超高效液相色譜-二極管陣列-串聯(lián)四極桿靜電軌道阱質(zhì)譜法對(duì)桿菌肽組分的分析

嚴(yán) 鳳,吳劍平,王 博,張 婧,曹 瑩

(上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,上海 201103)

桿菌肽(bacitracin) 是由枯草桿菌和地衣芽孢桿菌產(chǎn)生的一系列抗菌肽的混合物，是一種非核糖體肽,由氨基酸和特殊的或修飾過的氨基酸通過“硫模板多聚酶機(jī)制(thiotemplatemuhienzymemechanism)”的多功能酶復(fù)合系統(tǒng)合成的一類肽類次級(jí)代謝產(chǎn)物[1]。桿菌肽具有特殊的抑菌機(jī)制，會(huì)干擾細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，同時(shí)在肽聚糖的合成中抑制磷脂受體的再生[2]，使得其具有抗菌譜廣、不易產(chǎn)生耐藥性等特性。桿菌肽還是一個(gè)重要的飼料添加劑，5～100 mg/kg濃度可促進(jìn)家禽和牲畜對(duì)食物的利用以增重，是目前國內(nèi)外廣泛用于飼料中的一種具有促生長作用的理想抗生素[3]，但隨著養(yǎng)殖業(yè)減抗，禁抗的全面推進(jìn)，從2020年7月起，桿菌肽已經(jīng)禁止用于飼料添加劑。桿菌肽主要由12個(gè)氨基酸組成[4]至少有7種同系物，包括桿菌肽A、B(B1、B2、B3)、C(C1、C2、C3)、E、F等，其中桿菌肽A為主要活性組分[5-6]。桿菌肽A在堿性條件下可自發(fā)氧化，形成沒有抗菌活性的桿菌肽F組分[7]?！吨袊幍洹?2015版)[8]中桿菌肽含量的測定方法為微生物檢定法，藥典法測定的是桿菌肽中的總活性成分，未對(duì)各成分含量進(jìn)行分別測定。由于桿菌肽組分多，對(duì)其分離具有較大的難度，國外藥典[9-11]多采用高效液相色譜分析桿菌肽的組分及有關(guān)物質(zhì)。由于是發(fā)酵產(chǎn)品，桿菌肽成分組成相似且非常復(fù)雜，其組分分析是質(zhì)量評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制的核心內(nèi)容，而復(fù)雜的多組分體系使得分析方法的開發(fā)十分困難。超高效液相色譜-二極管陣列-串聯(lián)四級(jí)桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜，分離效率高，分辨率高，靈敏度高，可同時(shí)精確地采集母離子質(zhì)荷比和碎片離子質(zhì)量數(shù)，能夠顯著提高復(fù)雜體系中化學(xué)成分的快速分析鑒定能力。高分辨質(zhì)譜技術(shù)因其特有的優(yōu)勢在藥物分析研究中發(fā)揮日益重要的作用，在藥物質(zhì)量研究領(lǐng)域得到越來越多的應(yīng)用[12-13]。本文建立超高效液相色譜-二極管陣列-串聯(lián)四級(jí)桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜分析桿菌肽中的組分，發(fā)揮高分辨質(zhì)譜的優(yōu)勢準(zhǔn)確地測得桿菌肽各組分精確質(zhì)荷比，計(jì)算出各組分的元素組成，并能區(qū)分復(fù)雜背景中質(zhì)量數(shù)接近的雜質(zhì)及共流出組分，結(jié)合二極管陣列檢測器可以不經(jīng)復(fù)雜的分離和純化步驟即可獲得樣品的色譜和質(zhì)譜信息，是一種可以針對(duì)目標(biāo)或非目標(biāo)多組分藥物研究的有力工具，為其質(zhì)量控制和工藝優(yōu)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 Dionex Ultimate 3000 diode array detector(DAD)-Q Exactive，Xcalibur 2.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國Thermo Scientific 公司)，Mass Frontier軟件(美國Thermo Scientific 公司)

桿菌肽標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，Dr.Ehrenstorfer Gmbh，批號(hào)：991436，含量81.9%；桿菌肽供試品，批號(hào)1-SAM-144-1。乙腈、甲酸(色譜純)，水為超純水(Milli-Q 儀制備)。

1.2 溶液配制 精密稱取桿菌肽標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品及供試品10 mg，分別于50 mL棕色容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度。

1.3 方 法

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex C18100 mm×2.1 mm，粒徑2.6 μm流動(dòng)相: 0.1%甲酸溶液(A)-0.1%甲酸甲醇乙腈(75+25)溶液(B)；流速0.3 mL/min，采用梯度洗脫程序(表1)；柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL；紫外吸收波長254 nm。

表1 梯度洗脫程序

1.3.2 質(zhì)譜條件 離子源為HESI源，霧化氣40 arb；輔助氣10 arb；噴霧電壓3500V(+)/3000V(-)；離子傳輸毛細(xì)管溫度320 ℃；輔助氣溫度350 ℃；掃描模式：正離子模式Full MS/dd-MS2，F(xiàn)ull MS分辨率70000，dd-MS2分辨率17500，掃描范圍m/z150～1450。MS/MS 模式時(shí)，歸一化階梯碰撞能量：20%、40%和60%。

2 結(jié)果與分析

2.1 定性結(jié)果

2.1.1 桿菌肽A 桿菌肽A分子式C66H103N17O16S，保留時(shí)間20.71 min。桿菌肽是一種多肽類抗生素，多肽類藥物在質(zhì)譜中會(huì)帶有多個(gè)電荷，桿菌肽A在質(zhì)譜中除了有[M+H]+1422.75622峰外，同時(shí)還有[M+2H]2+711.88175和[M+3H]3+474.92359的加和離子峰，而且[M+2H]2+[M+3H]3+在質(zhì)譜中的響應(yīng)值均優(yōu)于[M+H]+，見圖1。桿菌肽A的主要碎片離子有110.07112、199.08996、227.08487、356.12747、869.46281、982.54688。

圖1 桿菌肽A質(zhì)譜圖(1)和紫外吸收光譜圖(2)

2.1.2 桿菌肽B 桿菌肽B分子式C65H101N17O16S比桿菌肽A少一個(gè)CH2，母離子精確質(zhì)量[M+H]+為1408.667。桿菌肽B有3個(gè)同分異構(gòu)體,分別為B1(保留時(shí)間12.47 min)、B2(保留時(shí)間14.29 min)和B3(保留時(shí)間19.44 min)。桿菌肽B在質(zhì)譜中 [M+2H]2+704.87392和[M+3H]3+470.25171的加和離子峰響應(yīng)更強(qiáng)，見圖2。主要碎片離子有110.07112、199.08996、227.08487、356.12747、869.46821、852.43626。

圖2 桿菌肽B質(zhì)譜圖(1)和紫外吸收光譜圖(2)

2.1.3 桿菌肽C 桿菌肽C分子式C64H99N17O16S，比桿菌肽A少兩個(gè)CH2，母離子精確質(zhì)量[M+H]+為1394.72492、[M+2H]2+697.86610和[M+3H]3+465.57982，其中[M+3H]3+在質(zhì)譜中的響應(yīng)最強(qiáng)，見圖3。桿菌肽C也存在C1、C2和C3三個(gè)同分異構(gòu)體，保留時(shí)間分別為6.91 min、10.11 min和11.68 min，見圖3。主要碎片離子有110.07112、199.08996、227.08487、356.12747、400.16155、838.42061。

圖3 桿菌肽C質(zhì)譜圖(1)和紫外吸收光譜圖(2)

2.1.4 桿菌肽E 桿菌肽E分子式C63H97N17O16S，比桿菌肽A少三個(gè)CH2，母離子精確質(zhì)量[M+H]+為1380.70927，[M+2H]2+690.85827和[M+3H]3+460.90794，其中[M+3H]3+在質(zhì)譜中的響應(yīng)最強(qiáng)，由于含量較低，實(shí)際在樣品中主要是二價(jià)和三價(jià)質(zhì)譜峰，見圖4。主要碎片離子有199.08996、110.07112、227.08487。

圖4 桿菌肽E質(zhì)譜圖(1)和紫外吸收光譜圖(2)

2.1.5 桿菌肽F 桿菌肽F分子式C66H98 N16O17S，桿菌肽A在堿性條件下可發(fā)生降解，N-端噻唑結(jié)構(gòu)氧化成噻唑酮結(jié)構(gòu)，形成沒有抗菌活性，但是具有腎毒性的桿菌肽F[14]。桿菌肽F母離子精確質(zhì)量[M+H]+為1419.90893，[M+2H]2+710.35810和[M+3H]3+473.90783，其中[M+2H]2+在質(zhì)譜中的響應(yīng)最強(qiáng)，見圖5。主要碎片離子有110.07112、214.05190、281.13183。

圖5 桿菌肽F質(zhì)譜圖(1)和紫外吸收光譜圖(2)

2.1.6 定性結(jié)果匯總 采用本方法共測到9個(gè)桿菌肽組分，其中含有多個(gè)同分異構(gòu)體，桿菌肽不同結(jié)構(gòu)間的差異主要是N-端噻唑結(jié)構(gòu)部分R位點(diǎn)的不同，以及X和Y位置上接的是L-異亮氨酸還是L-纈氨酸的差異[14]，結(jié)構(gòu)通式見圖6。各組分結(jié)構(gòu)組成不同在色譜保留行為上也有一定的差異，見圖7，同時(shí)結(jié)合高分辨質(zhì)譜測得不同的母離子精確質(zhì)量,可對(duì)各組分進(jìn)行準(zhǔn)確定性(表2)。

圖6 桿菌肽A結(jié)構(gòu)通式

圖7 桿菌肽各組分分子離子色譜峰(1)和紫外色譜峰(2)

2.2 定量結(jié)果 按照獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)匯編(2013年)[15]中桿菌肽預(yù)混劑的組分用液相色譜法測定規(guī)定桿菌肽A不小于35%，桿菌肽(A+B1+B2+B3)不小于70.0%，桿菌肽(C1+C2+C3)不大于20.0%，桿菌肽F不大于13%。本方法通過紫外串聯(lián)質(zhì)譜檢測器進(jìn)行同時(shí)測定，通過紫外歸一化法計(jì)算各組分均符合獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)規(guī)定。本方法以[M+3H]3+測定各組分分子離子的峰面積，嘗試采用各組分的分子離子峰面積與所有組分峰面積總和的占比進(jìn)行質(zhì)譜歸一化計(jì)算，結(jié)果表明與紫外歸一化法測定結(jié)果較一致，測定結(jié)果見表3。

表3 桿菌肽各組分質(zhì)譜歸一化與紫外歸一化測定結(jié)果

3 討 論

3.1 流動(dòng)相的選擇 本方法比較了50 mM乙酸銨溶液-乙腈、含0.1%甲酸的水溶液-含0.1%甲酸的乙腈溶液和含0.1%甲酸的水溶液-含0.1%甲酸的甲醇-乙腈(75∶25)溶液三種流動(dòng)相體系，發(fā)現(xiàn)在含有甲酸的流動(dòng)相條件下，桿菌肽及其相關(guān)物質(zhì)的分離度更好，桿菌肽B在乙腈-乙酸銨體系中分離率不高，見圖8，因此,方法最終選用含0.1%甲酸的水溶液-含0.1%甲酸的甲醇-乙腈(75∶25)溶液的流動(dòng)相體系。

圖8 桿菌肽B在兩種相體系中的分離效果((1)：乙腈-乙酸銨流動(dòng)相體系；(2)：乙腈-甲酸流動(dòng)相體系；(3)：甲醇乙腈-甲酸流動(dòng)相體系)

3.2 多價(jià)態(tài)的選擇 桿菌肽是一種多肽類抗生素，多肽類藥物在質(zhì)譜中會(huì)帶有多個(gè)電荷，多價(jià)態(tài)加和離子峰的存在是多肽類物質(zhì)在質(zhì)譜中呈現(xiàn)的一大特征。桿菌肽各組分在質(zhì)譜中除了有[M+H]+峰，同時(shí)還有[M+2H]2+和[M+3H]3+的加和離子峰，而且[M+H]+峰的質(zhì)譜響應(yīng)往往是最低的。桿菌肽A、B、C、E組分在質(zhì)譜中以[M+3H]3+分子離子峰的響應(yīng)最強(qiáng)，而桿菌肽F則以[M+2H]2+分子離子峰的響應(yīng)最強(qiáng)。因?yàn)閹Ф鄠€(gè)電荷，因此多價(jià)態(tài)加和離子峰的同位素峰也有一定的特征性。通常情況下，目標(biāo)化合物在質(zhì)譜中帶1個(gè)電荷，[M+H]+就是質(zhì)量數(shù)/電荷數(shù)即m/z，桿菌肽會(huì)出現(xiàn)帶2個(gè)電荷數(shù)，因此會(huì)出現(xiàn)(m+2)/2即[M+2H]2+的質(zhì)荷比。同樣，帶3個(gè)電荷的質(zhì)荷比數(shù)[M+3H]3+就是(m+3)/3。同位素峰的質(zhì)荷比也是同樣的計(jì)算方法，因此,帶2個(gè)電荷的同位素峰之間的質(zhì)荷比相差約0.5 Da，帶3個(gè)電荷的同位素峰之間的質(zhì)荷比相差約0.33 Da。

3.3 桿菌肽B桿菌肽C的結(jié)構(gòu)驗(yàn)證 桿菌肽組分B和C均存在同分異構(gòu)體，對(duì)于B1、B2、B3和C1、C2、C3的定位參考了張含智等[2]的報(bào)道，本方法結(jié)合碎片分析對(duì)各同分異構(gòu)體可進(jìn)一步定性確證。桿菌肽的結(jié)構(gòu)通式見圖6，不同的桿菌肽組分在X及Y位點(diǎn)的氨基酸有所不同。經(jīng)質(zhì)譜碎裂在Y位點(diǎn)的氨基酸肽鍵斷裂產(chǎn)生氨基酸環(huán)的碎片，根據(jù)氨基酸環(huán)X位點(diǎn)的不同,氨基酸區(qū)分出含L-Ile的碎片869.46821和852.43626為B1、B3和C2，X位點(diǎn)上接L-Val的碎片855.44716和838.42061為C1、C2和B2。

桿菌肽結(jié)構(gòu)中從左至右第一、第二個(gè)氨基酸分別為L-Leu和L-Glu，這兩個(gè)氨基酸之間的肽鍵斷裂之后產(chǎn)生的碎片1111.58947和1097.57382，L-Glu與Y位點(diǎn)氨基酸之間的肽鍵斷裂進(jìn)一步產(chǎn)生碎片982.54688和968.53123均是帶有Y位點(diǎn)的特征碎片，可用于區(qū)分B1和B2、B3。同理?xiàng)U菌肽C在這兩個(gè)肽鍵處斷裂之后產(chǎn)生1097.57382、1083.55817和968.53123、954.51558的碎片，可以區(qū)分出C3和C1、C2。通過這些實(shí)際產(chǎn)生的特征碎片結(jié)合碎裂機(jī)理確證了B和C的同分異構(gòu)體。各同分異構(gòu)體的特征性碎片見表4，結(jié)構(gòu)式見圖9、圖10、圖11。

圖9 桿菌肽B1、B2、B3的特征碎片信息

圖10 桿菌肽C1、C2、C3的特征碎片信息

圖11 桿菌肽B、C碎片分子結(jié)構(gòu)式(K：869.46821；L：855.44716；M：982.54688；N：1111.58947；P1、P2：968.53123；Q1、Q2：1097.57382；G：954.51558；H：1083.55817)

表4 桿菌肽B和C的同分異構(gòu)體產(chǎn)生的特征性碎片

3.4 桿菌肽各組分在質(zhì)譜中的響應(yīng) 本方法采用二極管陣列檢測器串聯(lián)質(zhì)譜檢測器的形式對(duì)桿菌肽各組分在質(zhì)譜中的響應(yīng)與紫外響應(yīng)作了對(duì)比，通過紫外歸一化計(jì)算和質(zhì)譜峰面積歸一化計(jì)算發(fā)現(xiàn)，兩種計(jì)算結(jié)果偏差在0.01%～3.53%之間，表明桿菌肽在二極管陣列檢測器中的響應(yīng)與在質(zhì)譜檢測器中的響應(yīng)成正比，且在質(zhì)譜中的檢測靈敏度更好，雜質(zhì)E和F在紫外中幾乎無響應(yīng)，但在質(zhì)譜中的響應(yīng)仍然明顯?！稓W洲藥典》9.0版[9]、《英國藥典》2017 年版[10]及《美國藥典》40 版[11]中規(guī)定的主要成分為桿菌肽A，有效活性成分為桿菌肽A、B1、B2、B3，桿菌肽各組分在質(zhì)譜中響應(yīng)強(qiáng)度與活性程度成正比。

本研究表明，同時(shí)串聯(lián)使用超高效液相色譜、二極管陣列檢測器與高分辨質(zhì)譜檢測器對(duì)復(fù)雜組分原料藥物分析具有十分重要的意義，可同時(shí)提供光譜與質(zhì)譜的定性定量數(shù)據(jù)，可在一定程度上減少傳統(tǒng)原料組分分析工作中所必須的分離純化工作，并能在已知化合物組分結(jié)構(gòu)的前提下完成對(duì)各組分的歸一化分析，而且從本研究結(jié)果看，質(zhì)譜與紫外所測定定量結(jié)果基本保持一致，驗(yàn)證了該方法的合理性。

本方法建立了紫外串接四級(jí)桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜分析桿菌肽中的組分，檢測靈敏度高，特異性強(qiáng)，檢測到桿菌肽中包括主成分在內(nèi)的9個(gè)組分。根據(jù)母離子精確質(zhì)量和二級(jí)碎片推測可能的結(jié)構(gòu)，并能確定組分中的同分異構(gòu)體。利用超高效液相-二極管陣列-串聯(lián)四級(jí)桿靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜檢測和鑒定多組分藥物的結(jié)構(gòu)將會(huì)有更廣泛的應(yīng)用。