馬波沙星注射液無菌檢查方法的建立

趙富華，于曉輝，楊 星，龔旭昊，馬秋冉，董玲玲

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

馬波沙星作為第三代喹諾酮類抗菌藥物，具有抗菌譜廣，消除半衰期長，生物利用度高的特點(diǎn)，在獸藥市場具有良好的發(fā)展前景，國內(nèi)企業(yè)自2014年起陸續(xù)申報(bào)馬波沙星及其制劑，擬在《中國獸藥典》2020年版中制定馬波沙星及制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。為控制產(chǎn)品質(zhì)量，需對馬波沙星注射液進(jìn)行無菌檢查方法的研究[1-2]。馬波沙星具有抑菌作用，所以擬采用薄膜過濾法對馬波沙星注射液的無菌檢查進(jìn)行方法學(xué)研究[3-5]。

1 材料與儀器

1.1 樣品 馬波沙星注射液(河北遠(yuǎn)征藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：100 mL:10 g，批號為16B180301、16B180302、16B180303)。

1.2 稀釋劑及培養(yǎng)基 0.1%無菌蛋白胨水溶液、硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基(批號20180710)、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(批號20180710)、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(批號20180710)、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(批號20180710)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(批號20180710)，均由北京中海生物科技有限公司提供。

1.3 菌種 金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、生孢梭菌[CMCC(B)64941]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]，均購自中國藥品生物制品檢定研究院。

1.4 試驗(yàn)儀器 HTY-1650AG3型無菌隔離器(浙江泰林生物技術(shù)股份有限公司)、無菌試驗(yàn)集菌培養(yǎng)器(浙江泰林生物技術(shù)股份有限公司，型號：EVS3，批號：20170812)、生物安全柜(美國Nuaire公司)、SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、GI7-2型恒溫培養(yǎng)箱(美國Shellab公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液的制備 分別取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽胞桿菌、大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物1白金耳，接種于10 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，經(jīng)30～35 ℃培養(yǎng)18～24 h，取1 mL分別加入9 mL pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，作為10-1管，逐管10倍稀釋至小于100 cfu/mL，活菌計(jì)數(shù)備用。

取生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物1白金耳，接種于10 mL硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，經(jīng)30～35 ℃培養(yǎng)18～24 h，取1 mL加入9 mL pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，作為10-1管，逐管10倍稀釋至小于100 cfu/mL，活菌計(jì)數(shù)備用。

取白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物1白金耳，接種于10 mL沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，經(jīng)20～25 ℃培養(yǎng)24～48 h，取1 mL加入9 mL pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，作為10-1管，逐管10倍稀釋至小于100 cfu/mL，活菌計(jì)數(shù)備用。

接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，20～25 ℃培養(yǎng)5～7 d，加入3～5 mL含0.05%聚山梨酯80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，將孢子洗脫，吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，取1 mL加入9 mL 含0.05%聚山梨酯80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，作為10-1管，逐管10倍稀釋至小于100 cfu/mL，活菌計(jì)數(shù)備用。

2. 2 活菌計(jì)數(shù) 分別取上述細(xì)菌菌液1 mL加入培養(yǎng)皿，每種菌液做2個平皿，注入胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基約18 mL，置30～35 ℃培養(yǎng)24～48 h。取生孢梭菌菌液1 mL，置于200 mL硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，置30～35 ℃培養(yǎng)24～48 h。分別取上述真菌菌液1 mL加入培養(yǎng)皿，每種菌液做2個平皿，注入沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基約18 mL，置20～25 ℃培養(yǎng)48～72 h。計(jì)數(shù)結(jié)果見表1。

表1 活菌計(jì)數(shù)結(jié)果

2. 3 培養(yǎng)基的靈敏度檢查 取每管裝量為12 mL的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基7支，分別接種小于100 cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單孢菌、生孢梭菌各2支，另1支不接種作為空白對照，培養(yǎng)3 d。另取每管裝量為9 mL的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基7支，分別接種小于100 cfu的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接種作為空白對照，培養(yǎng)5 d。以空白對照管應(yīng)無菌生長，加菌的培養(yǎng)基管生長良好來判定該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定。試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 培養(yǎng)基靈敏度檢查結(jié)果

經(jīng)檢查，空白對照管均無菌生長，加菌培養(yǎng)基生長良好，該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定。

2.4 無菌檢查方法適用性試驗(yàn)(薄膜過濾法)

2.4.1 供試品陽性菌試驗(yàn)組 取供試品10支，每支取20 mL，用封閉式薄膜過濾器過濾后，用0.1%無菌蛋白胨水溶液沖洗濾膜，每膜每次100 mL，沖洗6次，在最后一次沖洗液中分別加入小于100 cfu/mL的菌液1 mL，過濾后，每個濾筒內(nèi)灌注培養(yǎng)基，其中金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌在硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30～35 ℃條件下培養(yǎng)5 d，枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉在胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，20～25 ℃條件下培養(yǎng)5 d，各2組。

2.4.2 陽性菌對照組 取封閉式濾筒，其中三濾筒加入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，分別接種小于100 cfu/mL的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌各1 mL，30～35 ℃條件下培養(yǎng)5 d；另三筒加入胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，分別接種小于100 cfu/mL的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉1 mL，20～25 ℃條件下培養(yǎng)5 d。

2.4.3 供試品陰性組 取供試品10支，每支取20 mL，用封閉式薄膜過濾器過濾后，用0.1%無菌蛋白胨水溶液沖洗濾膜，每膜每次100 mL，沖洗6次，再分別加入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，置規(guī)定溫度下培養(yǎng)5 d。

2.4.4 陰性對照組 取封閉式濾筒2個，用0.1%無菌蛋白胨水溶液沖洗，沖洗次數(shù)與沖洗量與試驗(yàn)組相同，向?yàn)V筒中分別加入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，置規(guī)定溫度下培養(yǎng)5 d。

2.4.5 方法適用性試驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果表明(表3、表4)，本品采用薄膜過濾后，含供試品的陽性菌試驗(yàn)組沖洗6次時試驗(yàn)菌均生長良好，表明沖洗6次后，供試品對細(xì)菌生長沒有影響。

表3 供試品陽性菌試驗(yàn)組與陽性菌對照組試驗(yàn)結(jié)果

表4 供試品陰性組與陰性對照組試驗(yàn)結(jié)果

2.4.6 供試品無菌檢查 取三批供試品，按照驗(yàn)證過的無菌檢驗(yàn)方法進(jìn)行檢查。結(jié)果顯示，陽性對照菌在24 h內(nèi)生長良好，陰性對照14 d內(nèi)均澄清，無菌生長，供試品14 d內(nèi)均澄清，無菌生長，無菌檢查結(jié)果符合規(guī)定。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)依據(jù)《中國獸藥典》2015年版一部附錄1101無菌檢查法方法適用性試驗(yàn)的要求[6](亦符合《中國獸藥典》2020年版一部附錄1101的要求)，對馬波沙星注射液無菌檢查方法進(jìn)行驗(yàn)證，因馬波沙星具有抑菌作用，故采用薄膜過濾法，考察沖洗次數(shù)，用0.1%無菌蛋白胨水溶液沖洗濾膜，每膜每次100 mL，沖洗3、4、5次，結(jié)果沖洗3、4、5次時，除白色念珠菌和黑曲霉供試品陽性生長外，其他供試品陽性菌均無菌生長，說明沖洗5次時供試品還有抑菌作用，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定沖洗6次，結(jié)果與陽性菌對照組相比，供試品陽性菌試驗(yàn)組生長情況均良好，說明該條件下能夠有效清除藥物自身的抑菌活性且不影響試驗(yàn)菌的生長，而供試品陰性對照組與陰性對照組中均無細(xì)菌生長，說明前處理及操作過程中不會引入其他細(xì)菌的污染。最終確立檢查方法為：取本品，經(jīng)薄膜過濾法處理，依法檢查(附錄1101)，應(yīng)符合規(guī)定。具體操作步驟：供試品取10支，每支取20 mL，用0.1%無菌蛋白胨水溶液沖洗濾膜，每膜每次100 mL，沖洗6次，該方法科學(xué)、可靠，在該無菌檢查條件下可去除藥物的抑菌干擾。

薄膜過濾法可用于馬波沙星注射液的無菌檢查。在做馬波沙星注射液無菌檢查時，一定要注意沖洗次數(shù)，否則易致試驗(yàn)失敗(供試品陽性菌不生長)。