活性氧（ROS）依賴性抗腫瘤藥物的研究進(jìn)展

鄭坤，嘎魯，馬宇衡，楊慧，趙巖，羅慧

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110）

在研究腫瘤的過程中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）可參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長、增殖和凋亡[1]。而與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞處于高水平ROS環(huán)境中，更易發(fā)生氧化應(yīng)激等反應(yīng)從而引發(fā)凋亡。因此根據(jù)ROS的生物學(xué)作用，已開發(fā)了許多基于ROS調(diào)節(jié)的抗腫瘤藥物，以期通過改變ROS濃度，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡達(dá)到治療腫瘤的效果。

1 ROS的來源與轉(zhuǎn)化

活性氧是一類具有高反應(yīng)活性的含氧物質(zhì)，主要由機(jī)體進(jìn)行氧化還原反應(yīng)所產(chǎn)生。ROS分為自由基型和非自由基型兩類[2]。自由基型ROS主要包括超氧陰離子自由基（·O2·）、羥基自由基（·OH）、過氧自由基（ROO·）和巰基過氧自由基（RSOO·）等；非自由基型ROS主要有過氧化氫（H2O2）、有機(jī)氫過氧化物（ROOH）、臭氧（O3）和單線態(tài)氧（O2

1）等，人體細(xì)胞內(nèi)的ROS通常指的都是H2O2。

線粒體傳遞鏈（ETC）復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ是產(chǎn)生ROS的主要位點(diǎn)[3?4]，ETC將電子從NADH轉(zhuǎn)移給O2進(jìn)而生成·O2·，隨后可經(jīng)超氧化物歧化酶（SOD）快速分解為H2O2；部分·O2·可依賴陰離子通道（VDAC）進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。H2O2又可以被髓過氧化物酶（myeloper‐oxidase,MPO）轉(zhuǎn)變?yōu)楦呋钚缘拇温人幔℉OCl）；在Fe2+和Cu2+作用下，H2O2也可以通過Fentons反應(yīng)轉(zhuǎn)化為OH·。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）中發(fā)生的蛋白折疊過程也伴著ROS的產(chǎn)生，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原酶（Ero1）可轉(zhuǎn)移電子至O2，進(jìn)而產(chǎn)生H2O2。還有許多酶也可以產(chǎn)生ROS。如NADPH氧化酶（NOXs）將電子從NAD（P）H轉(zhuǎn)移至O2以產(chǎn)生ROS[5]；次黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶（XO）的催化下可以將其轉(zhuǎn)化為黃嘌呤，在此過程中，同時(shí)伴隨著O2還原為·O2·；非偶聯(lián)內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endotheli‐al nitric oxide synthase,eNOS）也可產(chǎn)生部分·O2·。其他單胺氧化酶、脂氧合酶和環(huán)氧合酶，在正常的生物反應(yīng)中也可以促進(jìn)ROS的生成。另外，外源性刺激，如壓力應(yīng)激、紫外線輻射、腫瘤化療和放療等也可刺激外源性ROS生成[6]。

為了平衡體內(nèi)過高的ROS水平，機(jī)體啟動(dòng)抗氧化系統(tǒng)，例如，酶系統(tǒng)中谷胱甘肽過氧化物酶（gluta‐thione per?oxidase,GPx）、過氧化氫酶（catalase,CAT）、過氧化物還原酶（peroxiredoxins,Prx）都可將H2O2代謝為H2O和O2[7]，氧化態(tài)的谷胱甘肽和硫氧還蛋白也會(huì)被相應(yīng)的谷胱甘肽還原酶（GR）和硫氧還蛋白還原酶（TrxR）還原[8]。另外，ROS的清除劑還包括維生素C、維生素E等許多抗氧化劑［9］。ROS的來源及轉(zhuǎn)化如圖1所示。

圖1 ROS的來源及轉(zhuǎn)化[10]Figure 1 The origin and transformation of ROS

2 ROS與腫瘤的關(guān)系

ROS對(duì)腫瘤細(xì)胞具有雙重作用（如圖2所示）。一方面，低劑量的ROS可作為第二信使介導(dǎo)細(xì)胞的多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[11]。例如，在腫瘤細(xì)胞中，ROS可參與激活MAPK/ERK信號(hào)通路，之后發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞保護(hù)與增殖作用來應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激，減少細(xì)胞凋亡[12]。H2O2可使抑癌基因PIEN氧化導(dǎo)致失活，失活后會(huì)激活PⅠ3K/AKT信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞增殖并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活[13]。NF?κB是一種能夠誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子，而NF?κB信號(hào)通路中許多蛋白質(zhì)可與ROS反應(yīng)，導(dǎo)致更多的NF?κB因子釋放，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞增殖；ROS還可以激活Keap1?Nrf?ARE信號(hào)通路[14]。

圖2 ROS對(duì)腫瘤細(xì)胞的雙重作用[10]Figure 2 Dual effects of ROSon tumor cells

另一方面，高溶度的ROS促進(jìn)氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，損傷細(xì)胞甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。對(duì)于腫瘤細(xì)胞來說，高濃度的ROS會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)、DNA、脂質(zhì)等氧化損傷[15]，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、自噬。高水平的ROS會(huì)引起線粒體的氧化損傷，其機(jī)制是增加了線粒體膜的通透性，使線粒體表面形成孔洞[16]，孔洞的開放引起線粒體膜電位降低。因此，線粒體會(huì)通過孔洞釋放細(xì)胞色素C以及凋亡誘導(dǎo)因子（AⅠF）進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)而引發(fā)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)使DNA損傷，引起腫瘤細(xì)胞凋亡。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的ROS過多時(shí)，同樣會(huì)刺激死亡受體（FAS）發(fā)生三聚化體，并與死亡因子（FasL）交聯(lián)，激活Fas?FasL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生凋亡[17]。也有研究表明，ROS還會(huì)間接下調(diào)caspase?8抑制蛋白質(zhì)的表達(dá)，使caspase?8分子被激活，隨后被活化的執(zhí)行型caspase分子將引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[18]。細(xì)胞自噬是細(xì)胞進(jìn)行自我保護(hù)的正?，F(xiàn)象，將生長不良的細(xì)胞進(jìn)行瓦解。為了平衡正常機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，過量的ROS將激活細(xì)胞凋亡途徑，并刺激自噬性細(xì)胞死亡。

在檢測(cè)1，4?苯醌對(duì)HL60細(xì)胞的毒性作用中，發(fā)現(xiàn)HL60細(xì)胞中自噬酸性囊泡增多，并檢測(cè)到ROS，表明1，4?苯醌是通過介導(dǎo)ROS的途徑誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬凋亡[19]。作為白血病的治療藥物，臨床上已經(jīng)證明As2O3具有誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的功能，可應(yīng)用于許多惡性腫瘤的治療中[20?22]。砷化合物能夠調(diào)節(jié)硫氧還蛋白（TRX）、NADPH等來影響ROS水平，進(jìn)而控制氧化應(yīng)激反應(yīng)并誘導(dǎo)自噬，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。劉駿達(dá)等[23]在研究中發(fā)現(xiàn)，As2O3可通過抑制人肝癌SMMC?7721細(xì)胞的增殖和提高細(xì)胞內(nèi)ROS水平誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，產(chǎn)生抗腫瘤作用。綜上所述，ROS既可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長，又可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這為基于ROS調(diào)控的腫瘤藥物的開發(fā)提供了策略。

3 基于ROS調(diào)控的抗腫瘤藥物

相比正常細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞長期處于高水平的ROS環(huán)境中，更易發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。根據(jù)腫瘤細(xì)胞特殊的生物學(xué)特征，可以通過干預(yù)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，使其增加ROS的產(chǎn)生、減少ROS的消除而產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，使蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及DNA氧化損傷，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡?；蛘咄ㄟ^提高抗氧化能力使ROS減少，導(dǎo)致環(huán)境不利于腫瘤細(xì)胞的生存，從而達(dá)到治療腫瘤的作用。根據(jù)ROS的產(chǎn)生和消除途徑發(fā)現(xiàn)，線粒體電子傳遞鏈ETC抑制劑、NADPH氧化酶（NOXs）抑制劑、硫氧還蛋白還原酶（TrxR）抑制劑、GSH抑制劑等都可以干預(yù)ROS水平。

3.1 靶向線粒體上調(diào)ROS

由于ROS引起的氧化損傷，會(huì)改變線粒體膜通透性，進(jìn)而引起線粒體釋放細(xì)胞凋亡因子，并發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)使細(xì)胞死亡。因此，靶向線粒體增加ROS的含量是抗腫瘤的有效途徑之一。

維泰醇（alternol）是從云南紫衫樹皮中的微生物菌分離出來的單體化合物，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均有顯著的抑制作用。劉兆喆等[24]研究發(fā)現(xiàn)，維泰醇可以抑制L1210細(xì)胞的生長，增加細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，使細(xì)胞線粒體膜電位改變，并上調(diào)Caspase?3和Caspase?9的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞凋亡。辛伐他汀（simvastatin）是從土曲霉內(nèi)提取得到，主要用于降血脂，近年發(fā)現(xiàn)其可用于治療癌癥。其在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)，線粒體膜電位明顯下降，細(xì)胞色素C釋放和Caspase因子活化，因此推測(cè)辛伐他汀可以通過提高體內(nèi)ROS含量，經(jīng)線粒體凋亡途徑導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡[25]。

魚藤酮（rotenone）是一種從豆薯屬植物中分離得到的異黃酮，被應(yīng)用于植物殺蟲劑，其也是線粒體電子傳遞鏈抑制劑，可使腫瘤細(xì)胞中ROS的含量增加。竺飛燕等[26]發(fā)現(xiàn)，魚藤酮也可引起線粒體膜電位降低，并對(duì)PC12細(xì)胞發(fā)揮出毒性作用，從而誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡。也有文獻(xiàn)報(bào)道rotenone是NADPH氧化酶抑制劑，可阻止ROS的產(chǎn)生，抑制腫瘤的生長。大量研究表明，異硫氰酸苯乙酯（phenethyl isothiocyanate,PEⅠTC）能夠預(yù)防乳腺癌發(fā)生，抑制乳腺腫瘤生長，并誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的死亡。其中，有體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PEⅠTC可以上調(diào)細(xì)胞內(nèi)ROS，使其達(dá)到毒性水平進(jìn)而導(dǎo)致線粒體氧化損傷，最終產(chǎn)生抗腫瘤的作用[27]。

沒食子酸（gallic acid）是從香椿葉片中提取的一種多酚類化合物，可以有效地調(diào)節(jié)體內(nèi)ROS含量，具有抗氧化和促氧化的雙重活性[28]。一方面，沒食子酸可以減少線粒體膜通透性孔洞的形成，并降低SOD酶的活性，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)ROS的含量。另一方面，沒食子酸可以誘導(dǎo)Ca2+釋放和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化應(yīng)激，使ROS含量劇增，從而對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，最終使腫瘤細(xì)胞死亡。雖然沒食子酸具有較強(qiáng)的抗癌活性，但是生物利用度較低，因此根據(jù)沒食子酸鄰苯二酚的結(jié)構(gòu)特征，研究并開發(fā)了衍生物，例如化合物a、化合物b，其具有一定的生物利用度及抗癌活性[29]。以上提及的部分藥物結(jié)構(gòu)如圖3所示。

圖3 靶向線粒體產(chǎn)生ROS的藥物Figure 3 Targeted mitochondria?producing ROSdrugs

3.2 NADPH氧化酶（NOX）抑制劑

NOX是體內(nèi)氧化還原信號(hào)的關(guān)鍵酶，也是體內(nèi)活性氧簇的主要來源。在ROS的產(chǎn)生途徑中，NOX相當(dāng)于電子傳遞鏈，將分子氧還原產(chǎn)生·O2·。NOX是生成ROS的主要酶體[30]，激活NOX能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞中活性氧的水平，從而有效地抑制腫瘤的生長。反之，抑制NOX可抑制H2O2和·O2·介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞增殖作用。Apocynin（acetovanillone）是一種選擇性NADPH氧化酶抑制劑，在前列腺癌的細(xì)胞和小鼠模型中的研究中體現(xiàn)了其具有抗增殖作用，并被證實(shí)是由于apocynin抑制了NADPH氧化酶活性并引起NOX復(fù)合物蛋白R(shí)AC1的去磷酸化，達(dá)到抗增殖作用[31]。Diphenylenei‐odonium chloride（DPⅠ）是NADPH氧化酶抑制劑，同時(shí)也是有效的、不可逆的iNOS/eNOS抑制劑，可以選擇性地抑制細(xì)胞內(nèi)的ROS。在研究DPⅠ的機(jī)制中發(fā)現(xiàn)，DPⅠ通過降低ROS水平和上調(diào)P53/P21蛋白的表達(dá)，抑制腫瘤的生長，最終誘導(dǎo)腫瘤凋亡[32]。VAS2870化合物可以劑量依賴性地抑制大鼠肝癌細(xì)胞的增殖[33]，當(dāng)劑量達(dá)到25μmol/L時(shí)，可以完全阻止ROS的產(chǎn)生。此外，還發(fā)現(xiàn)了大鼠肝癌細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)化因子（TGF?B）等生理刺激誘導(dǎo)的凋亡VAS2870化合物具有促進(jìn)作用，通過抑制NOX可以誘導(dǎo)大鼠肝癌細(xì)胞的凋亡。文中提及的NOX抑制劑結(jié)構(gòu)如圖4所示。

圖4 NADPH氧化酶（NOXs）抑制劑Figure 4 NADPH oxidase（NOXS）inhibitors

3.3 TrxR抑制劑

過氧化物酶（peroxiredoxins,Prxs）是催化H2O2降解為H2O的關(guān)鍵酶。H2O2作為一個(gè)氧化劑，在Prxs清除H2O2的過程中，Prxs自身被氧化變成氧化態(tài)而失活，無活性的氧化態(tài)Prxs被硫氧還蛋白（Trx）催化還原而復(fù)活，同時(shí)Trx自身變成氧化態(tài)而失活，無活性氧化態(tài)Trx在硫氧還蛋白還原酶（TrxR）的作用下恢復(fù)還原態(tài)而復(fù)活，參與H2O2降解為H2O和O2的循環(huán)反應(yīng)[34]。因此，TrxR在維持細(xì)胞內(nèi)H2O2正常水平的氧化還原循環(huán)起著至關(guān)重要的作用。簡而言之，抑制TrxR活性，可以使Trx失活后不能恢復(fù)活性，進(jìn)而導(dǎo)致氧化態(tài)Prxs無活性，最終導(dǎo)致體內(nèi)H2O2不能被大量降解，使體內(nèi)活性氧蓄積。高水平的TrxR能夠降低ROS水平，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)展并阻止腫瘤細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)腫瘤的惡化。反之，抑制TrxR活性可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS水平大幅度升高，超過腫瘤細(xì)胞所能承受的ROS閾值，造成細(xì)胞氧化損傷后通過線粒體途徑凋亡；另外，也可以抑制凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ASK1），最終導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放，并活化含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶caspase?3[35]。因此，抑制TrxR也是抗腫瘤的一種新策略。

胡椒堿（piperlongumine,PL）是一種來自胡椒中的生物堿，在許多癌細(xì)胞中均表現(xiàn)出抗腫瘤活性。PL可以與TrxR相互作用，并抑制其活性，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，隨后導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡或誘導(dǎo)細(xì)胞自噬[36]。Ethaselen也是一種硫氧還蛋白還原酶（TrxR）抑制劑[37]，許多研究表明ethaselen在體內(nèi)外均可以與TrxR相互作用，通過抑制TrxR活性來增加細(xì)胞內(nèi)ROS，強(qiáng)化癌細(xì)胞的應(yīng)激負(fù)擔(dān)，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體功能障礙，誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞凋亡。血根堿（sanguina‐rine）主要存在于加拿大血根和白菜中，已被證明具有廣泛的藥理活性，包括抗高血壓、抗骨質(zhì)疏松和抗微生物活性，也有人認(rèn)為其植物具有抗癌活性，但是作用機(jī)制不明確。近來年，有文獻(xiàn)報(bào)道sanguinarine是一種硫氧還蛋白還原酶抑制劑，通過抑制TrxR活性使細(xì)胞內(nèi)ROS增多，引起氧化應(yīng)激導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡[38]。由于TrxR的C?末端倒數(shù)第2位上的Sec殘基具有高反應(yīng)活性，能與一些金屬離子結(jié)合，因此研究和開發(fā)了大量含金屬離子的配合物作為TrxR抑制劑。例如，金諾芬（auranofin,AF）是最先被報(bào)道的TrxR強(qiáng)效含金抑制劑[39]，TrxR硒半胱氨酸殘基上的硒巰基是其特異性作用靶點(diǎn)。還有許多含邁克爾受體基團(tuán)的天然產(chǎn)物也可作為TrxR抑制劑，例如姜黃素（curcumin），姜黃素對(duì)硒醇以及巰基等親核性基團(tuán)具有很高的反應(yīng)活性，可以與TrxR蛋白C?末端的Cys殘基和Sec殘基產(chǎn)生共價(jià)作用，不可逆地抑制TrxR活性升高細(xì)胞內(nèi)ROS水平，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡[40]。TrxR制劑結(jié)構(gòu)如圖5所示。

圖5 硫氧還蛋白還原酶抑制劑Figure 5 Thioredoxin reductase inhibitors

3.4 GSH抑制劑

當(dāng)機(jī)體內(nèi)的GSH水平升高時(shí)，會(huì)加強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的抗氧化能力，使其免受氧化應(yīng)激損傷，因此消耗GSH可以促進(jìn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。甲萘醌（menadione）是一種用于治療維生素K缺乏病的藥物，后來發(fā)現(xiàn)，甲萘醌可與谷胱甘肽（GSH）的半胱氨基酸殘基形成共價(jià)結(jié)合，消耗體內(nèi)的GSH，提高ROS水平，達(dá)到誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用[41]。丁硫氨酸亞砜［L?buthionine?（S,R）?sulfoximine］也是一種GSH抑制劑，可以通過抑制谷氨酰半胱氨酸連接酶使GSH合成減少，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)的ROS增多引起氧化損傷，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡[42]。也有文獻(xiàn)報(bào)道，異硫氰酸酯類化合物中的異氰酸基團(tuán)可與含有巰基的片段發(fā)生加成反應(yīng)，消耗細(xì)胞內(nèi)的GSH，提高細(xì)胞內(nèi)的ROS水平［43］。圖6顯示了部分消耗GSH的藥物結(jié)構(gòu)。

圖6 谷胱甘肽抑制劑Figure 6 Glutathione inhibitors

4 小結(jié)

ROS是一把雙刃劍，因其作用濃度等條件不同，可產(chǎn)生不同生物學(xué)作用，低濃度ROS促進(jìn)細(xì)胞分裂，高濃度（毒性）ROS誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。針對(duì)不同的腫瘤細(xì)胞，要求的ROS毒性水平也會(huì)不同。以上介紹了靶向線粒體上調(diào)ROS的抗腫瘤藥物以及NADPH氧化酶抑制劑、TrxR抑制劑、GSH抑制劑，均可參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)ROS水平，從而影響ROS在細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)功能，達(dá)到抗腫瘤作用。但是基于ROS調(diào)控的抗腫瘤藥物也有一定的不足，以上介紹的抗腫瘤藥物中，有許多藥物具有其他藥理活性，證明這些藥物作用靶標(biāo)不具有特異性，在治療中可能表現(xiàn)出其他藥理作用，甚至存在不良反應(yīng)等。除此之外，ROS功能較為復(fù)雜，參與機(jī)體內(nèi)多種信號(hào)通路的激活及生理功能，所以基于調(diào)控ROS的抗腫瘤藥物在治療過程中還應(yīng)監(jiān)測(cè)機(jī)體的相關(guān)體征，判斷ROS的抗腫瘤作用。即使如此，ROS在腫瘤的發(fā)展和治療中仍起到關(guān)鍵作用。因此，通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，誘導(dǎo)腫瘤凋亡仍是抗腫瘤的一大策略。