HPLC波長切換法結(jié)合化學(xué)計量學(xué)對不同廠家四黃止痢顆粒中5種成分的比較分析

張子健，楊楚虹，羅 璇，陳亞軍*，徐詩強，汪柱勇，楊 新，李亞威，周 波，劉 潔*，潘源虎，李 碩

(1.武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，武漢 430065；2.武漢回盛生物科技股份有限公司，湖北省獸藥工程技術(shù)研究中心，武漢 430042)

四黃止痢顆粒收載于《中華人民共和國獸藥典》2015版二部，由黃芩、黃連、黃柏、大黃、板藍根、甘草六味中藥組成[1]。臨床用于治療禽類、豬由濕熱瀉痢引起的疾病，如病毒性、細菌性和混合感染引起的豬瀉痢，禽大腸桿菌病，雞白痢，禽傷寒等疾病[2]。但中草藥制劑所含成分復(fù)雜，且質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不完善，加之中草藥產(chǎn)地分散，生長環(huán)境、采收期、加工炮制工藝不同，以及制劑生產(chǎn)工藝等因素，造成不同廠家生產(chǎn)的同一品種中藥產(chǎn)品及同一廠家不同生產(chǎn)批次的產(chǎn)品間存在著質(zhì)量及臨床療效的差異[3]。目前市場上還存在著非法添加的情況，嚴(yán)重影響了中獸藥制劑的質(zhì)量安全[4]。因此，采用合理有效的方法來保證中獸藥制劑的安全、有效、質(zhì)量可控很有必要。

在《中華人民共和國獸藥典》2015版二部中，僅對四黃止痢顆粒中黃芩苷的含量進行定量分析，而單一成分的質(zhì)量控制難以全面的反應(yīng)該復(fù)方的整體質(zhì)量。多成分質(zhì)量控制能全面反應(yīng)中藥復(fù)方制劑的整體質(zhì)量，有助于生產(chǎn)企業(yè)和監(jiān)管部門完善其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，以達到產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性[5]。

化學(xué)計量學(xué)是通過統(tǒng)計學(xué)或數(shù)學(xué)方法在化學(xué)體系的測量值與體系狀態(tài)之間建立聯(lián)系，在中藥質(zhì)量控制與評價中具有重要意義[6]。模式識別法是化學(xué)計量學(xué)的重要組成部分[7]，根據(jù)有無訓(xùn)練可劃分為無監(jiān)督的模式識別和有監(jiān)督的模式識別，其中無監(jiān)督的模式識別方法包括聚類分析、主成分分析等，有監(jiān)督的模式識別方法包括簇類獨立軟模式法、判別分析、偏最小二乘法判別分析、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等[8]。中藥具有化學(xué)成分復(fù)雜、多成分協(xié)同合作等特點，使其分析方法過于復(fù)雜，利用化學(xué)計量學(xué)分析，可使復(fù)雜的多指標(biāo)問題簡單化，且結(jié)果準(zhǔn)確，可解釋性強。

在四黃止痢顆粒有關(guān)文獻的報道中，熊玥等[9]采用HPLC法只檢測黃芩苷1個成分；賈紀(jì)萍等[10]和王培等[11]分別采用薄層色譜法和HPLC法同時檢測黃芩苷和鹽酸小檗堿2個成分；鄭舉等[12]雖然采用HPLC法同時測定大黃素、大黃酸、黃芩苷、甘草酸銨、(R,S)-告依春5個成分，但并沒有測定黃連、黃柏藥材中共有成分鹽酸小檗堿。目前尚未見到同時測定其中(R,S)-告依春、黃芩苷、鹽酸小檗堿、甘草酸銨、大黃素5個成分的方法。

為了進一步優(yōu)化四黃止痢顆粒的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，本研究根據(jù)“君、臣、佐、使”中醫(yī)配伍理論，結(jié)合中藥質(zhì)量標(biāo)志物，以君藥所含成分為主，兼顧臣佐使藥所含成分的確認原則，采用 HPLC法建立一種波長切換法同時測定四黃止痢顆粒中(R,S)-告依春、黃芩苷、鹽酸小檗堿、甘草酸銨、大黃素5個指標(biāo)性成分。同時結(jié)合聚類分析(CA)、主成分分析(PCA)、偏最小二乘判別分析(PLS-DA)等化學(xué)計量學(xué)方法，評價不同廠家各批次樣品之間的質(zhì)量差異。為四黃止痢顆粒質(zhì)量的全面控制研究提供參考。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Agilent 1260型高效液相色譜儀(自動進樣器，四元泵，柱溫箱，VWD檢測器)；SQP型電子天平(北京Sartorius科學(xué)儀器有限公司)；ME204型電子天平(Mettler Toledo公司)；UPC-III-10T型超純水機(四川優(yōu)普超純科技有限公司)；KQ5200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；UV-2700型紫外可見分光光度計(蘇州島津儀器有限公司)。

1.2 試劑 (R,S)-告依春對照品(批號111753-202007，含量100.0%)、黃芩苷對照品(批號110715-201821，含量95.4%)、鹽酸小檗堿對照品(批號110713-201814，含量86.7%)、甘草酸銨對照品(批號110731-202021，含量96.2%)大黃素對照品(批號110756-201913，含量96.0%)均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈(均為色譜純)購自Sigma-Aldrich公司；水為UPC-III-10T型超純水機制備的超純水；磷酸(批號20190213，分析純)、冰醋酸(批號20190121，分析純)、三氟乙酸(批號20160531)均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。四黃止痢顆粒由河南省某獸藥企業(yè)提供(批號20190802、20190805、20190901、20190903、20191002，編號S1～S5)、江西省某獸藥企業(yè)提供(批號1906901、1906903、1907901、1907904、1908903，編號S6～S10)、天津市某獸藥企業(yè)提供(批號20190401、20190403、20190502、20190503、20190601，編號S11～S15)湖北省某獸藥企業(yè)提供(批號20190309、20190410、20190513、20190602、20190703，編號S16～S20)。

2 方法及結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對照品溶液的制備 取(R,S)-告依春、黃芩苷、鹽酸小檗堿、甘草酸銨、大黃素對照品各適量，精密稱定，加甲醇超聲處理(功率250 W，頻率40 KHz)使溶解，配制成每1 mL分別含(R,S)-告依春0.7 μg、黃芩苷147.1 μg、鹽酸小檗堿35.9 μg、甘草酸銨1.2 μg、大黃素0.05 μg的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取四黃止痢顆粒約10 g，研細。取細粉約1.0 g，置100 mL具塞錐形瓶中，加甲醇50 mL，密塞，超聲處理(功率250 W，頻率40 KHz)30 min，放冷至室溫，過濾，用10 mL甲醇洗滌錐形瓶和濾紙上的殘留物，洗滌3次，合并濾液至100 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.3 陰性樣品溶液的制備 按照四黃止痢顆粒處方配比，分別制備缺少黃芩、黃連和黃柏、大黃、板藍根、甘草的陰性樣品。將上述陰性樣品按“2.1.2”項下方法制備成陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件 選用島津Inertsil ODS-3-C18(4.6mm×250 mm，5 μm)色譜柱，以乙腈(A)-0.3%三氟乙酸水溶液(B)為流動相，按表1程序進行梯度洗脫，流速1 mL·min-1，檢測波長245 nm(0～10 min，測定(R,S)-告依春)、278 nm(10～22 min，測定黃芩苷)、266 nm(22～25 min，測定鹽酸小檗堿)、249 nm(25～30 min，測定甘草酸銨)、254 nm(30～45 min，測定大黃素)，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。

表1 梯度洗脫程序

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 取混合對照品溶液按“2.2”項色譜條件進樣測定，重復(fù)進樣6次，取(編號S16)樣品，按“2.1.2”項方法制備供試品溶液，按“2.2”項色譜條件進樣測定?；旌蠈φ掌啡芤汉凸┰嚻啡芤荷V圖如圖1。結(jié)果顯示(R,S)-告依春、黃芩苷、鹽酸小檗堿、甘草酸銨、大黃素5個指標(biāo)性成分的保留時間的RSD依次為0.15%、0.11%、0.09%、0.06%、0.08%；峰面積的RSD依次為1.44%、0.24%、0.42%、1.57%、1.39%；各組分峰分離度均大于1.5、對稱因子均在0.8～1.2之間、理論塔板數(shù)均大于5000。表明系統(tǒng)適應(yīng)性良好。

圖1 混合對照品色譜圖(A)及供試品色譜圖(B)

2.4 專屬性試驗 取混合對照品溶液、編號S16的供試品溶液及5種陰性樣品溶液，按“2.2”項色譜條件分別進樣，驗證陰性是否有干擾。5種陰性樣品色譜圖如圖2。結(jié)果顯示，供試品溶液與混合對照品溶液在相同的保留時間均有各指標(biāo)性成分的色譜峰，且缺少黃芩的陰性樣品溶液中無黃芩苷色譜峰、缺少黃連和黃柏的陰性樣品溶液中無鹽酸小檗堿色譜峰、缺少板藍根的陰性樣品溶液中無(R,S)-告依春色譜峰、缺少甘草的陰性樣品溶液中無甘草酸銨色譜峰、缺少大黃的陰性樣品中無大黃素色譜峰。說明四黃止痢顆粒樣品中無干擾峰，該方法測定四黃止痢顆粒專屬性符合要求。

圖2 板藍根陰性樣品色譜圖(A)、黃芩陰性樣品色譜圖(B)、黃連及黃柏陰性樣品色譜圖(C)、甘草陰性樣品色譜圖(D)、大黃陰性樣品色譜圖(E)

2.5 穩(wěn)定性試驗 取同一批樣品(編號S16),按“2.1.2”項方法制備供試品溶液，按“2.2”項色譜條件分別在0、2、4、8、12、24 h依次進樣。供試品溶液中(R,S)-告依春、黃芩苷、鹽酸小檗堿、甘草酸銨、大黃素的保留時間RSD分別為0.1%、0.04%、0.06%、0.06%、0.04%，峰面積RSD分別為1.48%、1.02%、1.12%、1.21%、1.59%。表明四黃止痢顆粒供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 精密度試驗 取同一批樣品(編號S16)，按“2.1.2”項供試品制備方法制備供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下連續(xù)進樣6次。(R,S)-告依春、黃芩苷、鹽酸小檗堿、甘草酸銨、大黃素保留時間的RSD分別為0.14%、0.05%、0.05%、0.02%、0.04%，峰面積的RSD分別為1.28%、0.27%、0.32%、0.84%、1.29%。表明系統(tǒng)精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗 取同一批樣品(編號S16)，按“2.1.2”項供試品制備方法，平行制備6份供試品溶液。按“2.2”項下色譜條件進樣測定，根據(jù)峰面積計算各待測組分的含量及其RSD值。結(jié)果(R,S)-告依春、黃芩苷、鹽酸小檗堿、甘草酸銨、大黃素含量的RSD值分別為1.45%、1.01%、1.11%、1.41%、1.62%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗 取樣品(編號S16)細粉約1.0 g，共9份，精密稱定，分別按80%、100%、120%精密加入5種對照品適量，按“2.1.2”項下方法平行制備供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結(jié)果見表2。(R,S)-告依春、黃芩苷、鹽酸小檗堿、甘草酸銨、大黃素的平均回收率分別為102.7%、99.3%、101.1%、98.0%、97.3%，RSD分別為1.56%、0.72%、0.97%、1.33%、1.10%。說明該方法準(zhǔn)確度較高。

表2 加樣回收率試驗(n=3)

2.9 線性與范圍考察 將混合對照品溶液分別按10%、40%、60%、80%、100%逐級稀釋，得到系列質(zhì)量濃度混合對照品溶液,樣品(編號S16)中各成分的含量均為混合對照品的60%。按“2.2”項色譜條件，進樣測定，記錄色譜圖。以進樣濃度(X，μg·μL-1)為橫坐標(biāo)/峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制5個組分的標(biāo)準(zhǔn)曲線，進行線性回歸，計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果表明5個成分在設(shè)定的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。將混合對照品溶液用甲醇逐步稀釋，以信噪比(S/N)約為10時的混合對照品溶液濃度為定量限(LOQ)。標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及定量限結(jié)果見表3。

表3 線性關(guān)系考察

2.10 樣品含量測定 取20批樣品，每一批樣品平行取三份，按“2.1.2”項的方法制成供試品溶液，按“2.2”項色譜條件進樣測定，計算(R,S)-告依春、黃芩苷、鹽酸小檗堿、甘草酸銨、大黃素的含量。結(jié)果見表4。

表4 樣品含量測定結(jié)果(n=3)

3 化學(xué)計量學(xué)分析

3.1 聚類分析(CA) 聚類分析是一種通過數(shù)據(jù)建模簡化數(shù)據(jù)的方法，根據(jù)研究對象的某些特征加以分類，建立樣本間的相似關(guān)系，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于中藥及其制劑的質(zhì)量評價中[13]。以20批不同廠家不同批次的四黃止痢顆粒中5個指標(biāo)性成分的含量為變量，采用SPSS 26.0軟件組間聯(lián)接系統(tǒng)聚類法，以Euclidean距離為測度進行聚類分析，結(jié)果見圖3。當(dāng)類間距為5時，20批樣品可分為4類，S16、S19、S17、S18、S20為第Ⅰ類；S11、S15、S13、S14、S12為第Ⅱ類；S3、S5、S4、S2、S1為第Ⅲ類；S6、S7、S10、S9、S8為第Ⅳ類。當(dāng)類間距為15時，20批樣品可分為2類，上述Ⅰ、Ⅱ類聚為一類，Ⅲ、Ⅳ類聚為一類。表明四黃止痢顆粒中5種指標(biāo)性成分的含量與生產(chǎn)廠家有關(guān)，造成明顯聚類的原因可能與不同廠家生產(chǎn)時所用的原藥材質(zhì)量差異以及生產(chǎn)工藝差異有關(guān)。

圖3 20批四黃止痢顆粒樣品聚類樹狀圖

3.2 Hotelling’s T2 和DModX控制限的建立 Hotelling’s T2 和DModX控制圖是2個互補的多變量分析手段，用于監(jiān)測不同批次的產(chǎn)品質(zhì)量[14]。Hotelling’s T2表示的是每個選定觀察點與模型平面中原點的距離，為模型的內(nèi)部變化量，代表樣品與主成分模型中其他樣品的差異；DModX表示數(shù)據(jù)在變量X空間到主成分模型的距離，代表樣品中未被模型解釋的變化。通常認為在控制限以下的產(chǎn)品為正常批次產(chǎn)品。Hotelling’s T2 和DModX統(tǒng)計量作為批次間差異性評價指標(biāo)，兩者具有不同的監(jiān)控作用，互為補充[15]。

Hotelling’s T2 和DModX的控制圖如圖4、圖5，圖中的T2Crit(99%)和DCrit為控制限，其控制上限分別為17.385和0.05；T2Crit(95%)為警戒限，上限為10.7186。這20批樣品均在控制限以下，均為正常批次產(chǎn)品。

圖4 20批四黃止痢顆粒樣品Hotelling’s T2控制圖

圖5 20批四黃止痢顆粒樣品DModX控制圖

3.3 偏最小二乘判別分析(PLS-DA) 偏最小二乘判別分析是一種通用算法，可用于預(yù)測和描述性建模以及判別變量選擇[16]。同時，也是一種監(jiān)督算法，是化學(xué)計量學(xué)中常用于特征提取和判別分析的技術(shù)[17]。為評價不同廠家不同批次四黃止痢顆粒樣品間的差異，采用PLS-DA模型進行分析。以5種指標(biāo)性成分的含量為X變量，以樣品S1～S20為Y變量，利用SIMCA 13.0軟件進行PLS-DA處理，結(jié)果見圖6、圖7。發(fā)現(xiàn)在置信區(qū)間95%內(nèi)，20批樣品存在一定差異性，根據(jù)分布可將20批樣品分為4類，樣品S1～S5為一類；S6～S10為一類；S11～S15為一類；S16～S20為一類，與聚類分析結(jié)果一致。表明這5種指標(biāo)性成分在評價不同廠家的產(chǎn)品質(zhì)量上具有重要參考價值。在PLS-DA模型中，某一成分的變量重要性投影(VIP)越大，表示這一成分對樣品分類的貢獻度越大[18]。其中VIP值>1的有3種成分，分別為小檗堿、(R,S)-告依春和大黃素，說明這三種成分是影響不同廠家樣品之間質(zhì)量差異貢獻較大的成分。

圖6 20批四黃止痢顆粒樣品PLS-DA得分圖

圖7 四黃止痢顆粒中5種成分的VIP值

4 討論與結(jié)論

4.1 指標(biāo)成分的選擇 《中華人民共和國獸藥典》2015版二部中收錄的四黃止痢顆粒，只對其中的黃芩苷進行含量測定。鄭舉等雖然測定了大黃素等5個成分，但并沒有對小檗堿進行含量測定。小檗堿作為黃連、黃柏藥材中共有的指標(biāo)性成分，有必要對主成分小檗堿進行質(zhì)量研究。本實驗同時選定四黃止痢顆粒處方中每一味藥材的指標(biāo)性成分作為質(zhì)量研究對象，更加嚴(yán)謹?shù)脑u價四黃止痢顆粒的質(zhì)量。

4.2 流動相的選擇 本實驗比較了多種流動相系統(tǒng)。有機相比較了甲醇和乙腈，水相比較了磷酸水溶液、冰醋酸水溶液和三氟乙酸水溶液。分別采用甲醇-0.05%磷酸水溶液、甲醇-0.5%冰醋酸水溶液、甲醇-0.3%三氟乙酸水溶液、乙腈-0.05%磷酸水溶液、乙腈-0.5%冰醋酸水溶液、乙腈-0.3%三氟乙酸水溶液。結(jié)果表明，在乙腈-0.3%三氟乙酸水溶液的流動相中，各指標(biāo)成分色譜峰的分布、峰形和分離度均良好。因此，選擇乙腈-0.3%三氟乙酸水溶液作為四黃止痢顆粒含量測定的流動相。

4.3 檢測波長的選擇 本實驗使用紫外可見分光光度計在190～400 nm范圍內(nèi)對5個指標(biāo)性成分進行全波長掃描，結(jié)果顯示(R,S)-告依春、黃芩苷、鹽酸小檗堿、甘草酸銨、大黃素分別在244.5、277.5、229.5、248.5、221 nm處存在最大吸收，5個指標(biāo)性成分的最大吸收波長存在較大差異，難以實現(xiàn)同一波長下同時檢測5種指標(biāo)成分。最終選擇分段波長切換法測定5個指標(biāo)成分的含量。

4.4 結(jié)果分析 本研究利用HPLC波長切換法測定了四黃止痢顆粒中5種指標(biāo)性成分的含量，并在此基礎(chǔ)上首次結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法對不同廠家不同批次的四黃止痢顆粒進行了差異分析。在PCA模型的基礎(chǔ)上設(shè)定了Hotelling’s T2 和DModX控制限，對不同廠家不同批次的產(chǎn)品進行了監(jiān)測，4個廠家的20批樣品均為正常批次樣品。通過聚類分析及PLS-DA得分圖可以看出，同一廠家生產(chǎn)的不同批次的樣品質(zhì)量一致性較好，但不同廠家之間樣品的質(zhì)量一致性存在明顯差異。不同廠家的樣品差異在指標(biāo)性成分的含量上體現(xiàn)出來，進一步通過PLS-DA中的VIP值可以判斷出，小檗堿、(R,S)-告依春和大黃素是造成明顯差異的主要原因。以上3種成分的差異可能與不同廠家的生產(chǎn)工藝及設(shè)備有關(guān)，也可能與各廠家所使用的黃連、黃柏、大黃和板藍根藥材的產(chǎn)地、采收條件及炮制方法等因素有關(guān)。提示生產(chǎn)企業(yè)關(guān)注所用原藥材的質(zhì)量控制，加強原藥材內(nèi)控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的管理，優(yōu)化生產(chǎn)過程中的工藝及設(shè)備參數(shù)，確保產(chǎn)品質(zhì)量與臨床療效的一致性。

4.5 結(jié)論 中獸藥制劑成分復(fù)雜，而中獸藥復(fù)方制劑發(fā)揮療效，不是一種或一類成分的作用，也不是所有有效成分藥效作用的簡單加和，是多組分作用于機體的綜合效應(yīng)。單一的化學(xué)分析評價方法不能充分判斷中獸藥質(zhì)量的一致性[19]。對于企業(yè)來說，多成分含量測定不僅可以作為企業(yè)的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)，用于產(chǎn)品的批次間質(zhì)量一致性評價研究，也可反映一段時期內(nèi)用于生產(chǎn)的原料藥材的質(zhì)量變化，有助于進一步固定產(chǎn)地、廠家等，對更好的控制和保證藥品質(zhì)量具有重要意義；且多成分含量測定還可以用于不同企業(yè)之間藥品質(zhì)量的橫向?qū)Ρ妊芯縖20]。

實驗建立了HPLC波長切換法同時測定四黃止痢顆粒中(R,S)-告依春、黃芩苷、鹽酸小檗堿、甘草酸銨、大黃素5種成分的分析方法。相較于藥典與文獻已有報道的方法，增加了檢測指標(biāo)，且檢測藥材更全面，對四黃止痢復(fù)方中6味藥材的指標(biāo)性成分都進行了檢測。并首次結(jié)合化學(xué)計量學(xué)對20批不同廠家不同批次的樣品進行分析，發(fā)現(xiàn)了不同廠家之間產(chǎn)品質(zhì)量有明顯差異及造成差異的3種成分。該方法簡便快速，準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，可更全面的控制四黃止痢顆粒的質(zhì)量，為四黃止痢顆粒的質(zhì)量評價提供了依據(jù)。