無血清全懸浮PK15細胞培養(yǎng)豬圓環(huán)病毒2型的研究

劉天倫

(北京民海生物科技有限公司，北京 102609)

豬圓環(huán)病毒病是由豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)引起的病毒性傳染病，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失。研究表明，PCV2僅在PK15等少數(shù)哺乳動物細胞上增殖，且由于PCV2感染后細胞不破裂，想要獲得高病毒滴度難度較大[1]。PCV2體外培養(yǎng)特性適于在具有旺盛增殖能力并處于有絲分裂過程中的細胞上復制，并且PCV2的復制依賴于細胞周期S期表達的各種細胞蛋白及酶[1]。D-氨基葡萄糖一方面可以增強細胞S期蛋白的表達，另一方面可以促進病毒DNA進入細胞核，因此，D-氨基葡萄糖處理細胞可顯著增強病毒的增殖能力[2]。

目前，應用PK15細胞進行PCV2的生產(chǎn)主要是采用轉(zhuǎn)瓶和微載體工藝。轉(zhuǎn)瓶存在占地空間大、勞動強度大等缺點。何錫忠等[3]利用微載體技術培養(yǎng)PK15細胞生產(chǎn)PCV2，許冬等[4]對片狀載體培養(yǎng)PCV2也進行了工藝的研究，但微載體工藝存在價格昂貴，球狀載體重復利用效果差，放大培養(yǎng)繁瑣等劣勢。馴化一株可適應大規(guī)模培養(yǎng)且無血清全懸浮培養(yǎng)PCV2的PK15細胞，勢必可推進工藝的進一步升級。本研究對一株貼壁的PK15細胞進行了無血清全懸浮馴化，然后進行了馴化后細胞對PCV2敏感性試驗，對接毒時間、接毒量以及收獲方式進行了試驗分析，以期為大規(guī)模培養(yǎng)PCV2提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和毒株 PK15細胞(豬圓環(huán)病毒1型陰性、豬肺炎支原體陰性)由大北農(nóng)動物醫(yī)學研究中心保存，PCV2(DBN-SX07)由大北農(nóng)動物醫(yī)學研究中心提供。

1.1.2 主要試劑和耗材 無血清懸浮培養(yǎng)基PK15-H(M20317)，上海源培生物有限公司；D-氨基葡萄糖(D-G)，Sigma公司；DMEM-F12(12500-096)，Gibco公司；新生牛血清(04-102-1A)，BI公司；Anti-PCV2-MAB 12c.48(圓環(huán)單克隆抗體)，韓國JBT公司；羊抗鼠熒光抗體購自美國KPL公司。細胞方瓶、搖瓶、96孔板購自美國康寧公司。

1.1.3 主要儀器和設備 CO2培養(yǎng)箱，Thermo公司；軌道式振蕩器購自杭州奧盛儀器有限公司；倒置顯微鏡，Olympus公司；Countstar細胞計數(shù)儀，上海睿鈺生物科技有限公司；低速冷凍離心機，美國Beckman公司。

1.2 方法

1.2.1 PK15細胞無血清全懸浮馴化 對一株貼壁的PK15細胞進行了無血清的全懸浮馴化，經(jīng)貼壁降血清培養(yǎng)、低血清懸浮優(yōu)化傳代、無血清懸浮傳代培養(yǎng)，累計傳代23次后，該株細胞可在無血清全懸浮培養(yǎng)條件下，初始密度為0.5×106/mL時，經(jīng)72 h密度可增殖到4.0×106/mL左右，形態(tài)良好，倍增時間穩(wěn)定，且細胞活率達到95%以上，命名為PK15-S[5]。

1.2.2 PK15-S細胞對PCV2敏感性實驗 參考平面PK15細胞接毒工藝，將馴化后的PK15-S細胞按0.04 MOI接毒，接毒密度為0.5×106/mL，同時加入2% D-G(V/V)，48 h、72 h收獲病毒，收獲后用間接免疫熒光法測定病毒滴度。

1.2.3 不同接毒時間對病毒滴度的影響 細胞初始密度0.5×106/mL，分別采用0 h接毒和24 h接毒的方式進行接毒實驗的摸索，按照0.04 MOI接毒的同時加入2% D-G(V/V)，兩種方法收獲時間分別為病毒培養(yǎng)的48 h和72 h，收獲后用間接免疫熒光法測定病毒滴度。

1.2.4 不同MOI對病毒滴度的影響 分別按0.02 MOI、0.04 MOI、0.1 MOI進行0 h接毒實驗，接毒細胞密度0.5×106/mL，接毒的同時加入2%D-G(V/V)，收獲時間均為72 h，收獲后用間接免疫熒光法測定病毒滴度。

1.2.5 帶毒傳代連續(xù)收獲產(chǎn)毒情況 由于感染PCV2的PK15細胞可帶毒傳代，所以該馴化細胞也進行帶毒傳代，接毒細胞密度0.5×106/mL，按照0.04 MOI接毒，同時加入2% D-G(V/V)，培養(yǎng)72 h后，按傳代比例收獲病毒并帶毒繼續(xù)傳代的方法，連續(xù)收獲三次，收獲后用間接免疫熒光法測定病毒滴度。

1.2.6 病毒滴度的測定

1.2.6.1 收獲液的處理 將搖瓶中收獲的PCV2病毒液反復凍融3次后，1000 r/min離心5 min后取上清液待檢測。

1.2.6.2 檢測 在96孔培養(yǎng)板中每孔加入100 μL用含8%新生牛血清的DMEM-F12生長液制成的濃度為2×105/mL的PK15細胞懸液，待細胞長至24 h左右，棄掉板內(nèi)培養(yǎng)液，把待測的PCV2病毒懸液作10倍系列稀釋，稀釋液為加入含2% D-G的2%新生牛血清的DMEM-F12，每個稀釋度接種6個孔，每個孔100 μL；陰性對照6孔，加入制備好的細胞懸液100 μL；在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h后，取出孔板，棄掉孔內(nèi)培養(yǎng)基，在通風櫥內(nèi)加入200 μL 80%丙酮，放在4 ℃固定1 h后取出孔板，吸去孔內(nèi)丙酮，用PBS洗滌3 次/min，加入圓環(huán)單克隆抗體(工作濃度稀釋倍數(shù))，每孔200 μL，37 ℃孵育1 h，取出用PBS洗滌3 次/min，加入羊抗鼠熒光抗體(工作濃度稀釋倍數(shù))50 μL，37 ℃避光孵育1 h，取出用PBS洗滌后鏡檢觀察，待檢樣品出現(xiàn)綠色熒光為陽性，陰性對照無綠色熒光，按照Reed-Muench法計算病毒滴度。

2 結(jié)果與分析

2.1 PK15細胞無血清全懸浮馴化 該株貼壁PK15細胞，從復蘇到最終馴化成全懸浮PK15-S細胞，經(jīng)過3種培養(yǎng)方法的過渡(表1)，共23次傳代，細胞狀態(tài)良好，活率較高，可凍存保種。為了驗證該馴化細胞的穩(wěn)定性，本實驗又將馴化后凍存細胞再次復蘇，并按初始密度0.5×106/mL連續(xù)傳11代，細胞長勢良好，倍增時間穩(wěn)定，結(jié)果見表2。

表1 訓化過程中的細胞情況

表2 PK15-S細胞復蘇后傳代生長情況

2.2 PCV2對PK15-S細胞敏感性試驗 細胞馴化完成后，需及時進行毒的敏感性試驗，取復蘇后傳代3次的PK15-S細胞進行接毒試驗，毒種滴度為105.5TCID50/mL，細胞初始密度為0.5×106/mL，0 h接毒，經(jīng)過72 h的帶毒培養(yǎng)，細胞仍可增殖至4.24×106/mL，收獲時細胞活率為94.6%，取48 h、72 h收獲液用間接免疫熒光法測定病毒滴度分別為104.5TCID50/mL、106.0TCID50/mL，證實此PCV2對該馴化株PK15-S仍有較好的敏感性，結(jié)果見表3。

表3 PCV2對PK15-S細胞敏感性情況

2.3 不同接毒時間對病毒滴度的影響 為驗證接毒的最佳時間，取兩組復蘇后傳代三次的PK15-S細胞，初始密度都為0.5×106/mL，分別在0 h和24 h進行接毒，分別培養(yǎng)72 h和96 h，兩組試驗在48 h和72 h進行取樣檢測，0 h接毒組病毒滴度分別為104.5TCID50/mL、106.0TCID50/mL，24 h接毒組病毒滴度分別為104TCID50/mL、104.5TCID50/mL，試驗最終收獲時，兩組細胞都有較高的活率，分別為94.6%、97.0%。通過以上數(shù)據(jù)可以得出，該馴化株PK15-S細胞0 h接毒培養(yǎng)滴度優(yōu)于24 h接毒培養(yǎng)滴度，結(jié)果見表4。

表4 接毒時間對病毒滴度的影響

2.4 不同MOI對病毒滴度的影響 三組試驗按不同MOI接毒后，培養(yǎng)72 h，分別在48 h和72 h取樣檢測，0.02 MOI組病毒滴度分別為104.4TCID50/mL、105.4TCID50/mL，0.04 MOI組病毒滴度分別為104.5TCID50/mL、106.0TCID50/mL，0.1 MOI組病毒滴度分別為105.4TCID50/mL、106.4TCID50/mL。由表5可見，細胞培養(yǎng)至72 h后，前兩組細胞密度都超過了4.0×106/mL，細胞活率都在95%左右，最后一組細胞密度和細胞活率都略低于前兩組，密度為3.45×106/mL，活率為90.5%。僅就滴度而言，MOI為0.1時病毒滴度最高，可達106.4TCID50/mL。

表5 MOI對病毒滴度的影響

2.5 帶毒傳代連續(xù)收獲產(chǎn)毒情況 當MOI為0.1時，72 h細胞數(shù)和細胞活率均沒有MOI為0.04的理想，故連續(xù)收獲按照0.04 MOI接毒，接毒時細胞密度為0.5×106/mL，培養(yǎng)72 h后，按傳代比例收獲病毒并帶毒繼續(xù)傳代的方法，在顯微鏡下觀察帶毒傳代細胞，細胞狀態(tài)良好，輪廓清晰可見，結(jié)果見圖1；連續(xù)收獲三次，收獲樣品用間接免疫熒光法測定病毒滴度分別為106.0TCID50/mL、106.25TCID50/mL、106.5TCID50/mL，三個代次收獲的病毒液滴度均達到預期，結(jié)果見表6，可采用連續(xù)收獲方式進行病毒的收獲。

圖1 帶毒傳代細胞狀態(tài)顯微觀察(TB染色，40×)

表6 帶毒傳代連續(xù)收獲產(chǎn)毒情況

3 討論與結(jié)論

目前大規(guī)模培養(yǎng)PCV2的方法主要有轉(zhuǎn)瓶和生物反應器微載體培養(yǎng)。轉(zhuǎn)瓶工藝存在勞動強度大，需要溫室配合，單位面積細胞可用率低等缺點，隨著工藝的提升，滾瓶工藝也將逐漸被淘汰；微載體工藝雖說提升了細胞密度，也增加了培養(yǎng)基的使用效率，批間差異小，培養(yǎng)條件可控，但仍存在成本控制、放大傳代消化等問題，且兩種工藝均需要血清的添加，血清的添加不但使成本增加又存在血清的批間差異大、外源病毒引入、下游純化去除等問題。因此，馴化一株可無血清全懸浮培養(yǎng)的PK15細胞用于培養(yǎng)PCV2可以將工藝進一步提升。

本文將一株貼壁PK15細胞經(jīng)過3種培養(yǎng)方法的馴化，將其馴化為可全懸浮無血清培養(yǎng)的PK15細胞并命名為PK15-S，然后進行了PCV2接毒條件的摸索，對接毒時間、MOI、收獲時間以及收獲方式進行了試驗分析。試驗結(jié)果表明，該細胞培養(yǎng)PCV2，采用批次收獲時，接毒時細胞密度為0.5×106/mL，添加2% D-G，接毒量為0.1 MOI，收毒時間為接毒后72 h，病毒滴度為106.4TCID50/mL；但如果采用連續(xù)收獲，接毒和傳代時均使細胞密度為0.5×106/mL，添加2% D-G，接毒量為0.04 MOI，收毒時間為接毒后72 h，連續(xù)收獲3代，病毒滴度分別為106.0TCID50/mL、106.25TCID50/mL、106.5TCID50/mL，病毒滴度和收獲液體積較為理想。

通過本試驗可知，帶毒傳代的細胞在需要傳代的72 h，細胞密度分別為4.24×106/mL、2.93×106/mL、2.41×106/mL，細胞密度呈降低趨勢，除了第一代帶毒細胞外，第二代、第三代均并未達到預期傳代密度，雖說PK15感染PCV2后并不引起細胞的病變，但在本試驗中隨著帶毒傳代的次數(shù)增加，病毒對細胞的生長的確造成了一定的影響，說明仍需對帶毒傳代細胞的培養(yǎng)環(huán)境進行優(yōu)化和改良，這也意味著第二代、第三代的病毒收獲液體積的減少，在實際生產(chǎn)中將會造成產(chǎn)量下降問題。但就整體工藝而言，該株馴化PK15細胞培養(yǎng)PCV2的接毒培養(yǎng)條件和收獲方式存在一定可操作性，可為大規(guī)模培養(yǎng)PCV2提供數(shù)據(jù)支撐。