肺癌組織MTA1、VEGF?C表達(dá)變化及與患者臨床病理特征、預(yù)后關(guān)系

趙麗霞，任成波，馬峰，李占林，趙峻峰

（河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院1.腫瘤內(nèi)科；2.放療科；3.中醫(yī)科，河北 張家口 075000）

肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率、死亡率最高的惡性腫瘤，且受空氣污染、煙草流行、人口老齡化等因素影響，其發(fā)病率、死亡率呈上升趨勢(shì)[1]。盡管隨著當(dāng)前基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)及相關(guān)學(xué)科發(fā)展，肺癌診療手段取得一定進(jìn)步，但肺癌患者總體預(yù)后仍不理想，探究肺癌發(fā)生機(jī)制及與肺癌發(fā)展、預(yù)后相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)記物是臨床研究重要方向[2]。轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1（metasta‐sis?associated gene 1，MTA1）蛋白分布于人體多種組織器官，研究認(rèn)為，MTA1為脫乙酰基復(fù)合物的亞單位之一，可通過(guò)介導(dǎo)組蛋白去乙?；?、核小體重構(gòu)過(guò)程參與基因表達(dá)調(diào)控，可能與腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移有關(guān)[3]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C（vascular endothelial growth factor C，VEGF?C）與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子同源，可誘導(dǎo)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移并影響其通透性，還能促進(jìn)微血管形成，被認(rèn)為與腫瘤淋巴管、病理性血管生成關(guān)聯(lián)密切[4]。國(guó)內(nèi)外已有研究指出[5?6]，在多種惡性腫瘤如肝癌、乳腺癌、胃癌、鼻咽癌等組織中可檢出MTA1、VEGF?C過(guò)表達(dá)，二者可能與腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有關(guān)。不過(guò)MTA1、VEGF?C在肺癌中的研究報(bào)道尚不多見，其與肺癌病理類型、預(yù)后等關(guān)系并無(wú)定論。為此，本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肺癌組織MTA1、VEGF?C表達(dá)情況，并分析其與患者臨床病理特征、預(yù)后關(guān)系，旨在為肺癌臨床早期診療及預(yù)后評(píng)估提供新思路?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院2016年1月－2018年9月經(jīng)病理確診的200例肺癌組織標(biāo)本及50例癌旁正常（距腫瘤邊緣＞5 cm）組織標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者均經(jīng)手術(shù)或病理活檢明確原發(fā)性肺癌診斷，且具有明確的腫瘤分期[7]；腫瘤均為單發(fā)；組織標(biāo)本保存完好；年齡35~75歲；均獲取完善臨床病史及隨訪信息。排除標(biāo)準(zhǔn)：復(fù)發(fā)腫瘤病例；合并其他部位原發(fā)性腫瘤；無(wú)足夠可用于免疫組織化學(xué)分析的標(biāo)本；術(shù)前已接受放化療及其他抗腫瘤治療；存在不明原因異常生化指標(biāo)；失訪。200例患者中男149例，女51例；年齡41~75歲，其中＜60歲117例，≥60歲83例；病理類型：腺癌94例，鱗癌79例，小細(xì)胞癌27例；分化程度：低分化癌68例，中分化癌73例，高分化癌59例；TNM分期：Ⅰ期29例，Ⅱ期62例，Ⅲ期84例，Ⅳ期25例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移78例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移122例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或家屬簽署知情同意。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化染色步驟 10%（φ）中性福爾馬林溶液固定標(biāo)本，石蠟包埋，以4μm厚度連續(xù)切片，烤片機(jī)烘烤（58~60℃）60 min；切片經(jīng)二甲苯脫蠟10 min，于梯度酒精脫苯處理后，以蒸餾水沖洗5 min；切片滴加3%H2O2，于室溫下孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，然后蒸餾水沖洗3次，再于PBS液浸泡5 min；切片置于枸櫞酸鹽緩沖液（濃度0.01 mmol/L，pH=6），高溫高壓下修復(fù)10 min，冷卻后用PBS液沖洗3次；加入封閉用正常血清工作液，室溫下封閉15~20 min，傾去，勿洗；滴加稀釋（1∶100）的一抗（羊抗人MTA1多克隆抗體、羊抗人VEGF?C多克隆抗體，均購(gòu)自美國(guó)SANTA CRUZ公司），4℃孵育過(guò)夜，PBS液沖洗3次；滴加二抗工作液（生物素標(biāo)記羊抗兔ⅠgG），室溫孵育15~20 min，PBS液沖洗3次；滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，室溫孵育15~20 min，PBS液沖洗3次；以DAB顯示（顯色劑購(gòu)自福州邁新公司），光鏡下控制顯色程度，行蘇木素復(fù)染；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。陰性對(duì)照以PBS緩沖液代替一抗。

1.2.2 結(jié)果判定 染色結(jié)果由2位工作5年以上病理科醫(yī)師獨(dú)立判斷。MTA1蛋白以細(xì)胞核著色為主，部分細(xì)胞質(zhì)著色，陽(yáng)性顯色為棕黃色；VEGF?C蛋白以細(xì)胞質(zhì)著色為主，呈棕黃色顆粒。每片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，每視野≥100個(gè)細(xì)胞。①染色強(qiáng)度：根據(jù)染色程度，棕黃色、黃色、淺黃色、無(wú)著色分別計(jì)3分、2分、1分、0分；②陽(yáng)性細(xì)胞百分比：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞75%、51%~75%、26%~50%、≤25%、陰性分別計(jì)4分、3分、2分、1分、0分；總積分取兩項(xiàng)乘積，乘積≥3分視為陽(yáng)性表達(dá)。

1.2.3 隨訪 以患者治療后出院為隨訪起點(diǎn)，以腫瘤進(jìn)展為隨訪終點(diǎn)，通過(guò)電話結(jié)合門診復(fù)診隨訪形式，參照實(shí)體瘤療效標(biāo)準(zhǔn)[8]，統(tǒng)計(jì)患者無(wú)進(jìn)展生存期（progression free survival，PFS）（即從治療結(jié)束到腫瘤進(jìn)展時(shí)間）及3年無(wú)進(jìn)展生存率。隨訪時(shí)間截至2021年9月，200例患者隨訪時(shí)長(zhǎng)5~49個(gè)月，平均（18.66±10.32）個(gè)月，中位隨訪時(shí)間16個(gè)月。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0軟件，計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)以[n（%）]描述，采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)法；繪制Kaplan?Meier生存曲線，采用Log?rank檢驗(yàn)比較預(yù)后。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺癌組織及癌旁組織MTA1、VEGF?C表達(dá)比較

MTA1在肺癌組織表達(dá)陽(yáng)性率70.50%，顯著高于癌旁正常組織的26.00%（P＜0.05）；VEGF?C在肺癌組織表達(dá)陽(yáng)性率66.00%，顯著高于癌旁正常組織的42.00%（P＜0.05）。見表1。

表1 肺癌組織及癌旁組織MTA1、VEGF?C表達(dá)比較Table 1 Comparison of MTA1 and VEGF?Cexpression in lung cancer tissues and adjacent tissues [n(%)]

2.2 不同病理類型肺癌組織MTA1、VEGF?C表達(dá)比較

不同病理類型肺癌組織中MTA1、VEGF?C表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 不同病理類型肺癌組織MTA1、VEGF?C表達(dá)比較Table 2 Comparison of MTA1 and VEGF?Cexpression in different pathological types of lung cancer tissues [n(%)]

2.3 MTA1、VEGF?C表達(dá)與患者臨床病理特征關(guān)系

肺癌組織MTA1陽(yáng)性表達(dá)與患者腫瘤分化程度低、TNM分期高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（均為P＜0.05），與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、脈管浸潤(rùn)無(wú)關(guān)（均為P＞0.05）；VEGF?C陽(yáng)性表達(dá)與患者腫瘤分化程度低、TNM分期高、脈管浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（均為P＜0.05），與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑無(wú)關(guān)（均為P＞0.05）。見表3。

表3 MTA1、VEGF?C表達(dá)與患者臨床病理特征關(guān)系Table 3 Relationship between the expression of MTA1 and VEGF?Cand clinicopathological features of patients [n(%)]

2.4 肺癌組織MTA1、VEGF?C表達(dá)相關(guān)性

Spearman相關(guān)性分析顯示，肺癌組織MTA1與VEGF?C表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.01）。見表4。

表4 肺癌組織MTA1、VEGF?C表達(dá)相關(guān)性Table 4 Correlation between the expression of MTA1 and VEGF?Cin lung cancer tissues

2.5 肺癌組織MTA1、VEGF?C表達(dá)與患者預(yù)后關(guān)系

隨訪時(shí)間截至2021年9月，肺癌組織MTA1陽(yáng)性表達(dá)者PFS為（16.22±8.87）月，3年無(wú)進(jìn)展生存率為5.67%，均低于陰性者的（24.49±11.25）月、23.73%（Log?rankχ2=22.522，P＜0.001），見圖1；肺癌組織VEGF?C陽(yáng)性表達(dá)者PFS為（16.99±9.58）月，3年無(wú)進(jìn)展生存率為7.09%，均低于陰性者的（21.90±11.00）月、20.34%（Log?rankχ2=7.762，P=0.005），見圖2。

圖1 肺癌組織MTA1陽(yáng)性表達(dá)與陰性表達(dá)的生存曲線Figure 1 Survival curve of positive and negative expression of MTA1 in lung cancer tissues

圖2 肺癌組織VEGF?C陽(yáng)性表達(dá)與陰性表達(dá)的生存曲線Figure 2 Survival curve of positive and negative expression of VEGF?Cin lung cancer tissues

3 討論

腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移是肺癌患者死亡的主要原因之一，而惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移本身是一個(gè)極其復(fù)雜、高度選擇的非隨機(jī)過(guò)程，可受多基因、多分子調(diào)控，探究相關(guān)分子生物學(xué)機(jī)制是提高肺癌診斷及預(yù)防的重要前提[9]。一方面，細(xì)胞黏度、細(xì)胞外基質(zhì)降解、病理性血管生成等過(guò)程是惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要生物學(xué)基礎(chǔ)，另一方面，癌細(xì)胞的增殖、凋亡直接影響惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展，因此圍繞相關(guān)過(guò)程探究敏感的生物標(biāo)記物是肺癌研究的重要方向之一[10]。

MTA1是MTA家族重要成員，該家族能同組蛋白脫乙酰基酶1、組蛋白脫乙酰基酶2相互結(jié)合，參與核小體形成組蛋白去乙?；瘡?fù)合物重塑，與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變化、核轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)[11]。MTA1基因定位于人染色體14q32.3，編碼的MTA1蛋白羧基末端富含脯氨酸，其695~705殘基序列同SH3結(jié)構(gòu)域完全配對(duì)，而后者可參與信號(hào)傳導(dǎo)通路中蛋白與蛋白間相互作用，與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、增殖等多種過(guò)程有關(guān)[12]。MTA1蛋白還具有2個(gè)酪氨酸激酶、7個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ、9個(gè)蛋白激酶的磷酸化位點(diǎn)以及4個(gè)N?糖激化位點(diǎn)，可與信號(hào)傳導(dǎo)通路中維持細(xì)胞正常功能的蛋白發(fā)生作用[13]。此外，MTA1蛋白自251殘基起有一個(gè)亮氨酸反折區(qū)、5個(gè)SPXX域，自393殘基始 有 一個(gè)鋅指DNA結(jié) 合域Cys?X2?Cys，與DNA結(jié)合蛋白、基因調(diào)節(jié)蛋白有關(guān)；還有一個(gè)SANT結(jié)構(gòu)域，同轉(zhuǎn)錄因子myb?相關(guān)蛋白的DNA結(jié)合域相似，可能參與細(xì)胞存活、增殖、分化等調(diào)節(jié)[14]。MTA1基因首次于老鼠的乳腺癌細(xì)胞株分離所得，其表達(dá)與乳腺腫瘤轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，而近些年來(lái)越來(lái)越多研究發(fā)現(xiàn)，MTA1蛋白高表達(dá)還與人類多種腫瘤如喉部鱗狀細(xì)胞癌、鼻咽癌等侵襲力有關(guān)[15?16]。國(guó)內(nèi)有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，抑制MTA1的表達(dá)，能抑制人食管癌Eca109細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]。此外，MTA1表達(dá)并不局限于腫瘤，在正常組織器官如腦、肝、睪丸等中也可檢測(cè)出MTA1不同程度表達(dá)，其與各種癌腫的相關(guān)性報(bào)道也不盡相同[18]。本研究采用免疫組化法對(duì)肺癌組織中MTA1進(jìn)行定性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)MTA1在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中均可表達(dá)，這可能與腫瘤發(fā)生發(fā)展中MTA1表達(dá)及定位紊亂有關(guān)。本文結(jié)果顯示，肺癌組織MTA1陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織，與不同病理類型無(wú)關(guān)，但與分化程度低、TNM分期高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示MTA1可能參與肺癌發(fā)生發(fā)展。

血管與淋巴管生成既是組織生長(zhǎng)、傷口愈合的重要生理過(guò)程，也是包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病發(fā)生發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)，其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子家族是血管生成主要的調(diào)控系統(tǒng)，也是參與淋巴管形成的重要因子[19]。VEGF?C作為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子家族重要成員，是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一特異性促淋巴管生長(zhǎng)因子，一方面VEGF?C可通過(guò)與VEGFR?3結(jié)合，誘導(dǎo)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，同時(shí)增加淋巴管通透性，與腫瘤淋巴管形成、癌細(xì)胞淋巴血管轉(zhuǎn)移關(guān)聯(lián)密切；另一方面VEGF?C還可通過(guò)與VEGFR?2結(jié)合，參與生理性或病理性血管生成過(guò)程啟動(dòng)，與腫瘤血管生成有關(guān)。此外，VEGF?C在癌細(xì)胞脫離基質(zhì)、到達(dá)轉(zhuǎn)移部位時(shí)抑制其凋亡，可促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，因此被認(rèn)為在腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的不同階段均有重要作用[20?21]。在已研究的人類腫瘤中，有一半腫瘤細(xì)胞如胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌等均可表達(dá)VEGF?C[22]。殷文娟等[23]研究指出，VEGF?C在喉鱗狀細(xì)胞癌中呈高表達(dá)，且與腫瘤淋巴管生成及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。本文結(jié)果顯示，肺癌組織VEGF?C陽(yáng)性表達(dá)率較癌旁正常組織高，與不同病理類型無(wú)關(guān)，與分化程度低、TNM分期高、脈管浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示VEGF?C可能參與肺癌發(fā)生發(fā)展。本文結(jié)果還顯示，肺癌組織MTA1與VEGF?C表達(dá)呈正相關(guān)，提示二者可能在肺癌發(fā)生發(fā)展中有協(xié)同作用。有研究[24]指出，VEGF?C表達(dá)可受多個(gè)通路影響，其中包括MTA1的調(diào)控，其傳導(dǎo)通路為缺氧誘導(dǎo)因子?1α。此外，本文結(jié)果顯示，肺癌組織MTA1、VEGF?C陽(yáng)性表達(dá)者PFS縮短、3年無(wú)進(jìn)展生存率下降，說(shuō)明MTA1、VEGF?C陽(yáng)性表達(dá)與患者預(yù)后有關(guān)，二者在肺癌預(yù)后判斷中展現(xiàn)出一定應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)提示在臨床實(shí)踐中，對(duì)MTA1、VEGF?C陽(yáng)性表達(dá)或許可通過(guò)相關(guān)靶向治療，提高抗腫瘤效果。

綜上所述，肺癌組織MTA1、VEGF?C呈異常高表達(dá)，可能與肺癌發(fā)展及預(yù)后有關(guān)，在肺癌預(yù)后評(píng)估及相關(guān)靶向治療中展現(xiàn)出一定應(yīng)用前景。本研究不足之處在于缺乏MTA1、VEGF?C在肺癌作用中具體機(jī)制探究，且未對(duì)MTA1、VEGF?C表達(dá)進(jìn)行定量檢測(cè)，可能結(jié)果不夠精準(zhǔn)，因此尚需其他研究佐證，這也是筆者后期研究關(guān)注的方向。