)驗(yàn)固定以上優(yōu)化條件，考察了適配體1及檢測探針與靶標(biāo)的結(jié)合時(shí)間對檢測性能的影響。結(jié)果如圖3所示，吸光值隨著結(jié)合時(shí)間的增加而增大，當(dāng)結(jié)合時(shí)間超過30 min后，反應(yīng)基本達(dá)到飽和狀態(tài)，吸光值無明顯變化(P>0.05)。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇結(jié)合時(shí)間為30 min。

2.1.4 發(fā)夾DNA(H1、H2)濃度及雜交時(shí)間

在HCR反應(yīng)中，H1與H2通過互補(bǔ)錯位雜交而參與反應(yīng)，因此一般兩者反應(yīng)濃度比為1∶1。不同發(fā)夾DNA濃度對檢測性能的影響如圖4所示，吸光值隨著發(fā)夾DNA濃度增加而增大。當(dāng)H1和H2濃度均達(dá)到80 nmol/L后，吸光值變化不顯著(P>0.05)，可能是H1和H2濃度太大產(chǎn)生了空間位阻，導(dǎo)致雜交鏈的形成受到了影響。

a-適配體1；b-檢測探針圖3 適配體與靶標(biāo)結(jié)合時(shí)間對檢測性能的影響Fig.3 The effect of incubation time between S.aureus aptameron the detection performance

固定以上實(shí)驗(yàn)條件，研究H1和H2雜交時(shí)間對檢測性能的影響。結(jié)果如圖4所示，隨著雜交時(shí)間的延長，吸光值逐漸增加，當(dāng)時(shí)間達(dá)到60 min后，吸光值沒有顯著變化(P>0.05)，說明雜交反應(yīng)60 min左右基本達(dá)到飽和狀態(tài)。因此，H1和H2最佳反應(yīng)濃度均為80 nmol/L，雜交時(shí)間選擇60 min。

a-H1和H2濃度；b-HCR雜交時(shí)間圖4 發(fā)夾探針(H1和H2)濃度及雜交時(shí)間對檢測性能的影響Fig.4 Effect of concentration and hybridization time of hairpin probe (HP1, HP2)on detection performance

2.1.5 SA-HRP濃度

SA-HRP是顯色反應(yīng)的關(guān)鍵因素，SA-HRP 濃度過高易引起非特異性吸附，濃度過低則顯色反應(yīng)不充分。本研究固定以上實(shí)驗(yàn)條件，考察SA-HPR不同稀釋體積比(1∶10 000～1∶100 000)對檢測性能的影響。結(jié)果如圖5所示，SA-HRP稀釋比例在1∶10 000～1∶40 000時(shí)，吸光值變化不顯著(P>0.05)，隨著稀釋比例進(jìn)一步增大，與實(shí)驗(yàn)組1∶10 000和1∶20 000相比，吸光值顯著降低(P<0.05)。故選擇SA-HRP稀釋比例為1∶40 000。

2.2 檢測性能評價(jià)

圖5 SA-HRP濃度對檢測性能的影響Fig.5 The effect of SA-HRP concentration on the detection performance

2.2.1 檢測限、線性范圍的確定

在優(yōu)化條件下測定不同濃度的金葡菌(0、5、10、100、500、1 000、10 000、100 000 CFU/mL)。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6所示，反應(yīng)溶液吸光值隨著金葡菌濃度的增加而增大，吸光值強(qiáng)度在101～105CFU/mL呈良好線性關(guān)系，線性方程為y=0.140+0.497x，相關(guān)系數(shù)(R)為0.992。同時(shí)溶液顏色的變化與吸光值呈正相關(guān)，當(dāng)金葡菌濃度為10 CFU/mL時(shí)，溶液顯色較明顯，故本方法可視化檢測限為10 CFU/mL。結(jié)果表明本方法具有高的靈敏度，完全可滿足食品中金葡菌限量值的檢測要求。

圖6 金葡菌濃度與吸光值(450 nm)的線性關(guān)系Fig.6 The plots of the absorbance versus at 450 nm versus S.aureus concentration

2.2.2 特異性分析

采用本方法檢測同等濃度的金葡菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌等致病菌，同時(shí)設(shè)置空白對照，以評估本方法的特異性。結(jié)果如圖7所示，其余幾種致病菌引起的吸光值與空白對照組相近，說明適配體與其余致病菌無交叉反應(yīng)，本方法具有高的特異性。

圖7 特異性分析Fig.7 Specificity analysis

2.2.3 方法的應(yīng)用

通過加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)將本方法應(yīng)用于實(shí)際樣品檢測，檢測結(jié)果與國標(biāo)法[18]對比驗(yàn)證。結(jié)果如表2所示，兩種方法的檢測結(jié)果沒有明顯差異(P>0.05)，本方法加標(biāo)回收率為91.8%～98.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差<6%，表明檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠實(shí)。

表2 加標(biāo)回收率(n=3)Table 2 Recovery rates of S.aureus in spiked foods

2.2.4 方法的比較

與基于適配體的其他快速檢測方法相比(表3)，本方法具有高靈敏度、高準(zhǔn)確性、操作簡單、檢測結(jié)果直觀等優(yōu)點(diǎn)。與電化學(xué)、拉曼生物傳感及壓電傳感檢測方法相比，本方法不需修飾電極，不需特殊專業(yè)設(shè)備。與基于納米材料的比色法和熒光法比較，不需制備納米材料和對適配體進(jìn)行功能化修飾。與抗原-抗體識別原理的免疫分析技術(shù)相比，本方法具有識別分子易獲得、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，可極大降低檢測成本。

表3 金黃色葡萄球菌檢測方法比較Table 3 Comparison of analytical performance of the proposed methods for the detection of S.aureus

3 結(jié)論

本研究以金黃色葡萄球菌適配體為識別分子，結(jié)合HCR信號放大策略，建立了一種高靈敏、高通量的金黃色葡萄球菌快速檢測新方法。在優(yōu)化條件下，金黃色葡萄球菌的檢測線性范圍為101～105CFU/mL，可視化檢測限為10 CFU/mL，在雞肉和牛乳中加標(biāo)回收率達(dá)到91.8%～98.2%，檢測結(jié)果與國標(biāo)方法無顯著差異。本方法前處理簡單，樣品不需要增菌，檢測靈敏度高，成本較低，更有利于現(xiàn)場檢測，對于其他食源性致病及目標(biāo)物的檢測具有一定的借鑒和參考價(jià)值。