5種塞內(nèi)卡病毒滅活疫苗佐劑的比較研究

李曉艷，齊志濤，王秉昆，趙麗霞，溫學(xué)平，李 超，方建國，高艷華，楊青春，賀 瑤，張 靜，宋慶慶，陳 堅(jiān)

(金宇保靈生物藥品有限公司，呼和浩特 010100)

塞內(nèi)卡病毒病是近年來新發(fā)的一種豬傳染病，由小核糖核酸病毒科塞內(nèi)卡病毒屬的 A 型塞內(nèi)卡病毒(Senecavirus A，SVA)引起[1]。SVA在 2002 年首次發(fā)現(xiàn)于細(xì)胞培養(yǎng)基中，被認(rèn)為可能是由胎牛血清或豬胰蛋白酶引入人類胎兒視網(wǎng)膜細(xì)胞培養(yǎng)物中的污染物[2]。2015年我國廣東首次發(fā)現(xiàn)SVA的存在，隨后逐漸蔓延至其他省份。豬感染SVA后的臨床表現(xiàn)與感染口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)類似，通常表現(xiàn)為沉郁、體溫升高、厭食、跛行、蹄部和鼻吻出現(xiàn)水皰[1],臨床上難以區(qū)分。SVA感染的診斷目前主要依賴于病原學(xué)和血清學(xué)方法，防控方面仍無商品化疫苗可用。另外，隨著SVA在我國的傳播，其毒力也逐漸致弱，目前國內(nèi)豬場已頻繁出現(xiàn)亞臨床感染情況[3]。我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部2018年發(fā)布了《農(nóng)業(yè)農(nóng)村部辦公廳關(guān)于做好SVA病防治工作的通知》，可見對(duì)該疫病的重視程度。在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、提升病毒效價(jià)、優(yōu)化純化工藝的同時(shí)，佐劑的選擇也是疫苗制備的關(guān)鍵因素。因此，本試驗(yàn)通過自主合成佐劑原料、篩選最優(yōu)佐劑配方，制備了SVA滅活疫苗，并與進(jìn)口佐劑(ISA206)疫苗進(jìn)行理化性質(zhì)、安全性、中和抗體及攻毒保護(hù)對(duì)比試驗(yàn)，以期篩選最優(yōu)佐劑用于SVA滅活疫苗的研制。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 塞內(nèi)卡病毒SVV-CH/ZZ/2016株滅活抗原液，批號(hào)2021003，病毒含量108.0TCID50/0.1mL；用于做中和試驗(yàn)的病毒液SVV-CH/ZZ/2016株、攻毒毒株SVV-CH/22/2016株，F(xiàn)7，批號(hào)19023，病毒含量106.5TCID50/0.1mL;PK-15細(xì)胞(豬腎細(xì)胞);塞內(nèi)卡病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和陰性血清;以上均由金宇保靈生物藥品有限公司獸用疫苗國家工程實(shí)驗(yàn)室制備保存。體重18～22 g清潔級(jí)小鼠30只，購自呼和浩特市內(nèi)蒙古大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部；90日齡以上架子豬12頭，60日齡以上架子豬30頭，購自呼和浩特市草原立新養(yǎng)豬場；ISA206佐劑購自法國賽比科公司，批號(hào)200218023298；佐劑制備原料：失水山梨醇購自山東天力藥業(yè)有限公司，批號(hào)202000312；植物油酸購自四川西普化工股份有限公司。美國貝克曼粒經(jīng)儀LS-230購自常州昆耀自動(dòng)化科技有限公司，二級(jí)生物安全柜購自香港力申發(fā)展有限公司；水浴鍋HH-420購自常州智博瑞儀器制造有限公司；二氧化碳培養(yǎng)箱，Thermo Fisher 14291；IKA EUROSTAR 60control懸臂攪拌器、攪拌槳R1345購自艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司。

1.2 佐劑制備

1.2.1 親油性表面活性劑的制備[4]將已蒸餾的失水山梨醇與植物油酸分階段投入反應(yīng)釜內(nèi)，加入催化劑，升溫，開啟攪拌釜至均勻攪拌，隨后減壓升溫于205±5 ℃/700 mmHg以上反應(yīng)5 h。反應(yīng)完畢后待反應(yīng)物冷卻放出，靜置24 h分去黑色膠狀物，將上層澄清液抽入脫色鍋內(nèi)加熱至65 ℃，加入催化劑，繼而在攪拌下于80 ℃脫色1 h，過濾，即得親油性表面活性劑。

1.2.2 親水性表面活性劑的制備 將親油性表面活性劑加入不銹鋼反應(yīng)釜中，加熱熔化，攪拌，加入催化劑，逐漸升溫，減壓脫水，當(dāng)溫度上升至120 ℃通氮?dú)?，以?qū)除釜內(nèi)空氣，經(jīng)數(shù)次充氮驅(qū)氧后開始通入環(huán)氧乙烷，當(dāng)反應(yīng)溫度至180 ℃，通入的環(huán)氧乙烷接近需求量時(shí)，取樣測定終點(diǎn)，然后降溫至80 ℃左右時(shí)加入催化劑，20 min后進(jìn)行升溫脫水15 min，繼續(xù)攪拌1 h，冷卻，放料，得到親水性表面活性劑。

1.2.3 佐劑合成 按照表1佐劑成分配比所示，分別量取相應(yīng)成分，混合加入燒杯或佐劑配制罐內(nèi)，升溫至45 ℃開啟攪拌槳?jiǎng)蛩贁嚢?，充分溶解和混合油相至澄清透明狀，分別裝入透氣性瓶內(nèi)于121 ℃高壓滅菌30 min。

表1 自制佐劑成分配比

1.3 疫苗配制 取塞內(nèi)卡病毒SVV-CH/ZZ/2016株純化濃縮滅活抗原液2500 g平均分為5份，再分別稱取JY-1、JY-2、JY-3、JY-4、ISA206佐劑各500 g，在30 ℃環(huán)境下將5份抗原分別緩慢加入5份佐劑，期間以400 r/min勻速攪拌10 min，使水相與油相充分混合，維持30 min后迅速轉(zhuǎn)移至2～8 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 疫苗檢測

1.4.1 理化檢測

1.4.1.1 外觀檢查 將5批疫苗倒至透明玻璃瓶中，在自然光照下觀察產(chǎn)品的顏色及狀態(tài)。

1.4.1.2 劑型檢查 取適量冷水至500 mL燒杯中，待液面平靜后，取一清潔1 mL吸管，分別吸取5批疫苗各1 mL，從距冷水液面上方2～3 cm處滴入，3～5 s后再滴入2～3滴疫苗，從上方觀察疫苗在液面的擴(kuò)散情況，從容器側(cè)面觀察疫苗向下擴(kuò)散的情況，并記錄液滴的擴(kuò)散結(jié)果。

1.4.1.3 穩(wěn)定性檢測 將5批疫苗溫度恢復(fù)至室溫，吸取疫苗10 mL加入離心管中，3000 r/min離心15 min，輕輕取出離心管，觀察離心管底是否有水相析出，并記錄水相體積。

1.4.1.4 黏度檢測 5批疫苗分別吸取1 mL，緩緩加入樣品杯內(nèi)，在扭矩40%～60%、轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速6～16 r/min的條件下，用黏度計(jì)測定疫苗黏度。

1.4.1.5 粒徑檢測 用美國貝克曼粒徑儀檢測器探測散射光強(qiáng)度，計(jì)算顆粒粒度分布。

1.4.2 無菌檢驗(yàn) 用注射器分別抽取2 mL疫苗，接種TG小管2支、1支TSB小管，每支0.2 mL，TSB小管置23～25 ℃培養(yǎng)，1支TG小管置35～37 ℃培養(yǎng)，另1支TG小管置23～25 ℃培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)TG小管2支、TSB小管1支做空白對(duì)照，置相應(yīng)溫度培養(yǎng)。各管均培養(yǎng)7 d，每天觀察并做記錄。

1.4.3 內(nèi)毒素含量測定 分別吸取45 mL疫苗放入50 mL離心管中，置50±5 ℃水浴90 min，在4 ℃條件下，以9500 r/min離心25 min，用帶長針頭的注射器吸出下層水相5.0 mL(先吸取3 mL棄去再吸取2 mL)備用；擇供試品陰性對(duì)照和供試品陽性對(duì)照，分別用移液器準(zhǔn)確吸取0.1 mL加入反應(yīng)管，依次加入復(fù)溶好的鱟試劑0.1 mL?；靹蚝笱杆賹⒎磻?yīng)管插入內(nèi)毒素檢測儀檢測。

1.4.4 總蛋白含量測定 取1瓶疫苗恢復(fù)至室溫?fù)u勻后，用1 mL注射器吸取一定量疫苗，在3個(gè)1.5 mL離心管中分別精確加入100 μL疫苗，用移液器準(zhǔn)確吸取900 μL丙酮，分別加入上述盛有疫苗的離心管中，蓋好蓋子后充分震蕩混勻，室溫放置10 min，在4 ℃條件下，以15000 r/min離心15 min。取出后，先用移液器吸棄上層的液相，只保留白色沉淀物，再用移液器分別吸取200 μL丙酮對(duì)沉淀物進(jìn)行2次洗滌，將離心管開蓋倒置放于紙巾上控干，室溫干燥約15 min后，用移液器準(zhǔn)確加入50 μL純化水復(fù)溶，用Lowry法試劑盒測定總蛋白含量。

1.4.5 安全性試驗(yàn)

1.4.5.1 小動(dòng)物安全性試驗(yàn) 體重18～22 g小鼠30只，隨機(jī)分為6組，每組5只，5個(gè)免疫組(JY-1、JY-2、JY-3、JY-4、ISA206)各皮下注射疫苗1.0 mL，1個(gè)對(duì)照組皮下注射生理鹽水1 mL。逐日觀察7 d，觀察小鼠有無死亡或明顯的局部反應(yīng)或全身不良反應(yīng)，7 d后剖檢注射部位，觀察有無潰爛、增生、腫塊。

1.4.5.2 本動(dòng)物安全性試驗(yàn) 用90日齡以上健康豬(SVA細(xì)胞中和抗體滴度不高于1∶2或血清ELISA抗體檢測陰性)12頭，隨機(jī)分為6組，每組2頭，5個(gè)免疫組各兩側(cè)耳根后肌肉分點(diǎn)注射疫苗6 mL(3頭份)，每側(cè)3 mL，連同對(duì)照組逐日觀察10 d并監(jiān)測體溫，觀察豬是否出現(xiàn)塞內(nèi)卡病毒病癥狀或因注射疫苗引起的死亡，以及是否出現(xiàn)明顯的局部反應(yīng)或全身不良反應(yīng)。

1.4.6 效力試驗(yàn) 選取60日齡以上健康易感豬(SVA細(xì)胞中和抗體滴度不高于1∶2或血清ELISA抗體檢測陰性)30頭，隨機(jī)分為6組，每組5頭。每個(gè)免疫組5頭豬耳根后肌肉注射疫苗2 mL，免疫后第21天以相同劑量、相同接種方法加強(qiáng)免疫1 次，對(duì)照組5頭豬不接種疫苗。分別于免前、一免7 d、一免14 d、一免21 d、二免7 d、二免14 d對(duì)疫苗試驗(yàn)組豬只采血進(jìn)行抗體監(jiān)測，于二免14 d連同對(duì)照組，每頭滴鼻檢驗(yàn)毒5 mL(0.1 mL毒液病毒含量不低于107.0TCID50)，左右鼻孔各2.5 mL。攻毒后每日觀察豬的發(fā)病情況，連續(xù)觀察10 d。

2 結(jié)果與分析

2.1 一般檢驗(yàn)結(jié)果 5組SVA滅活疫苗理化檢驗(yàn)均符合疫苗生產(chǎn)規(guī)程要求：5組疫苗外觀均呈性狀均勻的乳劑；劑型為水包油包水型；穩(wěn)定性檢測均未出現(xiàn)水相析出；粒徑檢測結(jié)果為單峰，無雜峰；無菌檢驗(yàn)結(jié)果為陰性；內(nèi)毒素濃度均低于0.25 EU/頭份；蛋白含量在56～63 μg/mL之間；四組JY佐劑制備的SVA滅活疫苗黏度檢測結(jié)果為26.54～27.88 cP，均低于ISA206佐劑制備的疫苗(黏度為43.02 cP)，詳見表2。

表2 5組SVA滅活疫苗一般檢驗(yàn)結(jié)果

2.2 安全性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 小動(dòng)物安全性試驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)制備的5種滅活疫苗對(duì)小鼠注射部位的皮下組織均無刺激性，注射局部均未見潰爛、增生、腫脹及其他與疫苗相關(guān)的反應(yīng)，5種佐劑制備的疫苗免疫小鼠后，小鼠剖檢結(jié)果均未見明顯異常，見圖1。

A：JY-1組；B：JY-2組；C：JY-3組；D：JY-4組；E：ISA206組；F：對(duì)照組

2.2.2 本動(dòng)物安全性試驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)制備的5種滅活疫苗3倍免疫劑量肌肉注射仔豬，連續(xù)觀察10 d并監(jiān)測體溫，結(jié)果顯示，注射局部均未見紅、腫、熱等反應(yīng)，免疫后前2 d出現(xiàn)體溫輕微升高，于免后第3天體溫恢復(fù)至正常，未見由疫苗引起的全身或局部不良反應(yīng)，仔豬發(fā)育良好，精神和食欲都正常。自主開發(fā)的4組佐劑制備的疫苗試驗(yàn)結(jié)果與ISA206佐劑無安全性差異，表明新佐劑對(duì)仔豬安全性未產(chǎn)生影響。將每組中2頭豬監(jiān)測的體溫取平均值繪制曲線，結(jié)果見圖2。

圖2 體溫監(jiān)測結(jié)果

2.3 效力試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 中和抗體檢測結(jié)果 陰性對(duì)照組SVA中和抗體滴度為0，其他5種疫苗免疫仔豬，SVA抗體滴度呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，一免7 d開始全部產(chǎn)生中和抗體，一免21 d中和抗體均大于28，二免14 d中和抗體滴度大于211，四組JY佐劑均能達(dá)到ISA206佐劑的水平，且高于進(jìn)口佐劑約1個(gè)滴度。其中，JY-1佐劑抗體產(chǎn)生最快且中和抗體滴度最高。5種疫苗免疫仔豬中和抗體檢測結(jié)果見圖3。

圖3 5 批疫苗本動(dòng)物效力試驗(yàn)抗體監(jiān)測結(jié)果

2.3.2 攻毒結(jié)果 5 組疫苗連同陰性對(duì)照于二免后14 d攻毒，陰性對(duì)照組5頭豬60%發(fā)病，對(duì)照組攻毒成立，免疫組各5頭豬，保護(hù)率達(dá)80%以上，各免疫組均達(dá)到SVA攻毒保護(hù)要求，其中，JY-1組、JY-3組、JY-4組保護(hù)率達(dá)到100%，保護(hù)率高于進(jìn)口佐劑組(表3)。

表3 5組疫苗攻毒結(jié)果

架子豬SVA免后中和抗體及攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果表明，四組JY佐劑均能達(dá)到ISA206佐劑的水平，并能提升SVA滅活疫苗免疫效力及保護(hù)率。

3 討 論

SVA 在豬群中流行已有十余年，目前，仍無疫苗或特定的治療方法可用，豬場只能通過加強(qiáng)飼養(yǎng)管理和生物安全來防范，因此開發(fā)安全高效疫苗至關(guān)重要。

有學(xué)者[5]通過反向遺傳技術(shù)拯救了一株重組 SVA弱毒株，并在豬體內(nèi)評(píng)估了重組病毒的免疫原性及免疫保護(hù)性。中和抗體及攻毒試驗(yàn)結(jié)果顯示，該重組病毒保留了較理想的免疫原性，說明該重組 SVA 是一株有效的活疫苗候選株。雖然活疫苗能夠誘導(dǎo)理想的體液及細(xì)胞免疫反應(yīng)，但具有潛在的生物安全風(fēng)險(xiǎn)，如毒力返強(qiáng)。而滅活苗不具有潛在的生物安全風(fēng)險(xiǎn)，因此也是另一種理想的候選疫苗[6]。滅活疫苗對(duì)佐劑的要求已從疫苗的一種輔助性物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)槟芴岣邉?dòng)物機(jī)體對(duì)免疫原刺激的應(yīng)答能力，但沒有一種佐劑適用于所有抗原，每種佐劑都有其優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)[7]，所以從佐劑的原料合成、配伍、制備來選擇和應(yīng)用佐劑更能有針對(duì)性地開發(fā)需求性佐劑，提升疫苗免疫效力和保護(hù)率。

本研究按照獸用疫苗佐劑需求，優(yōu)化表面活性劑的合成工藝，制備水包油包水佐劑，在同等配苗條件下，與進(jìn)口佐劑對(duì)比疫苗乳化后各項(xiàng)理化指標(biāo)、安全性及免疫效力、攻毒保護(hù)的情況。試驗(yàn)結(jié)果表明：自制的JY佐劑理化性狀均符合SVA疫苗的要求；四組JY佐劑疫苗黏度均低于ISA206佐劑疫苗，降低了疫苗粘稠度，更易于注射，減少注射后應(yīng)激反應(yīng)程度，提高了疫苗的安全性；安全性檢驗(yàn)及效力檢驗(yàn)均符合且高于SVA疫苗要求，對(duì)小動(dòng)物及本體動(dòng)物均無任何免疫副反應(yīng)。

本研究根據(jù)SVA疫苗安全性及效力提升的需求，定制合成表面活性劑，通過控制表面活性劑反應(yīng)過程中的生成物，減少副產(chǎn)物的生成，降低了疫苗黏度及對(duì)機(jī)體的副作用。同時(shí)，自主合成佐劑根據(jù)抗原的情況調(diào)控佐劑原料配方或添加免疫增強(qiáng)劑，提升了疫苗免疫效力、免疫持續(xù)期及攻毒保護(hù)率。綜合以上試驗(yàn)結(jié)果，表明JY-1、JY-2、JY-3、JY-4佐劑均可用于制備SVA滅活疫苗，對(duì)比而言，JY-1佐劑穩(wěn)定性更好及個(gè)體差異低，用其制備的疫苗免疫仔豬后產(chǎn)生的抗體最高，在豬群中可能會(huì)產(chǎn)生長期的抗體水平，起到較理想的保護(hù)作用。