hsa_circ_0006370促進高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞（HK?2）鐵死亡

熊軒，嚴(yán)躍紅，楊倩，沈美妊，鐘小仕

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬順德醫(yī)院腎臟內(nèi)科，廣東 佛山 528315；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院腎臟內(nèi)科，廣東 廣州 510799；3.暨南大學(xué)附屬廣州紅十字會醫(yī)院腎臟內(nèi)科，廣東 廣州 510220）

糖尿病腎?。╠iabetic kidney disease,DKD）一直是導(dǎo)致慢性腎病和腎功能衰竭的主要原因。在過去的20年里，DKD的發(fā)病率和死亡率在世界范圍內(nèi)迅速上升[1]。隨著腎臟的損傷，糖尿病患者經(jīng)常會出現(xiàn)多種并發(fā)癥，如視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)病變和心血管疾病，所有這些因素都會導(dǎo)致死亡的風(fēng)險升高[2]。DKD除了給患者帶來健康問題外，還會給社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)。目前對DKD的發(fā)病機制的研究已大大增加，但引起DKD發(fā)生和發(fā)展的分子機制仍有待闡明。因此，尋找新發(fā)病機制和治療靶點可能為DKD患者治療提供新的方法。研究表明糖尿病腎病中腎小管病變在早期就已經(jīng)出現(xiàn)，甚至早于腎小球病變，還有研究表明腎小管損傷要早于蛋白尿的出現(xiàn)[3]。腎小管損傷會影響腎小球濾過功能、導(dǎo)致氧化應(yīng)激、缺氧、慢性炎癥以及纖維化，從而推動糖尿病腎病的進展[4]。以上研究表明腎小管上皮細(xì)胞是治療DKD的重要靶點。鐵死亡（ferroptosis）是一種新型的非凋亡調(diào)節(jié)的細(xì)胞死亡，由脂質(zhì)修復(fù)酶谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX 4）調(diào)控，由嚴(yán)重的脂質(zhì)過氧化所驅(qū)動，這依賴于活性氧（ROS）的產(chǎn)生和鐵的超載[5]。雖然鐵死亡的生理功能尚不清楚，但它與多種人類疾病的關(guān)系已得到證實，如鐵死亡在缺血再灌注所致的急性腎損傷中起著重要作用，也是其他急性腎損傷模型的致病因素之一[6]。因此，調(diào)節(jié)腎小管上皮細(xì)胞鐵死亡可能具有治療DKD的潛力。環(huán)狀RNA（CircRNA）是一類在真核細(xì)胞中具有發(fā)育/組織特異性表達(dá)的非編碼RNA，通過連接3′端和5′端被環(huán)化。最近，有證據(jù)表明，circRNA在包括DKD在內(nèi)的各種疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中起著不可或缺的作用[7]。hsa_circ_0006370是一種新發(fā)現(xiàn)的circRNA，其表達(dá)和其是否通過調(diào)節(jié)腎小管上皮細(xì)胞鐵死亡來參與DKD發(fā)生發(fā)展的作用尚未見報道。本研究通過分析hsa_circ_0006370在腎小管上皮細(xì)胞中的表達(dá)，研究其在高糖環(huán)境下對細(xì)胞鐵死亡作用，尋找調(diào)控腎小管上皮細(xì)胞的鐵死亡潛在靶點，以期為DKD的臨床治療策略提供重要線索。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人近曲腎小管上皮細(xì)胞株（HK?2細(xì)胞）購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；DMEM培養(yǎng)液、D?葡萄糖（2.5 mol/L）溶液、青?鏈霉素溶液、磷酸鹽緩沖液（PBS）和胎牛血清均購自美國GⅠBCO公司；鐵誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡激活劑Erastin購于美國Sigma公司；Trizol和Lipofectamine 2000試劑盒購于美國Ⅰnvitrogen公司；Prime Script RT reagent Kit和SYBR Green RealtimePCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；MTS細(xì)胞增殖檢測試劑盒購于美國Promega公司；hsa_circ_0006370干擾序列（si?hsa_circ_0006370）和對照序列（si?NC）均購于上海吉瑪制藥公司。細(xì)胞內(nèi)ROS檢測試劑盒、鐵離子檢測試劑盒、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase,LDH）活性檢測試劑盒、丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH?Px）測定試劑盒、RⅠPA lysis buffer均購于上海碧云天生物公司；增強型化學(xué)發(fā)光試劑（electroche‐miluminescence,ECL）購自美國Sigma公司；抗人GPX4抗體、抗人xCT抗體、抗人FT抗體、抗人TFR抗體、抗人NRF2抗體、抗人HO?1抗體和抗人GAPDH抗體購于美國Santa Cruz公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 HK?2細(xì)胞培養(yǎng) 采用含有10%（φ）胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，添加1%青?鏈霉素雙抗溶液，然后置于37℃含5%（φ）CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長至對數(shù)生長期時用于后續(xù)實驗。HK?2細(xì)胞培養(yǎng)分為以下4組：（1）正常培養(yǎng)組：細(xì)胞在正常條件下培養(yǎng)；（2）PBS培養(yǎng)組：細(xì)胞在正常條件下培養(yǎng)同時添加與第（3）和（4）等體積的PBS；（3）高糖培養(yǎng)組：細(xì)胞在正常條件下培養(yǎng)同時添加1%的D?葡萄糖（2.5 mol/L）溶液；（4）Erastin培養(yǎng)組：細(xì)胞在正常條件下培養(yǎng)同時添加1%的Erastin（100μmol/L）溶液。以上各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，RT?qPCR檢測各組細(xì)胞中hsa_circ_0006370相對表達(dá)水平。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 HK?2細(xì)胞轉(zhuǎn)染按照Lipo‐fectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書操作，將hsa_circ_0006370干擾序列（si?hsa_circ_0006370）和對照序列（si?NC）轉(zhuǎn)染進入HK?2細(xì)胞。實驗分為4組：（1）高糖+干擾對照組（高糖+si?NC）：高糖培養(yǎng)組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，轉(zhuǎn)染si?NC序列；（2）高糖+干擾hsa_circ_0006370組（高糖+si?hsa_circ_0006370）：高糖培養(yǎng)組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，轉(zhuǎn)染si?hsa_circ_0006370序列；（3）Erastin+干擾對照組（Erastin+si?NC）：Erastin培養(yǎng)組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，轉(zhuǎn)染si?NC序列；（4）Erastin+干擾hsa_circ_0006370組（Erastin+si?hsa_circ_0006370）：Erastin培養(yǎng)組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，轉(zhuǎn)染si?hsa_circ_0006370序列。以上各組細(xì)胞經(jīng)37℃含5%CO2條件下培養(yǎng)12 h后，檢測各組細(xì)胞中hsa_circ_0006370相對表達(dá)水平、細(xì)胞增殖水平、細(xì)胞ROS、LDH、MDA、GSH?Px水平以及GPX4、xCT、FT、TFR、NRF2、HO?1蛋白表達(dá)水平。

1.2.3 RT?qPCR 分別收集各組經(jīng)培養(yǎng)或轉(zhuǎn)染后的HK?2細(xì)胞，Trizol試劑抽提細(xì)胞內(nèi)的總RNA，采用Prime Script RTreagent Kit將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)SYBR Green Realtime PCR試劑盒說明書配置qPCR體系進行qPCR，檢測各組細(xì)胞中hsa_circ_0006370表達(dá)水平。以U6作為內(nèi)參，根據(jù)2-ΔΔCt法計算各組細(xì)胞中hsa_circ_0006370相對表達(dá)水平。

1.2.4 MTS法檢測細(xì)胞增殖 MTS法檢測各組轉(zhuǎn)染后的HK?2細(xì)胞增殖，將上述培養(yǎng)的4組細(xì)胞：（1）高糖+si?NC組、（2）高糖+si?hsa_circ_0006370組、（3）Erastin+si?NC組、（4）Erastin+si?hsa_circ_0006370組細(xì)胞（1×104個/孔）接種至96孔板中，37℃含5%CO2的條件下培養(yǎng)7 d后，按照MTS檢測試劑盒方法檢測各細(xì)胞在490 nm波長下的吸光度（A），計算細(xì)胞生存率。細(xì)胞生成率=si?hsa_circ_0006370組A/si?NC組A×100%。

1.2.5 細(xì)胞內(nèi)鐵離子、ROS、LDH、MDA、GSH?Px活性水平檢測 將上述培養(yǎng)的4組細(xì)胞1×106個/孔接種至12孔板中，37℃含5%CO2的條件下培養(yǎng)12 h后，收集各組細(xì)胞，分別按照胞內(nèi)鐵離子檢測試劑盒、ROS檢測試劑盒、LDH活性檢測試劑盒、MDA含量檢測試劑盒、GSH?Px測定試劑盒說明書操作，檢測各組細(xì)胞內(nèi)ROS、LDH、MDA、GSH?Px活性水平。

1.2.6 Western blot將上述培養(yǎng)的4組細(xì)胞1×106個/孔接種至12孔板中，37℃含5%CO2條件下培養(yǎng)12 h后，收集各組細(xì)胞，先用RⅠPA裂解緩沖液裂解細(xì)胞，離心收集上清，測定蛋白質(zhì)濃度。各組按等量（30μg）進行上樣，SDS?PAGE電泳分離蛋白，并將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，室溫封閉2 h后，分別加入抗人GPX4抗體、抗人xCT抗體、抗人FT抗體、抗人TFR抗體、抗人NRF2抗體、抗人HO?1抗體、抗人GAPDH抗體，4℃孵育過夜。次日洗膜、室溫孵育二抗2 h，經(jīng)洗膜后化學(xué)發(fā)光ECL顯影、曝光、成像。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 所有實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以表示，兩組間比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，然后兩兩比較采用LSD?t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高糖和Erastin處理對HK?2細(xì)胞中hsa_circ_0006370表達(dá)的影響

和正常培養(yǎng)組相比，PBS培養(yǎng)組細(xì)胞中hsa_circ_0006370相對表達(dá)水平無明顯差異（P＞0.05），高糖培養(yǎng)組和Erastin培養(yǎng)組細(xì)胞中hsa_circ_0006370相對表達(dá)水平顯著升高（P均＜0.01）；和PBS培養(yǎng)組相比，高糖培養(yǎng)組和Erastin培養(yǎng)組細(xì)胞中hsa_circ_0006370相對表達(dá)水平顯著升高（P均＜0.01）。見表1。

表1 RT?qPCR檢測高糖和Erastin處理后HK?2細(xì)胞中hsa_circ_0006370表達(dá)水平Table 1 The expression level of hsa_circ_0006370 detected by RT?qPCRin HK?2 cells after treatment with high glu‐cose and Erastin(±s，n=3)

表1 RT?qPCR檢測高糖和Erastin處理后HK?2細(xì)胞中hsa_circ_0006370表達(dá)水平Table 1 The expression level of hsa_circ_0006370 detected by RT?qPCRin HK?2 cells after treatment with high glu‐cose and Erastin(±s，n=3)

與正常培養(yǎng)組比較：*P＜0.01；與加PBS培養(yǎng)組比較：#P＜0.01。

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2.2 干擾hsa_circ_0006370表達(dá)效果檢測

高糖+si?hsa_circ_0006370組細(xì)胞中hsa_circ_0006370相對表達(dá)水平顯著低于高糖+si?NC組（P＜0.01）；Erastin+si?hsa_circ_0006370組細(xì)胞中hsa_circ_0006370相對表達(dá)水平顯著低于Erastin+si?NC組（P＜0.01）。見表2。

表2 RT?qPCR檢測細(xì)胞中hsa_circ_0006370相對表達(dá)水平Table 2 The relative expression of hsa_circ_0006370 in cells detected by RT?qPCR(±s，n=3)

表2 RT?qPCR檢測細(xì)胞中hsa_circ_0006370相對表達(dá)水平Table 2 The relative expression of hsa_circ_0006370 in cells detected by RT?qPCR(±s，n=3)

與高糖處理si?NC組比較：*P＜0.01；與Erastin處理si?NC組比較：#P＜0.01。

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2.3 干擾hsa_circ_0006370表達(dá)對細(xì)胞增殖以及細(xì)胞內(nèi)鐵離子、ROS、LDH、MDA、GSH?Px活性水平的影響

與 高 糖+si?NC組 相 比，高 糖+si?hsa_circ_0006370組細(xì)胞的增殖能力顯著增強（P＜0.01），細(xì)胞內(nèi)鐵離子、ROS、LDH和MDA活性水平均顯著降低，而GSH?Px活性水平顯著升高（P＜0.01）；與Eras‐tin+si?NC組相比，Erastin+si?hsa_circ_0006370組細(xì)胞的增殖能力顯著增強（P＜0.01），細(xì)胞內(nèi)鐵離子、ROS、LDH和MDA活性水平均顯著降低，而GSH?Px活性水平顯著升高（P＜0.01）。見表3。

表3 干擾hsa_circ_0006370表達(dá)對細(xì)胞增殖以及細(xì)胞內(nèi)鐵離子、ROS、LDH、MDA、GSH?Px活性水平的影響Table 3 Effects of the interference of hsa_circ_0006370 on cell proliferation,intracellular Fe2+,ROS,LDH,MDA and the activity of GSH?Px(±s，n=3)

表3 干擾hsa_circ_0006370表達(dá)對細(xì)胞增殖以及細(xì)胞內(nèi)鐵離子、ROS、LDH、MDA、GSH?Px活性水平的影響Table 3 Effects of the interference of hsa_circ_0006370 on cell proliferation,intracellular Fe2+,ROS,LDH,MDA and the activity of GSH?Px(±s，n=3)

與高糖處理si?NC組比較：*P＜0.01；與Erastin處理si?NC組比較：#P＜0.01。

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2.4 干擾hsa_circ_0006370表達(dá)對細(xì)胞內(nèi)鐵死亡標(biāo)志和相關(guān)通路蛋白表達(dá)的影響

與 高 糖+si?NC組 相 比，高 糖+si?hsa_circ_0006370組細(xì)胞中的GPX4、胱氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白（cystine/glutamate antiporter system Xc?,xCT）、鐵蛋白（ferritin,FT）、相關(guān)蛋白核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor E2?related factor?2,NRF2）和血紅素氧合酶1（hemeoxygenase?1,HO?1）蛋白表達(dá)水平明顯上升，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（transferrin receptor,TFR）蛋白表達(dá)水平顯著下降；與Erastin+si?NC組相比，Erastin+si?hsa_circ_0006370組 細(xì) 胞 中 的GPX4、xCT、FT、NRF2、HO?1蛋白表達(dá)水平明顯上升，TFR蛋白表達(dá)水平明顯下降。見圖1和表4。

表4 干擾hsa_circ_0006370表達(dá)對細(xì)胞GPX4、xCT、FT、TFR、NRF2、HO?1蛋白表達(dá)的影響Table 4 Effects of the interference of hsa_circ_0006370 on the expression of GPX4,xCT,FT,TFR,NRF2,and HO?1(n=3)

圖1 Western blot檢測各組細(xì)胞中GPX4、xCT、FT、TFR、NRF2、HO?1蛋白表達(dá)Figure 1 The expressions of GPX4,xCT,FT,TFR,NRF2,and HO?1ineach group detected by Western blot

3 討論

DKD是目前最常見的終末期腎病病因，但DKD的具體機制尚不清楚。由于DKD的進展涉及到許多途徑，因此單純的血糖或血壓控制不足以預(yù)防及治療DKD。針對其各種危險因素采用的如血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑等各種藥物無論是單獨使用還是聯(lián)合治療均無法緩解或逆轉(zhuǎn)DKD[8]。因此，糖尿病腎病的發(fā)病機制有待深入研究。

近年來，circRNAs引起了人們的廣泛關(guān)注。circRNAs是一類由反向剪接產(chǎn)生的非編碼RNAs，與線性非編碼RNAs相比，circRNAs由于其閉環(huán)結(jié)構(gòu)而具有更高的穩(wěn)定性。越來越多的證據(jù)證實，cir‐cRNAs可能通過發(fā)揮非編碼或編碼RNA的作用而發(fā)揮不同的生物學(xué)作用。由于circRNAs比線性RNA更穩(wěn)定，具有更長的半衰期和對RNase的抗性，它們可以作為線性RNA的競爭對手，在基因表達(dá)中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[9]，同時也使其成為診斷性生物標(biāo)記物和治療靶點的潛在候選分子。近年來，大量的研究揭示了它們在人類各種疾病發(fā)生和發(fā)展過程中的獨特表達(dá)特征和重要的生物學(xué)作用，如癌癥[10]、心血管疾病[11]、腎病[12]。最近有一些關(guān)于異常表達(dá)的circRNAs在DKD中的研究，如Peng等[7]研究發(fā)現(xiàn)在高糖培養(yǎng)的腎臟系膜細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞中，circ_010383的表達(dá)明顯下調(diào)，circ_010383可以通過下調(diào)miR?135a的表達(dá)促進DKD腎纖維化的發(fā)生。circ_0080425的表達(dá)與DKD的進展相關(guān)，對系膜細(xì)胞的增殖和纖維化有積極作用，其通過海綿化miR?24?3p和靶向成纖維細(xì)胞生長因子11抑制DKD細(xì)胞增殖和纖維化[13]。hsa_circ_0006370是一種新發(fā)現(xiàn)的circRNA，目前與其相關(guān)的研究報道較少。本研究發(fā)現(xiàn)在高糖培養(yǎng)的HK?2細(xì)胞中hsa_circ_0006370表達(dá)水平顯著升高，表明hsa_circ_0006370在高糖培養(yǎng)的HK?2細(xì)胞中異常表達(dá)。Erastin作為細(xì)胞鐵死亡的誘導(dǎo)劑，在添加有Erastin培養(yǎng)的HK?2細(xì)胞中同樣存在hsa_circ_0006370表達(dá)水平異常升高的現(xiàn)象，表明hsa_circ_0006370可能與DKD中調(diào)節(jié)腎小管上皮細(xì)胞鐵死亡的機制有關(guān)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)在高糖和Erastin培養(yǎng)的HK?2細(xì)胞中干擾hsa_circ_0006370表達(dá)，能夠促進細(xì)胞的增殖，對細(xì)胞生長有保護作用，進一步證實hsa_circ_0006370在DKD病理進程中可能有調(diào)節(jié)腎小管上皮細(xì)胞鐵死亡的作用。

鐵死亡是一種新發(fā)現(xiàn)的由鐵依賴性脂質(zhì)過氧化引起的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡，它在遺傳學(xué)、生物化學(xué)和形態(tài)學(xué)上不同于其他調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡[14]。近年來，鐵死亡被發(fā)現(xiàn)參與了包括DKD在內(nèi)許多疾病的發(fā)展過程[15?16]。氧化還原性鐵的積累、抗氧化能力的喪失和含有多不飽和脂肪酸的磷脂酶的過氧化都是鐵死亡的特征性變化，這些指標(biāo)可以用來評估鐵死亡的程度[17]。ROS積聚是導(dǎo)致鐵死亡的主要原因，ROS誘導(dǎo)含磷脂細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生MDA，直接引起細(xì)胞毒性，進而誘發(fā)鐵死亡[18]。本研究發(fā)現(xiàn)在高糖和Erastin培養(yǎng)的HK?2細(xì)胞中干擾hsa_circ_0006370表達(dá)，能夠降低細(xì)胞內(nèi)鐵離子、ROS、LDH和MDA積聚，同時增加GSH?Px水平，從而減輕其對細(xì)胞的毒性。GPX4和SLC7A11（xCT的催化亞基）被認(rèn)為是鐵死亡的重要生物標(biāo)志物，因為缺乏它們可能導(dǎo)致大量ROS產(chǎn)生和GSH生物合成功能障礙[19]。TFR‐1和FTH‐1是參與鐵代謝穩(wěn)態(tài)的2個關(guān)鍵基因，與鐵死亡的發(fā)生密切相關(guān)［20］。NRF2在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)與鐵儲存和轉(zhuǎn)運相關(guān)，同時，NRF2通過調(diào)節(jié)一系列信號蛋白和酶的表達(dá)來維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)和氧化介質(zhì)的平衡，在抗氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[21]。HO?1可由多種線索誘導(dǎo)，包括炎癥介質(zhì)、氧化劑，是對細(xì)胞氧化還原狀態(tài)作出反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物［22］。本研究發(fā)現(xiàn)在高糖和Erastin培養(yǎng)的HK?2細(xì)胞中干擾hsa_circ_0006370表達(dá)能夠增加GPX4、xCT、FTH、NRF2和HO?1蛋白表達(dá)水平，抑制TFR蛋白表達(dá)水平，進一步證實hsa_circ_0006370在高糖環(huán)境中能夠促進腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。本研究雖然證實了hsa_circ_0006370在高糖環(huán)境中能夠促進腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，但是其具體的分子調(diào)控機制仍需進行深入的研究。

綜上所述，本研究證實了hsa_circ_0006370在高糖培養(yǎng)的HK?2細(xì)胞中高表達(dá)，干擾hsa_circ_0006370表達(dá)顯著促進細(xì)胞的增殖、減輕細(xì)胞內(nèi)ROS等活性物質(zhì)產(chǎn)生，提高抗氧化能力，抑制細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。本研究為DKD的診治提供了新的潛在作用靶點，可能具有較好的應(yīng)用前景。