褪黑素隱形脂質(zhì)體的制備及體外透皮釋藥性能的研究

張政，閆福鵬，楊程皓，劉晨雨，王友朝，周田田，郝吉福

［山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）藥學(xué)院，山東 泰安 271016］

褪黑素（melatonin,MLT）是松果體分泌的內(nèi)源性神經(jīng)激素，影響晝夜節(jié)律和細(xì)胞功能[1?4]。由于褪黑素只在夜間分泌并且分泌量極少，而一些時(shí)差綜合征會(huì)使褪黑素的分泌失衡，進(jìn)而導(dǎo)致睡眠規(guī)律紊亂，此時(shí)往往需要補(bǔ)充外源性褪黑素來調(diào)整機(jī)體的生理功能[5?6]。褪黑素作為一種吲哚雜環(huán)化合物，具有較低的水溶性和較高的滲透性，在生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)中將其劃分為Ⅱ型藥物。褪黑素作為自由基清除劑及抗氧劑被廣泛用于臨床治療中[7]。盡管口服給藥常作為臨床首選的給藥形式，但褪黑素非常短的生物半衰期（t1/2＜30 min）、多變的影響吸收因素以及強(qiáng)烈的首過效應(yīng)，使口服給藥難以作為MLT理想的遞送方式[8?11]。因此，如何有效地遞送褪黑素成為亟待解決的問題。

皮膚作為最大的潛在給藥組織，經(jīng)皮遞送能夠避免肝臟的清除，并能維持恒定的血藥濃度[12?14]。隱形脂質(zhì)體（stealth liposomes,SLs）是指將藥物包封于脂質(zhì)雙分子層中，并且在成膜材料中加入適量膜軟化劑（主要是表面活性劑膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、吐溫、司盤等）形成的雙層囊泡結(jié)構(gòu)[15?17]。SLs具有高度的變形性及柔韌性，在滲透壓的驅(qū)動(dòng)下，能夠攜載更多的藥物穿過皮膚角質(zhì)層屏障進(jìn)入體內(nèi)，進(jìn)而提高藥物經(jīng)皮遞送的效率[18?19]。以SLs作為經(jīng)皮遞送的載體時(shí)，能夠與皮膚角質(zhì)層發(fā)生融合，易于變形穿過角質(zhì)層屏障，在皮膚表面累積形成濃度梯度，促進(jìn)經(jīng)皮遞送效率，SLs被證明是最有效的藥物經(jīng)皮遞送方式之一。

因此，本研究采用薄膜水化法制備荷載褪黑素的隱形脂質(zhì)體，并采用Franz擴(kuò)散池法對(duì)褪黑素隱形脂質(zhì)體的體外經(jīng)皮滲透試驗(yàn)進(jìn)行了研究，探討褪黑素隱形脂質(zhì)體應(yīng)用于經(jīng)皮遞送的可行性，為褪黑素的應(yīng)用提供新的遞送形式。

1 儀器與材料

1.1 儀器

BT25S電子分析天平（德國Sartorius公司）；LC?10A高效液相色譜儀（蘇州島津分析儀器有限公司）；Nano?S90激光粒度分析儀（英國Malvern公司）；RYJ?6A透皮擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)儀（上海黃海藥檢儀器廠）；3K30超速離心機(jī)（德國Sigma）；RE?52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；JY92?2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技公司）；JEM?1200EX透射電鏡（日本JEOL公司）。

1.2 藥品與試劑

褪黑素（純度98%，批號(hào)：118674，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；褪黑素對(duì)照品（批號(hào)520023?201301，中國食品藥品檢定研究院，純度99.8%）；卵磷脂及膽固醇（上海艾偉拓醫(yī)藥科技有限公司）；脫氧膽酸鈉（純度≥99%，北京索萊寶科技有限公司）；三氯甲烷、乙醇等試劑為分析純。

1.3 動(dòng)物

昆明種小鼠，體質(zhì)量（25±5）g，由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SCXK（魯）20080002。

2 方法與結(jié)果

2.1 褪黑素隱形脂質(zhì)體的制備

采用薄膜水化法制備褪黑素隱形脂質(zhì)體[20]：精密稱取褪黑素20.0 mg、卵磷脂80.0 mg、膽固醇20.0 mg和脫氧膽酸鈉19.0 mg，共同置于圓底燒瓶中，然后加入10 mL三氯甲烷和無水乙醇的混合溶液使完全溶解，于40℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮干有機(jī)溶劑，在瓶壁上形成薄膜，隨后加入10 mL蒸餾水使充分水化，最后采用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)超聲15 min，即得褪黑素隱形脂質(zhì)體。

在隱形脂質(zhì)體的處方中分別去掉褪黑素和脫氧膽酸鈉，同法可相應(yīng)地制備空白隱形脂質(zhì)體及褪黑素普通脂質(zhì)體。

2.2 褪黑素柔性脂質(zhì)體粒徑測(cè)定及形貌觀察

取上述制備好的褪黑素脂質(zhì)體100μL，用超純水稀釋至1 mL，采用激光粒度儀測(cè)定粒徑大小。分別取適量制備好的褪黑素隱形脂質(zhì)體和空白隱形脂質(zhì)體滴加到有碳膜的銅網(wǎng)上，靜止數(shù)分鐘后，用濾紙吸去多余的液體，2%磷鎢鉬酸進(jìn)行負(fù)染，干燥后采用透射電鏡（TEM）觀察所制備褪黑素隱形脂質(zhì)體的外觀形貌。

由圖1A和圖1B的粒徑分布結(jié)果可見：所制備的褪黑素隱形脂質(zhì)體的平均粒徑為（48.87±1.56）nm，PDⅠ為0.203；空白隱形脂質(zhì)體的平均粒徑為（68.77±2.21）nm，PDⅠ為0.260，表明所制備的脂質(zhì)體平均粒徑小于100 nm，且分布較為均勻（PDⅠ＜0.3）。TEM檢測(cè)結(jié)果（圖1C和圖1D）顯示，所制備的脂質(zhì)體呈規(guī)整的圓球狀，無聚集現(xiàn)象。

圖1 隱形脂質(zhì)體的粒徑分布圖及透射電鏡圖Figure 1 The diagrams of the particle size distribution and TEM of MLT SLs

2.3 褪黑素隱形脂質(zhì)體包封率和載藥量測(cè)定

采用超濾離心法測(cè)定褪黑素隱形脂質(zhì)體的包封率和載藥量[21]。精密量取所制備的褪黑素隱形脂質(zhì)體溶液200μL，置于超濾離心管中（截留相對(duì)分子質(zhì)量4 000），在4℃條件下，8 000 r/min離心20 min。精密量取超濾管外管中溶液50μL，加入4.0 mL甲醇，采用HPLC法測(cè)定褪黑素濃度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算褪黑素含量，將其作為游離褪黑素的量。根據(jù)以下公式計(jì)算脂質(zhì)體的包封率（EE）和載藥量（DL）：

其中：M表示隱形脂質(zhì)體中褪黑素總投藥量；M1表示隱形脂質(zhì)體中游離的褪黑素藥物含量；W表示隱形脂質(zhì)體中磷脂、膽固醇、脫氧膽酸鈉及藥物的總質(zhì)量。

結(jié)果表明所制備的褪黑素隱形脂質(zhì)體的包封率和載藥量分別為73.91%和9.92%。

2.4 體外經(jīng)皮滲透試驗(yàn)

2.4.1 離體小鼠皮膚的制備 將昆明小鼠用脫毛膏脫去腹部毛發(fā)后，生理鹽水洗凈，飼養(yǎng)24 h后頸椎脫臼處死，剝離脫毛的腹部皮膚，去除皮下脂肪組織，然后用生理鹽水清洗干凈后待用。

2.4.2 體外經(jīng)皮滲透試驗(yàn) 采用改良的Franz擴(kuò)散池中進(jìn)行體外經(jīng)皮滲透試驗(yàn)。將制備好的小鼠皮膚平鋪在Franz擴(kuò)散池的供給池和接收池中間，用特定的夾子固定，皮膚角質(zhì)層朝向供給池，擴(kuò)散池的有效滲透面積為3.5 cm2，接收池體積為6.5 mL，磷酸鹽緩沖液（pH 7.2~7.4）作為接收介質(zhì)。將Franz擴(kuò)散池放置在藥物透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀支架中，溫度設(shè)置為37℃，攪拌速度維持300 r/min恒速攪拌。然后將1.0 mL褪黑素隱形脂質(zhì)體與褪黑素普通脂質(zhì)體均勻涂布在小鼠皮膚的角質(zhì)層表面，分別在0.5、1、2、3、4、6、8、10、24 h時(shí)取樣，每次取樣體積為3.0 mL，每次取樣后補(bǔ)加等溫度、等量的磷酸鹽緩沖液。

2.4.3 樣品測(cè)定方法及數(shù)據(jù)處理

2.4.3.1 褪黑素紫外吸收波長(zhǎng)的確定 精密稱取褪黑素對(duì)照品5.03 mg置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解后定容至刻度，以甲醇為空白對(duì)照，用紫外分光光度計(jì)在200~400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果表明褪黑素在223 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。

2.4.3.2 褪黑素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取褪黑素4.0 mg，置于50 mL的容量瓶中，加入甲醇溶液后搖勻使充分溶解，定容至刻度，作為儲(chǔ)備液。取儲(chǔ)備液適量，用甲醇稀釋分別制成質(zhì)量濃度為0.010、0.015、0.020、0.030、0.035、0.040 mg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。取上述系列質(zhì)量濃度的褪黑素溶液適量，分別在223 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程A=23.76C-0.075，R2=0.999 4，表明褪黑素在0.01~0.04 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.3.3 精密度及穩(wěn)定性試驗(yàn) 取質(zhì)量濃度分別為10.0、20.0、40.0μg/mL的褪黑素溶液，在223 nm處測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定5次，考察不同質(zhì)量濃度下的精密度。結(jié)果表明所測(cè)得低、中、高3種質(zhì)量濃度褪黑素溶液的RSD均小于2.0%，符合方法學(xué)要求。

取質(zhì)量濃度分別為10.0、20.0、40.0μg/mL的褪黑素溶液，分別于配制后0、4、8、12、24、48、72 h于223 nm處測(cè)定吸光度，結(jié)果表明所測(cè)得低、中、高3種質(zhì)量濃度褪黑素溶液的吸光度RSD值均小于5.0%，符合方法學(xué)要求。

2.4.3.4 體外透皮釋放樣品測(cè)定及數(shù)據(jù)處理 取出的接收液用0.45μm微孔濾膜濾過后，棄去初濾液，續(xù)濾液用于測(cè)定褪黑素的濃度。于223 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算不同時(shí)刻褪黑素脂質(zhì)體經(jīng)皮滲透量。根據(jù)下列公式計(jì)算累積滲透量（Q）、透皮速率常數(shù)（Jss）及滲透系數(shù)（P）：

式中：S為Franz有效擴(kuò)散面積（cm2）；V為接收池中接收液體積（mL）；Ci為第一次至上次取樣時(shí)接收液中藥物質(zhì)量濃度（mg/mL）；Cn為n時(shí)間點(diǎn)測(cè)得的藥物質(zhì)量濃度（mg/mL）：Vi為取樣體積（mL）；V為接收池中的接收液的總體積（mL）。

以褪黑素體外經(jīng)皮的累積滲透量為縱坐標(biāo)、時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制2種類型的褪黑素脂質(zhì)體經(jīng)皮累積滲透量曲線，結(jié)果如圖2所示。對(duì)曲線中的直線部分進(jìn)行線性回歸，計(jì)算滲透動(dòng)力學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表1。

表1 褪黑素脂質(zhì)體體外經(jīng)皮滲透動(dòng)力學(xué)參數(shù)表Table 1 The parameters of in vitro transdermal penetration of melatonin(stealth)liposomes

圖2 褪黑素脂質(zhì)體的體外經(jīng)皮累積釋放量曲線Figure 2 In vitro transdermal penetration profiles of melatonin(stealth)liposomes

可見，褪黑素隱形脂質(zhì)體和普通脂質(zhì)體24h單位面積累積滲透量（Q）分別為0.251 4、0.165 5 mg/cm2，透皮速率常數(shù)（Jss）分別為0.017 6、0.008 7mg/（cm2·h）。結(jié)果表明，與普通脂質(zhì)體組相比，褪黑素隱形脂質(zhì)體單位面積累積滲透量和滲透速率分別提高了1.5倍和2倍，顯示出較快的滲透性。由圖2可知，隨著時(shí)間的推移，隱形脂質(zhì)體的單位面積累積滲透量較普通脂質(zhì)體越來越大。表明將褪黑素制備成隱形脂質(zhì)體可進(jìn)一步提高經(jīng)皮透過效率。

2.5 褪黑素隱形脂質(zhì)體透皮機(jī)制研究

2.5.1 皮膚表面掃描電子顯微鏡（SEM）分析 采用SEM觀察給予褪黑素隱形脂質(zhì)體后對(duì)皮膚角質(zhì)層結(jié)構(gòu)的影響。以生理鹽水作為對(duì)照，分別將生理鹽水和褪黑素隱形脂質(zhì)體涂布于脫毛小鼠背部，12 h后處死小鼠，取下給藥部位的皮膚，置于戊二醛溶液中固定24 h，使用分級(jí)乙醇進(jìn)行脫水干燥，將處理過的皮膚樣品進(jìn)行SEM觀察，結(jié)果見圖3。

圖3 小鼠皮膚角質(zhì)層掃描電鏡圖Figure 3 The SEM pictures of mice stratum corneum

從皮膚表面角質(zhì)層結(jié)構(gòu)來看，對(duì)照組皮膚表面粗糙，角質(zhì)層細(xì)胞呈雜亂層堆狀不規(guī)則排列，角質(zhì)層細(xì)胞間隙不明顯。經(jīng)隱形脂質(zhì)體處理后的皮膚表面比較平整光滑，角質(zhì)層細(xì)胞水化程度較高，細(xì)胞間隙明顯增加。

2.5.2 皮膚結(jié)構(gòu)的差示掃描量熱法（DSC）及紅外光譜（FTⅠR）分析 將經(jīng)生理鹽水和褪黑素隱形脂質(zhì)體處理12 h后的小鼠背部皮膚取下，用研缽研磨（研磨過程中不斷加入液氮，以免皮膚軟化粘連），然后置于冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行凍干，將獲得皮膚凍干粉分別進(jìn)行DSC及FTⅠR測(cè)定。其中DSC測(cè)定條件：測(cè)試溫度設(shè)定為20~250℃，加熱速率為10℃/min，并在氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行測(cè)定。FTⅠR測(cè)定：將皮膚凍干粉與KBr壓片后在400~4 000 cm-1掃描范圍內(nèi)用紅外光譜儀進(jìn)行光譜掃描。結(jié)果見圖4。

從DSC曲線（圖4A）可知，在110~120℃溫度范圍內(nèi)出現(xiàn)角蛋白變性特征峰，與對(duì)照組相比，經(jīng)隱形脂質(zhì)體處理后角蛋白熔點(diǎn)升高，表明角蛋白的螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

從紅外結(jié)果（圖4B）可知，皮膚樣品的紅外特征吸收峰為角質(zhì)層脂質(zhì)峰（νasCH2，νsCH2，νsC=O）和角蛋白峰（酰胺Ⅰ，酰胺Ⅱ）。與對(duì)照組相比，經(jīng)隱形脂質(zhì)體處理后，角質(zhì)層脂質(zhì)峰發(fā)生右移，提示制備脂質(zhì)體所使用的磷脂可以改變角質(zhì)層的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，能夠影響皮膚角質(zhì)層中的脂質(zhì)的流動(dòng)性。

圖4 小鼠皮膚的DSC圖（A）和FTⅠR圖譜（B）Figure 4 The DSC(A)and FTⅠR(B)profiles of mice skin

3 討論

本研究以磷脂、膽固醇及脫氧膽酸鈉為成膜材料，采用薄膜水化法制備荷載褪黑素的隱形脂質(zhì)體，并通過粒度分析及透射電鏡對(duì)所制備的脂質(zhì)體進(jìn)行了表征。結(jié)果顯示所制備的隱形脂質(zhì)體粒徑分布小于100 nm，外觀呈規(guī)則的圓球狀，符合納米載體的特征，同時(shí)具有較高的包封率和載藥量。但荷載褪黑素隱形脂質(zhì)體的粒徑比空白粒徑小，出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因可能與模型藥物褪黑素具有兩親結(jié)構(gòu)有關(guān)。其分子結(jié)構(gòu)中含有親水的酰胺基團(tuán)，另一側(cè)為疏水的苯環(huán)結(jié)構(gòu)，模型藥物本身具有兩親結(jié)構(gòu)，加入后能夠更大程度地降低表面張力，使形成的脂質(zhì)體的粒徑減小。

體外經(jīng)皮滲透試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，褪黑素隱形脂質(zhì)體緩慢釋放，由于內(nèi)源性物質(zhì)的褪黑素分泌后能夠迅速進(jìn)入血液循環(huán)分布到機(jī)體各部分，在體內(nèi)的含量極少，以pg級(jí)（1×10-12g）水平存在，因此推測(cè)痕量的藥物能夠改善睡眠障礙。然而，目前仍缺少有效的評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物睡眠障礙的模型，藥效學(xué)研究尚需在后續(xù)中進(jìn)一步開展。

與褪黑素普通脂質(zhì)體相比較，隱形脂質(zhì)體24 h的單位面積累積滲透量明顯高于普通脂質(zhì)體組，這可能是由于脫氧膽酸鈉插入磷脂雙分子層中間，增加了磷脂分子間的距離，改變了磷脂?；湹捻樞颍黾恿酥|(zhì)膜的流動(dòng)性，使隱形脂質(zhì)體具有高度的變形能力，可以借助于自身發(fā)生形變的能力順利通過皮膚角質(zhì)層。其次，隱形脂質(zhì)體中的磷脂可與皮膚角質(zhì)層中的脂質(zhì)層融合，使角質(zhì)層中的脂質(zhì)組成和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變；此外，隱形脂質(zhì)體可增加角質(zhì)層的水合作用，使角質(zhì)細(xì)胞間隙增大，從而導(dǎo)致皮膚角質(zhì)層的屏障作用發(fā)生逆轉(zhuǎn)，SEM結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，經(jīng)隱形脂質(zhì)體處理后皮膚表面的角質(zhì)層結(jié)構(gòu)細(xì)胞間隙明顯增加，表明隱形脂質(zhì)體可改變皮膚角質(zhì)層的致密結(jié)構(gòu)，為藥物順利通過角質(zhì)層屏障奠定了基礎(chǔ)。由DSC及FTⅠR結(jié)果可知，經(jīng)隱形脂質(zhì)體處理后，皮膚角蛋白和脂質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，表明隱形脂質(zhì)體可通過改變角蛋白的螺旋結(jié)構(gòu)來降低角質(zhì)層的屏障功能，此外皮膚脂質(zhì)中脂質(zhì)?；湹男D(zhuǎn)自由度增加，使皮膚脂質(zhì)的流動(dòng)性增加，繼而導(dǎo)致滲透性增強(qiáng)[22]。

綜上所述，本研究制備荷載褪黑素的隱形脂質(zhì)體并進(jìn)行了體外經(jīng)皮滲透試驗(yàn)，探討了其作為載體促進(jìn)經(jīng)皮吸收的促透機(jī)制，為褪黑素的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供了新的給藥形式，后續(xù)工作將進(jìn)行相關(guān)的藥效學(xué)研究，以期為睡眠障礙提供新的治療策略。