QuEChERS/超高效液相色譜-串聯質譜法測定大黃魚中非法染料硫代黃素

趙慧男，鄭文靜，孫珊珊，王明棟，薛霞，王駿，祝建華，劉艷明*，張艷俠*

1(山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南，250101)2(山東省食品藥品安全檢測工程技術研究中心，山東 濟南，250101)

大黃魚中含有豐富的微量元素、蛋白質和維生素[1-2]，備受消費者的喜愛和關注。因其保鮮期短、產量低、價格高，有不法商販向“偽黃魚”或品質差的黃魚中添加硫代黃素等黃色化工染料冒充新鮮黃魚，“染色黃魚”問題經常曝出。硫代黃素，又名堿性黃1和硫磺素T，為芳香胺類堿性工業(yè)染料，常用于生物組織學染色等工業(yè)領域。《食品中可能違法添加的非食用物質和易濫用的食品添加劑品種名單(第五批)》[3]規(guī)定硫代黃素不能作為食品添加劑使用，指出其可能存在的食品種類為大黃魚，長期過量食用將對人體腎臟、肝臟造成損害甚至致癌。目前，大黃魚中硫代黃素的檢測無相關國家或行業(yè)標準，硫代黃素的相關檢測方法鮮有報道，亦沒有大黃魚中硫代黃素LC-MS/MS的檢測方法，為了有效的監(jiān)控大黃魚中硫代黃素的非法添加，建立快速準確的相關檢測方法尤為必要。

文獻報道中關于工業(yè)染料的檢測方法主要有分光光度法[4-5]、酶聯免疫吸附法[6-7]、液相色譜法[8-10]和液相色譜-串聯質譜法[11-13]等。其中分光光度法操作簡單，但在面對復雜基質時需要繁瑣的前處理過程，且特異性低。酶聯免疫吸附法無需貴重儀器，檢測成本低，但目前制備高質量特異性抗體比較困難，限制了其使用。液相色譜法能夠準確定量，獲得廣泛應用，但靈敏度低，且分析時間長，其僅采用保留時間進行定性易產生假陽性結果；液相色譜-串聯質譜法能夠在一定程度上排除基質干擾，靈敏度高、選擇性好，很適合復雜基質中目標物的痕量檢測。大黃魚肉中含有大量的脂肪、蛋白質、碳水化合物等物質，成分復雜，提取和凈化困難，常見前處理技術有液液萃取法[14]、固相萃取法[15-16]、QuEChERS方法[17-20]等，前2種方法存在前處理過程復雜、耗時長、效率低等問題。QuEChERS方法作為農藥殘留檢測較為成熟的前處理方法，具有快速、簡單、高效、可靠和安全等優(yōu)點，已被廣泛用于獸藥殘留、非法添加等成分的檢測。

本研究采用改良的QuEChERS方法結合超高效液相色譜-串聯質譜(ultra performance liquid chromatography-MS/MS，UPLC-MS/MS)檢測大黃魚中硫代黃素含量。本方法凈化步驟簡單、快速高效、靈敏度高，填補了國內UPLC-MS/MS法測定大黃魚中硫代黃素含量的技術空白，為水產品質量安全監(jiān)控提供了新的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent1290 InfinityⅡ液相色譜系統(tǒng)和Agilent 6470三重四極桿液質聯用系統(tǒng)，美國Agilent公司；AB204-S型電子天平，瑞士Mettler Toledo公司；SB-800DTD 型超聲波清洗器，中國寧波新芝生物科技股份有限公司；3-18K型冷凍離心機，德國Sigma公司；Milli-Q純水系統(tǒng)，美國Millipore公司；渦旋混合器，德國IKA公司。

硫代黃素標準品(純度95.9%)，天津阿爾塔科技有限公司；甲醇、乙腈(HPLC級，純度>99.9%)，德國Merck公司；DisQuE凈化包[900 mg無水硫酸鎂(MgSO4)、150 mgN-丙基乙二胺吸附劑(primary secondary amine，PSA)、150 mg十八烷基鍵合硅膠吸附劑(C18)]，美國Waters公司；實驗所用大黃魚樣品，市售。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制

準確稱取硫代黃素標準物質10.00 mg(精確至0.01 mg)，用乙腈溶解并定容至10 mL，配制成標準儲備液(1 mg/mL)，置于棕色玻璃瓶中，于冰箱-18 ℃冷凍保存。移取標準儲備液，用乙腈稀釋至適當濃度，得到標準工作液，于-18 ℃冷凍保存。

1.2.2 樣品前處理

提?。悍Q取2.000 g均勻樣品(準確至0.001 g)，置于50 mL離心管中，加入10 mL 80%(體積分數)乙腈水溶液，渦旋2 min，超聲提取10 min，加入2 g NaCl渦旋，以8 000 r/min離心5 min,取上清液備用；用10 mL 80%乙腈水溶液(8∶2，體積比)重復提取1次，合并上清液，待凈化。

凈化：移取上清液4 mL，加入裝有200 mg無水硫酸鎂、50 mg PSA吸附劑、50 mg C18吸附劑的15 mL的離心管中，渦旋混合1 min，8 000 r/min離心5 min，上清液經微孔濾膜過濾，待測。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：Waters BEHC18柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流動相：0.1%(體積分數)甲酸水溶液(A)和乙腈(B)；柱溫：40 ℃；進樣體積：1 μL；流速：0.30 mL/min；梯度洗脫程序：0～0.5 min，5% B;0.5～3.5 min，5% B～90% B;3.5～5.0 min，保持90%B;5.0～5.1 min，90% B～5% B;5.1～6.0 min，保持5% B。

1.2.4 質譜條件

離子源：電噴霧離子源;離子化模式：正離子模式；監(jiān)測方式：多反應監(jiān)測(multiple reaction monitoring，MRM)；干燥氣溫度：250 ℃；干燥氣速度：5 L/min；鞘氣溫度：350 ℃；鞘氣流速：11 L/min；毛細管電壓：4 000 V；硫代黃素的定性離子對、定量離子對及其他質譜參數見表1。

表1 硫代黃素的質譜參考條件Table 1 Optimized parameters of MS/MS for thioflavine T

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

分別采用Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)、Waters BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)、Waters HSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)3種不同保留性能的色譜柱進行測定。發(fā)現硫代黃素在3種色譜柱上均能有效分配和分離，HSS T3保留性能過強，硫代黃素峰型拖尾。色譜柱越長溶劑損耗越多，分析時間延長，綜合考慮分離效果和效率，2種50 mm C18色譜柱均能夠滿足分析，本研究采用Waters BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)完成實驗。

2.1.2 流動相的選擇

在優(yōu)化的質譜條件下，考察不同流動相對目標物質譜信號的影響。分別考察甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.1%甲酸/乙酸銨等作為流動相對目標物的影響，結果發(fā)現甲醇、乙腈作為有機相，目標物響應相當，但考慮乙腈為強洗脫溶劑，對消除非法染料在色譜體系的殘留較好，選擇乙腈作為有機相。純水作為流動相時，硫代黃素拖尾嚴重，峰型較差。在水相中加入0.1%甲酸后，峰形變好，且響應增高，能夠滿足定量需求。此外，水相中加入乙酸銨后，目標物響應明顯降低，因此最終選擇乙腈-0.1%甲酸水作為流動相。

2.2 質譜條件的優(yōu)化

A-二級質譜圖；B-可能裂解途徑圖1 硫黃素T二級質譜圖及可能裂解途徑Fig.1 The spectra of daughter ions scanning and fragmentation pathways of thioflavine T

2.3 前處理條件的優(yōu)化

2.3.1 提取條件的優(yōu)化

本實驗分別考察了乙腈、甲醇、純水作為提取溶劑對目標物的提取效率，結果顯示純水作為提取溶劑，目標物的回收率約為20%，且提取液渾濁，樣品凈化困難。甲醇與乙腈提取效率均能達到90%，考慮乙腈具有更好的沉淀蛋白質的作用，并且其帶出的弱極性成分少，質譜響應高、基質干擾小，因而選用乙腈作為主要提取溶劑?？紤]到純乙腈易使蛋白質快速凝結成團，提取液中加入一定比例水相會提高樣品分散程度，有利于樣品中目標物的提取。因此本實驗比較了不同體積分數乙腈水溶液的提取效果，結果如圖2所示，80%乙腈水溶液作為提取劑時目標物的回收率最高，而提取溶劑為50%乙腈水溶液時回收率增幅開始下降。分析原因可能為隨水的比例增加，提取液變渾濁，基質效應(matrix effect，ME)變大。經80%乙腈水溶液提取后，蛋白沉淀效果好，提取液較澄清，回收率高，因此選擇80%乙腈水溶液作為提取溶劑。

圖2 不同體積分數乙腈水溶液對提取效率的影響Fig.2 Effect of different proportions of acetonitrile aqueous solution on extraction efficiency

實驗進一步對提取體積和次數進行了考察，結果顯示，提取溶劑體積為10、15、20 mL時三者回收率無顯著性差異。用10 mL乙腈水溶液提取2次時的回收率升高，繼續(xù)增加提取次數，回收率無明顯差異，因此選擇用10 mL提取溶劑對目標物提取2次。

2.3.2 凈化方式的選擇

大黃魚作為優(yōu)質水產品，基質化學成分復雜，含有大量的脂肪、蛋白質、碳水化合物等，本實驗采用新型通過式固相萃取柱PRiME HLB和QuEChERs方法對目標物進行凈化，結果顯示，PRiME HLB對目標物有一定的吸附作用，需要進行進一步的洗脫，而采取乙腈進行洗脫會將色譜柱中保留的磷脂等干擾物重新洗脫下來，影響凈化效果，因此該方法不適用于目標物的凈化。QuEChERs方法常用的吸附劑有PSA、C18、石墨化碳黑(graphitized carbon black，GCB)等，其中GCB易對色素成分有吸附，而PSA對大黃魚基質中脂肪酸、碳水化合物以及甾醇等極性干擾物有凈化效果，C18可以去除脂肪和脂類等非極性干擾物。因此本實驗選擇PSA和C18作為優(yōu)化吸附劑，凈化過程中水分含量會影響PSA的凈化效果，選用無水硫酸鎂來除水。首先采用成品凈化包(PSA 150 mg+C18150 mg+無水MgSO4900 mg)對提取液進行預實驗，結果回收率能夠滿足要求。為更好地提高凈化效果，進一步對QuEChERS方法中吸附劑用量進行優(yōu)化，首先對無水硫酸鎂用量進行優(yōu)化。如圖3所示，吸附劑中無水硫酸鎂用量為200、500、900 mg時，回收率均在90%以上，200 mg時回收率最高，高于未加入時的數值。無水硫酸鎂用量超過200 mg后回收率有下降趨勢，當無水硫酸鎂用量在1 500 mg時回收率明顯降低,原因可能為無水硫酸鎂過多吸附少量目標物質，且無水硫酸鎂用量越多所需待凈化溶劑越多。因此選擇在吸附劑中加入200 mg無水硫酸鎂。

圖3 無水硫酸鎂用量對回收率的影響Fig.3 Effect of anhydrous magnesium sulfate content on recovery rate

對PSA和C18用量進行優(yōu)化，兩者用量設置相同，用量為50、100、150 mg時回收率均高于90%，用量為300 mg時回收率降低，如圖4所示。綜合考慮回收率和實驗成本，本方法選擇PSA和C18用量均為50 mg。

圖4 PSA和C18用量對回收率的影響Fig.4 Effect of PSA and C18 content on recovery rate

2.3.3 濃縮過程的考察

對痕量物質的檢測，氮吹濃縮是常見提高目標物分析靈敏度或置換溶劑的常見手段。以空白樣品加標為例，考察了氮吹濃縮對方法回收率的影響。結果顯示，氮吹濃縮之前，硫代黃素回收率為95.2%，氮吹濃縮后硫代黃素回收率為80.1%，明顯低于氮吹濃縮之前，原因可能為氮吹過程中目標物發(fā)生了損失。兼顧方法的靈敏度與準確性，本方法不進行氮吹富集。

2.4 線性范圍、相關系數及定量限(limit of quantitation，LOQ)

2.4.1 方法的線性范圍

用純乙腈配制硫代黃素系列標準溶液，質量濃度分別為0.5、2.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL。將標準溶液按濃度從低到高依次經液相色譜-串聯質譜條件進行測定，根據質量濃度與色譜峰面積響應繪制標準曲線和計算回歸方程及其相關系數。結果表明,硫代黃素質量濃度為0.5～50.0 ng/mL時，濃度與其峰面積呈良好的線性關系，線性方程為Y=3 660.332X+837.035，其相關系數(r)大于0.998。采用空白基質加標的方法，以信噪比S/N=10得到目標物的LOQ為5.0 μg/kg，以信噪比S/N=3得到目標物的檢出限為2.0 μg/kg。硫代黃素標準溶液和樣品加標溶液總離子流和特征離子質量色譜圖如圖5所示。

A-標準溶液(2 ng/mL)；B-樣品加標溶液(20.0 μg/kg)圖5 硫代黃素標準溶液和樣品加標溶液的總離子流和提取離子流色譜圖Fig.5 Extracted ion current chromatograms of thioflavine T in the standard solution

2.4.2 方法回收率和精密度

稱取大黃魚陰性樣品加入硫代黃素標準溶液，得到低、中、高3水平濃度為5.0、20.0和100.0 μg/kg的加標樣品，按照本方法對大黃魚樣品中的硫代黃素進行6次測定，回收率在94.1%～99.2%，相對標準偏差為0.53%～1.60%時，符合重復性試驗對相對標準偏差的要求，結果如表2所示。

表2 大黃魚中硫代黃素回收率及精密度(RSD)(n=6)Table 2 Recoveries and RSDs of thioflavine T in Larimichthys crocea (n=6)

2.4.3 ME的考察

本方法分別測定了空白樣品處理液與純溶劑中添加同水平目標成分的響應值，計算二者的相對比值來評價ME。ME計算如公式(1)所示：

(1)

式中：ME為負值表示存在基質抑制效應，為正值表示存在基質增強效應，0為無ME，絕對值越大表示ME越強。結果顯示，本方法中硫代黃素的ME為2.1%～10.2%時，ME影響不明顯，因此采用純溶劑標準溶液進行定量。

2.5 實際樣品測定

應用所建立的方法對市售20批次大黃魚樣品進行測定，結果均未檢出硫代黃素。

3 結論

本文通過優(yōu)化儀器條件及前處理條件，建立了改進QuEChERS方法結合UPLC-MS/MS測定大黃魚中硫代黃素殘留的分析方法。該方法簡單、快速、靈敏度高，定性定量準確，適用于大黃魚中硫代黃素的檢測,填補了國內UPLC-MS/MS法測定大黃魚中硫代黃素含量的技術空白，為檢驗標準的建立提供技術參考，有助力于市場監(jiān)管部門對硫代黃素非法添加的有效監(jiān)管。