RSK信號通路抑制劑聯(lián)合阿奇霉素在沙眼衣原體感染小鼠模型中的作用研究

董凱凱，陳丹丹，朱迎春，張晶晶，葛建彬

（南通市第二人民醫(yī)院藥劑科，江蘇 南通 226000）

沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis,CT）是具有特定生命周期的一種細胞內(nèi)寄生病原菌，可通過性傳播疾病引發(fā)一系列泌尿生殖道疾病，如：女性宮頸炎、盆腔炎、不孕癥等[1]。CT感染已發(fā)展成為全球公共衛(wèi)生問題之一，其患病率呈逐年上升趨勢，對人們身體健康產(chǎn)生極大威脅[2]。當(dāng)前，臨床多推薦采用抗生素治療CT感染，首選藥物為大環(huán)內(nèi)酯類抗生素如阿奇霉素、多西環(huán)素等，但臨床實踐顯示抗生素治療CT感染效果不佳，失敗案例常有報道[3]。因此，積極探索新方法或新藥物治療CT感染，已成為臨床亟待解決的重要問題之一。

近年來，宿主導(dǎo)向療法作為微生物感染治療的新方向成為國內(nèi)外研究的熱點。宿主導(dǎo)向療法主要通過調(diào)節(jié)宿主自身作用機制以干擾病原體持續(xù)復(fù)制或增強宿主免疫反應(yīng)發(fā)揮治療效果，通常作為常規(guī)藥物抗感染治療的輔助治療手段。宿主導(dǎo)向療法已在傳染性疾病和真菌感染治療方面取得了一定進展，但在衣原體感染治療方面研究報道較少[4?6]。Rother等[7]研究證實抑制肌醇?5′?單 磷 酸脫 氫酶（inositol?5′?monophosphate dehydrogenase,ⅠMPDH）作用位點能夠有效抑制體內(nèi)外衣原體生長，表明ⅠMPDH可能是衣原體宿主導(dǎo)向療法的新靶點，為衣原體宿主導(dǎo)向療法奠定了實驗基礎(chǔ)。既往研究表明[8]，CT的生長依賴于促分裂原活化蛋白激酶（mitogen?activated protein kinase,MAPK）/細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase,ERK）激酶（MEK）/ERK信號通路作用，通過MEK抑制劑U0126作用可減少CT包涵體形成單位（inclusion forming unit,ⅠFU），提示MEK抑制劑U0126對CT感染具有抑制作用。核糖體S6蛋白激酶（ribosomal S6 kinase,RSK）是MAPK/ERK信號通路下游重要的效應(yīng)分子之一，薛耀華[9]研究報道RSK抑制劑LJⅠ308能夠顯著抑制CT體外感染，且在CT體外感染中，LJⅠ308與阿奇霉素聯(lián)合應(yīng)用起協(xié)同效果。本研究在此基礎(chǔ)上探究RSK信號通路抑制劑LJⅠ308聯(lián)合阿奇霉素在CT感染的體內(nèi)作用，以期為臨床治療CT感染提供新方向。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級Balb/c雌性小鼠80只，6~8周齡，體質(zhì)量18~24 g，購于南通大學(xué)實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號SCXK（蘇）2019?0001。

1.2 主要試劑和儀器

主要試劑：E型CT菌株（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所惠贈）；人宮頸癌上皮細胞株（Hela?229，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞中心）；醋酸甲羥孕酮注射液（Pfizer Manufacturing Belgium NV，批準(zhǔn)文號：H20050057，規(guī)格：3 mL∶0.15 g）；阿奇霉素（華北制藥集團制劑有限公司，批準(zhǔn)文號：H20066581，規(guī)格：0.25 g）；放線菌酮（美國Gibco公司）；HE染色試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；蔗糖?磷酸鹽?谷氨酸鹽溶液（sucrose?phosphate?glu‐tamate,SPG）無菌溶液（北京雷根生物技術(shù)有限公司）；DEME培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；胎牛血清（廣州蕊特生物制品有限公司）；熒光標(biāo)記的衣原體主要外膜蛋白單克隆抗體（愛爾蘭Trinity公司）；DAPⅠ（美國Ⅰnvitrogen公司）；RSK抑制劑LJⅠ308（美國MCE公司）；兔抗人RSK、p?RSK單克隆抗體、鼠抗人 甘 油 醛?3?磷 酸 脫 氫 酶（glyceraldehyde?3?phos‐phate dehydrogenase,GAPDH）單克隆抗體、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）標(biāo)記的山羊抗兔ⅠgG抗體、山羊抗鼠ⅠgG抗體（美國Abcam公司）。

主要儀器：MCO?18AⅠC型CO2恒溫培養(yǎng)箱（日本SANYO公司）；5430R高速低溫離心機（德國艾本德公司）；FCK?50C熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；680型酶標(biāo)儀（美國Bio?Rad公司）。

1.3 方法

1.3.1 CT感染液的制備 用E型CT菌株感染Hela?229細胞，在含有10%（φ）胎牛血清和1μg/mL放線菌酮的DEME培養(yǎng)基中培養(yǎng)，收集單層感染Hela?229細胞，胰酶消化后反復(fù)凍融3次，4℃下以1 500 r/min離心10 min沉淀細胞碎片，收集上清液，在4℃15 000 r/min離心條件下離心60 min，離心后的沉淀物即為純化的CT，將其懸浮于SPG溶液中，計算確定ⅠFU，取1×106ⅠFU/mL作為接種劑量，按每份0.5 mL分裝保存于-70℃冰箱備用。

1.3.2 CT感染小鼠模型建立 80只Balb/c雌性小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，腹部皮下注射醋酸甲羥孕酮注射液2.5 mg/只，1次/周，連續(xù)注射2周后，隨機抽取64只小鼠陰道接種CT感染液：每只小鼠腹腔注射20%（ρ）烏拉坦0.1 mL，觀察小鼠麻醉至安靜且呼吸穩(wěn)定后，將濕棉簽插入小鼠陰道旋轉(zhuǎn)幾次擦去分泌物，取小兒頭皮針軟管約2 cm連接1 mL無菌注射器，軟管前端送入小鼠陰道約0.8~1 cm深度，推入CT感染液（1×106ⅠFU/mL SPG懸液）50μL，接種后小鼠倒置位15 min，促使感染液充分進入小鼠陰道內(nèi)。

1.3.3 動物分組與給藥處理 陰道接種CT感染液的64只小鼠以隨機數(shù)字表法分為4組，分別為感染組、LJⅠ308組、阿奇霉素組、LJⅠ308聯(lián)合阿奇霉素組，每組16只；未進行陰道接種CT感染液的16只小鼠設(shè)為空白對照組。感染后第3天，LJⅠ308組小鼠灌胃給藥LJⅠ308 60 mg/kg，阿奇霉素組小鼠灌胃給藥阿奇霉素2 mg/kg，LJⅠ308聯(lián)合阿奇霉素組小鼠灌胃給藥LJⅠ308 60 mg/kg和阿奇霉素2 mg/kg，空白對照組和感染組小鼠灌胃給予同等劑量的SPG無菌溶液。分別于感染后第4天、7天、14天、21天、28天，將干燥的一次性無菌采樣拭子插入小鼠陰道約0.8~1.0 cm深度，順時針轉(zhuǎn)動10圈后取出，剪斷采樣拭子頭部，置入EP管中（含SPG溶液1 mL，冰上保存），做好標(biāo)記后室溫下混勻，棉拭子在管壁充分擠壓釋放水分，每份陰道分泌液標(biāo)本分裝后置于-70℃冰箱備用。每組小鼠在給藥后第28天（取完陰道拭子標(biāo)本后）用斷頸方法處死，取小鼠生殖道組織進行相應(yīng)檢查。

1.3.4 各組小鼠CT感染陽性率和衣原體數(shù)量檢測 分別取上述各組小鼠陰道分泌液標(biāo)本50μL接種于Hela?229單層細胞96孔培養(yǎng)板中（每個樣品分別接種2份），培養(yǎng)板在1 800 r/min條件下離心60 min，37℃搖床搖動30 min，移去接種物，200μL細胞培養(yǎng)液（含10%胎牛血清，1μg/mL放線菌酮）沖洗后加入500μL CT培養(yǎng)液，置入10 mm爬片，37℃，5%（φ）CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，進行直接免疫熒光染色。棄去培養(yǎng)板中的細胞培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗細胞2次，4%（φ）多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌2次，用0.5%Triton?100作用于細胞15 min，PBS洗滌2次，從培養(yǎng)板內(nèi)取出爬片，加入熒光標(biāo)記的衣原體主要外膜蛋白單克隆抗體（PBS按1∶100稀釋），37℃培養(yǎng)箱中孵育30 min，PBS洗去抗體，DAPⅠ染色10 min，PBS漂洗爬片2次，干燥后封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察，有CT包涵體生長記為陽性感染。隨機選取10個200倍視野統(tǒng)計包涵體數(shù)目，并根據(jù)其稀釋濃度計算各組感染小鼠包涵體數(shù)量，結(jié)果以對數(shù)表示。

1.3.5 各組小鼠生殖道組織病理學(xué)檢查 將各組小鼠生殖系統(tǒng)標(biāo)本置入10%（φ）甲醛溶液中固定24 h，經(jīng)脫水、石蠟包埋后，制備切片，將切好的石蠟切片分別用二甲苯Ⅰ液脫蠟10 min、二甲苯Ⅱ液脫蠟5 min，無水乙醇處理1 min（共2次），85%（φ）乙醇5 min，蒸餾水5 min，用蘇木精染色3 min，蒸餾水洗10 min，1%鹽酸乙醇分化30 s、蒸餾水洗1 min，1%稀氨水反藍30 s、蒸餾水洗1 min，0.5%伊紅液染色5 min，蒸餾水洗30 s，85%乙醇和95%乙醇分別脫水2 min，無水乙醇處理2 min，二甲苯Ⅰ液透明2 min、二甲苯Ⅱ液透明2 min，中性樹膠封片，在光鏡下觀察各組小鼠生殖道組織病理學(xué)變化情況。

1.3.6 Western blot法檢測小鼠生殖道組織中RSK信號通路相關(guān)蛋白表達水平 收集各組小鼠生殖道組織標(biāo)本，加入組織裂解液，提取組織總蛋白，經(jīng)BCA法測定蛋白濃度，取定量蛋白經(jīng)SDS?PAGE分離，并將分離所得蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用含0.5%脫脂奶粉的TBST緩沖液室溫下封閉膜1 h。分別加入RSK（1∶800）、p?RSK（1∶800）、GAPDH（1∶1 000）一抗與PVDF膜共同孵育，4℃過夜，用TBST洗膜3次，每次5 min，加入對應(yīng)HRP標(biāo)記的二抗（1∶2 000），室溫下與PVDF膜共同孵育2 h，用TBST洗膜3次，每次5 min。用ECL發(fā)光液進行顯影，分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白（GAPDH）的灰度值之比表示目的蛋白相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0軟件進行實驗數(shù)據(jù)處理分析，實驗結(jié)果以和n（%）表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗和χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠CT感染體征觀察

陰道接種CT感染液的小鼠食欲降低，活動減少，外陰出現(xiàn)輕微紅腫癥狀，分泌物增加，且顏色清亮或渾濁，部分小鼠出現(xiàn)毛發(fā)脫落現(xiàn)象。未進行陰道接種CT感染液的空白對照組小鼠飲食進水正常，活動正常，外陰顏色正常，無明顯分泌物。

2.2 各組小鼠CT感染陽性率變化情況

感染后第4天，空白對照組小鼠CT感染陽性率為0.00%，其他各組小鼠CT感染陽性率均為100.00%，說明整個實驗過程無污染，CT感染小鼠模型造模成功。感染后第4天、7天、14天、21天、28天，感染組小鼠CT感染陽性率均顯著高于空白對照組（P＜0.05）；感染后第14天，LJⅠ308組和阿奇霉素組小鼠CT感染陽性率顯著低于感染組（P＜0.05）；感染后第21天、28天，LJⅠ308聯(lián)合阿奇霉素組小鼠CT感染陽性率為0.00%，顯著低于LJⅠ308組和阿奇霉素組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠CT感染陽性率變化情況Table 1 Changes in CT infection positive rate of mice in each group（n=16） n（%）

2.3 各組小鼠陰道分泌液中CT包涵體數(shù)目比較

感染后第4天，各組小鼠陰道分泌液中CT包涵體數(shù)目差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；感染后第7天、14天、21天、28天，LJⅠ308組和阿奇霉素組小鼠陰道分泌液中CT包涵體數(shù)目顯著少于感染組（P＜0.05），LJⅠ308聯(lián)合阿奇霉素組小鼠陰道分泌液中CT包涵體數(shù)目顯著少于LJⅠ308組和阿奇霉素組（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組小鼠CT包涵體數(shù)目比較Figure 1 Comparison of CT inclusion bodies of mice in each group

2.4 各組小鼠生殖道組織病理學(xué)改變情況

空白對照組小鼠生殖道組織黏膜上皮細胞形態(tài)完整，排列整齊，無炎性細胞浸潤現(xiàn)象，固有層間質(zhì)無水腫；感染后第28天，感染組小鼠生殖道組織黏膜上皮表層細胞排列紊亂，存在明顯細胞變性壞死，黏膜上皮彌漫分布大量炎癥細胞聚集，固有層間質(zhì)明顯水腫，固有層毛細血管明顯擴張。與感染組比較，LJⅠ308組、阿奇霉素組小鼠生殖道組織病理癥狀相對減輕，可見少量炎癥細胞浸潤，而LJⅠ308聯(lián)合阿奇霉素組小鼠生殖道組織病理癥狀較LJⅠ308組、阿奇霉素組改善更為明顯。見圖2。

圖2 感染后第28天各組小鼠生殖道組織病理圖（HE染色）Figure 2 Histopathology of reproductive tract of mice in each group on the 28th day after infection（HEstaining）

2.5 RSK信號通路抑制劑LJⅠ308作用后小鼠生殖道組織中RSK信號通路相關(guān)蛋白表達情況

與空白對照組比較，感染組小鼠生殖道組織中p?RSK/RSK比值顯著升高（P＜0.05）；與感染組比較，LJⅠ308組、阿奇霉素組小鼠生殖道組織中p?RSK/RSK比值顯著降低（P＜0.05），且LJⅠ308聯(lián)合阿奇霉素組小鼠生殖道組織中p?RSK/RSK比值顯著低于LJⅠ308組和阿奇霉素組（P＜0.05），見圖3。

圖3 各組小鼠生殖道組織中RSK信號通路相關(guān)蛋白表達情況Figure 3 Expression of RSK signal pathway related proteins in reproductive tract of mice in each group

3 討論

衣原體屬于原核細胞型微生物，廣泛存在于自然界，其寄生于宿主細胞內(nèi)形成類似病毒的獨特發(fā)育周期，可導(dǎo)致人類與動物的多種疾病。CT是對人有致病作用的衣原體之一，不僅可引起沙眼、包涵體結(jié)膜炎、嬰幼兒肺炎，還可經(jīng)過性傳播途徑引起多種泌尿生殖道感染疾病[10]。目前，CT感染主要以大環(huán)內(nèi)酯類抗生素治療為主，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素能與細菌核蛋白體的50 S亞基結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)肽作用和信息核糖核酸的轉(zhuǎn)移，阻礙細菌的蛋白質(zhì)合成，從而起到抑菌作用。但由于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素胃腸道反應(yīng)嚴重，所需治療時間長，導(dǎo)致很多患者不能堅持治療，使得CT感染無法完全治愈，甚至出現(xiàn)多次重復(fù)感染的現(xiàn)象[11?12]。因此，探索新的藥物或新的方法治療CT感染是當(dāng)前臨床亟待解決的重要問題之一。

RSK是MAPK/ERK信號通路下游的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，活化后的RSK可轉(zhuǎn)位至細胞核中調(diào)節(jié)細胞核內(nèi)的靶分子，進而參與細胞周期調(diào)控、調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡等過程[13?15]。Davies等[16]研究發(fā)現(xiàn)RSK抑制劑LJⅠ308能夠通過消除癌癥干細胞克服化療耐藥性，提高癌癥患者的生存期，LJⅠ308有望成為靶向治療癌癥的有效藥物。本研究探索RSK抑制劑LJⅠ308在CT感染中的體內(nèi)作用，以CT生殖道感染小鼠模型為研究對象，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LJⅠ308作用于CT生殖道感染小鼠，能夠顯著降低小鼠生殖道CT感染陽性率，減少小鼠生殖道內(nèi)的CT包涵體數(shù)目，并且LJⅠ308和阿奇霉素聯(lián)合使用效果優(yōu)于單用LJⅠ308和阿奇霉素的作用，二者聯(lián)合具有協(xié)同作用。

生殖道衣原體感染可誘導(dǎo)機體促炎癥細胞因子產(chǎn)生和釋放，過度的炎癥反應(yīng)刺激會引起生殖道組織病理性損傷[17?18]。本研究在經(jīng)CT感染后第28天取小鼠生殖道組織進行HE染色觀察，結(jié)果顯示，感染組小鼠生殖道組織黏膜上皮表層細胞存在明顯的變性壞死和炎癥細胞聚集現(xiàn)象，固有層間質(zhì)有明顯水腫和毛細血管擴張狀況。而經(jīng)過LJⅠ308和阿奇霉素干預(yù)的小鼠，生殖道組織病理損傷相對減輕，炎癥細胞浸潤減少，LJⅠ308和阿奇霉素聯(lián)合作用的小鼠，生殖道組織癥狀改善更為明顯。該結(jié)果進一步說明LJⅠ308對CT感染具有抑制作用，LJⅠ308和阿奇霉素聯(lián)合起協(xié)同效果，能夠有效減輕小鼠生殖道組織病理損傷。此外，本研究檢測小鼠生殖道組織中RSK信號通路相關(guān)蛋白表達情況，發(fā)現(xiàn)RSK信號通路抑制劑LJⅠ308顯著下調(diào)CT感染小鼠生殖道組織中磷酸化RSK蛋白表達，且LJⅠ308與阿奇霉素聯(lián)合處理對CT感染小鼠生殖道組織中磷酸化RSK蛋白表達的下調(diào)作用明顯優(yōu)于單用LJⅠ308和阿奇霉素。表明LJⅠ308通過抑制RSK信號通路活性發(fā)揮抗CT感染作用。

綜上所述，RSK信號通路抑制劑LJⅠ308對CT感染具有明顯的抑制作用，LJⅠ308聯(lián)合阿奇霉素在抑制CT感染方面起著良好的協(xié)同作用，LJⅠ308有望成為阿奇霉素治療CT感染的有效佐劑，但其具體作用機制還需進一步研究。