牛、羊肉和牛、羊奶中獸藥殘留現(xiàn)狀分析及檢測技術(shù)研究進(jìn)展

高鵬飛，龔 威，湯亞云，管凡荀，郭亞文，賀兆源，戴國俊，謝愷舟*

(1.揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚州 225009；2.教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實驗室，江蘇揚州 225009)

獸藥能預(yù)防和治療動物疾病，有目的地調(diào)節(jié)動物生理機(jī)能[1]，提高生產(chǎn)效益，然而由于對獸藥的過度依賴，濫用或不正確使用獸藥等原因?qū)е聞游矬w內(nèi)獸藥殘留超標(biāo)。獸藥殘留會使畜禽和人體內(nèi)的病菌耐藥性增強(qiáng)[2]，影響藥物治療；還會引發(fā)疾病，導(dǎo)致中毒，嚴(yán)重會導(dǎo)致畸形、癌癥和基因突變[3]。為保障畜禽產(chǎn)品安全，優(yōu)化市場環(huán)境，畜禽產(chǎn)品上市前必須進(jìn)行獸藥殘留檢測，以確保上市動物產(chǎn)品中的藥物殘留水平控制在允許的范圍內(nèi)。隨著人們生活水平的不斷的提升，牛、羊肉和牛、羊奶作為重要的蛋白質(zhì)來源，由于其獨特的風(fēng)味和多元的營養(yǎng)成分，市場需求量也越來越大。為了控制和監(jiān)測牛、羊肉和牛、羊奶中殘留物質(zhì)的出現(xiàn)，發(fā)展了不同的樣品前處理技術(shù)和獸藥殘留檢測技術(shù)，為食品安全保駕護(hù)航。綜上，本文綜述了近幾年我國牛、羊肉和牛、羊奶中各類獸藥的殘留現(xiàn)狀和國內(nèi)外研發(fā)的樣品前處理技術(shù)和殘留檢測技術(shù)研究進(jìn)展，以期為獸藥殘留監(jiān)控和溯源提供文獻(xiàn)基礎(chǔ)，為相關(guān)檢測工作提供參考依據(jù)。

1 牛、羊肉和牛、羊奶中的獸藥殘留現(xiàn)狀

2021年央視“3.15”晚會上曝光的河北青縣“瘦肉精”羊事件，使得“瘦肉精”又一次進(jìn)入大眾視野，引起社會強(qiáng)烈關(guān)注[4]?！笆萑饩敝傅氖且活惸芤种浦境练e，促進(jìn)骨骼肌蛋白質(zhì)合成的苯乙醇胺類化合物，屬于β-受體激動劑。常用的主要有克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇和氯丙那林。在2002年農(nóng)業(yè)部就禁止β-受體激動劑類藥物使用，但是由于其能提高飼料報酬，增加瘦肉率，明顯改善胴體品質(zhì)，所以在生產(chǎn)上屢禁不止。自1990年西班牙首次出現(xiàn)因食用殘留克倫特羅的牛肉導(dǎo)致集體中毒的事件以來，關(guān)于“瘦肉精”的食品安全問題頻繁出現(xiàn)。2016年，王海斌[5]在對天津部分市場肉產(chǎn)品的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)1例牛肉樣品存在克倫特羅殘留。2017年北京食品與藥品監(jiān)督局發(fā)布的抽檢公告顯示，5批次牛肉存在獸藥殘留，其中1批次檢出克倫特羅[6]。李杉等[7]在2018年采集了河南省18個市的部分超市和農(nóng)貿(mào)市場的豬、牛、羊肉進(jìn)行殘留分析，436份樣品中有23份檢測到克倫特羅、4份檢測到萊克多巴胺，1份樣品檢出沙丁胺醇。刁艷艷[8]在研究中對市場上不同批次的20個牛奶樣品進(jìn)行獸藥殘留分析，其中有2份樣品檢出氯丙那林殘留。2020年天津出現(xiàn)1例克倫特羅中毒事件，6人食用羊雜后均出現(xiàn)不良癥狀入院，經(jīng)檢測，羊雜中克倫特羅的檢出值高達(dá)595.2 μg·kg-1[9]。2021年3月，江西省樟樹市市場監(jiān)管局通報了其所在市區(qū)某百貨超市中的牛肉被檢出含有克倫特羅[10]。

在牛羊生產(chǎn)和其產(chǎn)品的流通中，除了“瘦肉精”等禁用藥，一些允許被用作治療動物疾病的藥物如果殘留超標(biāo)也會嚴(yán)重危害消費者的健康。為規(guī)范養(yǎng)殖用藥，保障動物源性食品的安全，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部于2019年發(fā)布了新版國標(biāo) GB 31650—2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量》，其中包含牛、羊肉和牛、羊奶中的殘留限量藥物種類如表1所示。在新國標(biāo)中，抗生素、抗蟲藥、殺蟲藥和抗菌藥占獸藥種類比例最多，這是在牛羊生產(chǎn)中較為常用的幾類藥物，存在殘留超標(biāo)的可能性很大。徐曦[11]在西安某市場采集了421份羊肉進(jìn)行獸藥殘留分析，檢測到8份樣品中含有磺胺類藥物殘留，另有2份樣品分別雙氟沙星和諾氟沙星殘留超標(biāo)。黎曉林[12]在2018～2019年采集了欽州市不同來源的動物產(chǎn)品進(jìn)行獸藥殘留現(xiàn)狀調(diào)查，發(fā)現(xiàn)牛肉中的2份樣品青霉素殘留超標(biāo)；部分羊肉存在磺胺類、四環(huán)素類和青霉素殘留，其中1份樣品磺胺類殘留超標(biāo)；牛奶樣品中檢出1份阿莫西林殘留超標(biāo)和1份青霉素G殘留超標(biāo)。趙善倉等[13]在對我國羊奶質(zhì)量現(xiàn)狀的分析中發(fā)現(xiàn)，我國奶羊養(yǎng)殖中不合理用藥和非法用藥現(xiàn)象仍然嚴(yán)重，導(dǎo)致羊奶中出現(xiàn)β-內(nèi)酰胺類、磺胺類和四環(huán)素類藥物殘留現(xiàn)象。郭添榮[14]在研究中通過實際樣品檢測，發(fā)現(xiàn)94個樣品存在獸藥殘留，大部分藥物殘留水平在國家標(biāo)準(zhǔn)允許的范圍內(nèi)，但在1份牛肉樣品中檢出地塞米松和林可霉素殘留超標(biāo)，在1份羊肉樣品中檢測到了克倫特羅。呂冰峰等[15]對2018年我國食品安全監(jiān)督抽檢結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)一批次羊肉中氯霉素殘留超標(biāo)，5批次牛肉中殘留超標(biāo)藥物是克倫特羅、恩諾沙星和磺胺類。孫瑜[16]在濟(jì)南不同的超市和農(nóng)貿(mào)市場采集了10類動物源性食品進(jìn)行獸藥殘留檢測，牛、羊肉和牛奶均存在硝基咪唑類和苯并咪唑類藥物殘留現(xiàn)象，其中1份羊肉樣品中甲硝唑的殘留量達(dá)到了74.78 μg·kg-1，8份牛肉樣品中噻苯咪唑殘留超標(biāo)；4份牛肉和6份羊肉中檢測到了乙烯雌酚殘留；2份牛肉和1份羊肉樣品檢測到高殘留量的克倫特羅。目前我國獸藥殘留形勢依然嚴(yán)峻，很多地方被報道出牛、羊肉和牛奶中存在獸藥殘留超標(biāo)現(xiàn)象，羊奶可能由于產(chǎn)量和流通等原因，在很多調(diào)查中并沒有將羊奶作為采樣對象，所以關(guān)于羊奶中獸藥殘留的情況可調(diào)查的資料有限，但這不代表羊奶質(zhì)量安全過關(guān)，以后的調(diào)研和抽檢需要加大對羊奶的篩查力度，不給不法商戶可乘之機(jī)。解決獸藥殘留問題不僅需要地方機(jī)構(gòu)正確的引導(dǎo)生產(chǎn)，指導(dǎo)養(yǎng)殖戶科學(xué)用藥，遵守休藥期規(guī)定，更需要加大監(jiān)測、管控和懲治力度，切實保障國民飲食安全。

表1 GB 31650—2019 中牛肉、羊肉、牛奶、羊奶的獸藥殘留限量藥物種類

2 牛、羊肉和牛、羊奶獸藥殘留檢測中樣品前處理技術(shù)的研究進(jìn)展

在完整的實驗過程中，樣品前處理是殘留檢測的關(guān)鍵，所占時間比例最大，其過程包括提取、凈化、濃縮或衍生化。在牛、羊肉和牛、羊奶中的獸藥殘留檢測中，由于樣品基質(zhì)復(fù)雜，待測物質(zhì)的濃度較低，水、蛋白質(zhì)、脂肪等復(fù)雜基質(zhì)的存在會加大分離和凈化的難度，影響待測藥物的凈化效果與速度，所以檢測不同樣品必須要選擇合適的前處理方法。目前，在牛、羊肉和牛、羊奶的獸藥殘留檢測中常用的樣品前處理技術(shù)主要有：液-液萃取、固相萃取、QuECHERS、加速溶劑萃取。

2.1 液-液萃取 液-液萃取法是最經(jīng)典的提取凈化方法之一，其原理是利用待測組分與樣品雜質(zhì)在互不相溶的兩相中溶解性差異進(jìn)行凈化，在提取性質(zhì)相似的待測物時應(yīng)用廣泛。Imamoglu等[17]在檢測牛奶中26種獸藥和187種農(nóng)藥殘留的研究中，使用含0.1 %乙酸的乙酸乙酯進(jìn)行液-液萃取，試驗得到了滿意的結(jié)果。Li等[18]通過乙腈提取牛奶中的25種獸藥，基質(zhì)效應(yīng)較小且獲得了滿意回收率。

2.2 固相萃取 固相萃取是溶質(zhì)在高分子固定液膜和水溶液間達(dá)到分配平衡后分離，就是將液體樣品中的目標(biāo)物質(zhì)利用固體吸附劑吸附，再洗脫或加熱解吸附，達(dá)到分離和富集目標(biāo)藥物的目的。賈瑋等[19]基于SPE建立了一種檢測羊肉中12種獸藥殘留的方法，在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)，所有藥物的回收率高于71.37 %，RSD低于6.37 %，精密度高，靈敏度滿足檢測需要，適合羊肉中獸藥殘留的檢測。最近，沈昕等[20]建立了牛、羊奶中莫昔克丁殘留檢測的方法，樣品經(jīng)乙腈提取后，再經(jīng)過C18固相萃取柱凈化，濃縮衍生后上機(jī)檢測，該方法靈敏度高，樣品回收率在75.5 %以上。

2.3 QuEChERS QuEChERS萃取法因具有快速、簡易、廉價、有效、穩(wěn)定和安全的特點而得名，其原理是利用吸附填料與基質(zhì)中雜質(zhì)之間的相互作用來吸附雜質(zhì)，從而實現(xiàn)凈化。Kang等[21]通過QuEChERS法提取牛肉和牛奶中的66種獸藥，在試驗的濃度范圍內(nèi)，所有藥物回收率在70.0 %以上，其他質(zhì)量參數(shù)均滿足檢測需要。陳娟等[22]基于QuEChERS萃取法建立了一種用于牛奶中11種激素類殘留的檢測方法，樣品萃取劑為乙酸乙酯，凈化管為Cleanert MAS-Q，該方法在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性良好，靈敏度高，適合牛奶中激素類藥物的多殘留檢測。

2.4 加速溶劑萃取 加速溶劑萃取是在高溫高壓條件下用有機(jī)溶劑對固體或半固體的樣品進(jìn)行自動化萃取的技術(shù)。高溫可以增加分析物的溶解度，降低基質(zhì)效應(yīng)，高壓可以使溶劑在高溫下仍保持液態(tài)，保證揮發(fā)性物質(zhì)不揮發(fā)，縮短萃取時間。Han等[23]將ASE和凝膠滲透色譜結(jié)合來檢測牛肉和牛腎中的克霉唑殘留，該方法快速準(zhǔn)確、靈敏度高。Yu等[24]開發(fā)了一種ASE法用于提取牛肉和肝臟中的7種四環(huán)素類化合物，提取三氯乙酸/乙腈提取肌肉和肝臟樣品，提取溫度為60 ℃，壓力為65 bar。根據(jù)不同的前處理方法的性質(zhì)，表3總結(jié)了以上四種方法的各自特點，根據(jù)不同樣品性質(zhì)選擇合適的前處理方法，可以提高樣品制備效果。目前不少研究是將兩種前處理方法相結(jié)合，以彌補(bǔ)各自的不足，獲得更好的試驗結(jié)果。

3 牛、羊肉和牛、羊奶獸藥殘留檢測中分析技術(shù)的研究進(jìn)展

3.1. 氣質(zhì)聯(lián)用法 氣相色譜是根據(jù)待測化合物在載氣的帶動下通過色譜柱的速率不同來分離混合物。通常氣相色譜檢測藥物殘留都需要進(jìn)行衍生化反應(yīng)，并選擇特定的毛細(xì)管柱來分離樣品，再通過與質(zhì)譜檢測器相連進(jìn)行分析測定。孫慧中等[25]通過氣相色譜-質(zhì)譜法測定牛肉中17種二噁英類殘留，方法精密度高，滿足檢測需要。李曉晶等[26]通過氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定牛奶中7種多溴二苯醚，所有樣品的回收率在89.7%以上，檢測限(limit of detection, LOD)為2.4～9.8 ng·kg-1，該方法簡單快速，靈敏度高。氣質(zhì)聯(lián)用法雖然檢測速度快和靈敏度高，但適合檢測的主要是可以氣化或衍生后可以氣化的小分子量藥物，一些熱不穩(wěn)定或大分子量的藥物只能選擇其他檢測方法，牛、羊肉和牛、羊奶中的藥物殘留大部分是大分子量的化合物，所以氣質(zhì)聯(lián)用法的應(yīng)用并不如液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用法廣泛。

表2 不同的前處理方法優(yōu)缺點對比

3.2 液相色譜法 液相色譜是以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將極性不同的單一溶液或不同物質(zhì)的混合溶液通過固定相色譜柱，根據(jù)經(jīng)過色譜柱的停留時間不同達(dá)到分離檢測的目的。HPLC和UPLC是在液相色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展來的檢測技術(shù)，具有高速、高效、高靈敏度的特點，目前是檢測牛、羊肉和牛、羊奶中獸藥殘留的常用方法。液相色譜將目標(biāo)化合物分離后要選用適合的檢測器進(jìn)行測定，如熒光檢測器(fluorescence detector, FLD)適合本身擁有或衍生后獲得熒光基團(tuán)的藥物，二極管陣列檢測器(photodiode array detector, PDAD)和紫外檢測器(ultra-violet detector, UVD)則需要依靠紫外基團(tuán)進(jìn)行檢測。表3列出了通過液相色譜連接不同檢測器檢測牛、羊肉和牛、羊奶中的獸藥殘留的研究結(jié)果對比。

表3 牛、羊肉和牛、羊奶中液相色譜連接不同檢測器檢測結(jié)果對比

3.3 液質(zhì)聯(lián)用法 LC-MS是以液相色譜作為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜為檢測系統(tǒng)，由于質(zhì)譜強(qiáng)大的定性能力，使其在有機(jī)物分析領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用空間。目前在牛、羊肉和牛、羊奶的獸藥殘留檢測中常用的液質(zhì)聯(lián)用法主要有HPLC-MS/MS和UPLC-MS/MS，具有分析范圍廣、分離能力強(qiáng)、結(jié)果可靠等優(yōu)點。表4列出了近幾年通過液質(zhì)聯(lián)用法檢測牛、羊肉和牛、羊奶中獸藥殘留的研究結(jié)果。通過表3和表4對比，可以發(fā)現(xiàn)與液相色譜法相比，液質(zhì)聯(lián)用法的應(yīng)用范圍更加廣泛，可以分析更多不同種類的藥物，且檢測限相對更低。

表4 不同液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測牛、羊肉和牛、羊奶的結(jié)果對比

3.4 其他方法

3.4.1 毛細(xì)管電泳 毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis，CE)是在高壓直流電場作用下，以電滲流為驅(qū)動力，毛細(xì)管為分離通道，依據(jù)樣品中各組分的通過速度不同而實現(xiàn)分離的技術(shù)。韓宇等[40]通過CE檢測牛肉中兩種氟喹諾酮類殘留，該方法靈敏度高，滿足檢測需要。Yang等[41]通過CE分析畜產(chǎn)品中的6類磺胺類藥物，牛奶樣品的LOD在1.8～16.3 μg·L-1之間，方法簡單快速，精密度高。CE具有試劑消耗低、分離效率高的優(yōu)點，但由于進(jìn)樣量小，因而制備能力不足，且CE在重現(xiàn)性方面有一定的局限性。

3.4.2 免疫分析法 免疫分析法是通過抗原與抗體發(fā)生免疫反應(yīng)后的特異性結(jié)合，以此對目標(biāo)化合物進(jìn)行測定分析，操作簡單，檢測速度快。李堅等[42]建立了一種新型酶聯(lián)免疫吸附法檢測食品中的恩諾沙星，該方法具有良好的靈敏度和特異性。安靜等[43]用化學(xué)發(fā)光免疫分析法篩查新疆地區(qū)動物源性食品中的硝基呋喃及代謝物殘留，被檢出的樣品通過UPLC-MS/MS進(jìn)行驗證，兩種方法檢測結(jié)果一致。免疫分析法更適合大批量樣品的定性檢測，其發(fā)展要保證準(zhǔn)確性和靈敏度，避免“假陽性”問題。

3.4.3 生物傳感器分析法 隨著納米技術(shù)的成熟，生物傳感器技術(shù)的發(fā)展為牛、羊肉和牛、羊奶中的獸藥殘留檢測提供了新方向，綠色環(huán)保、安全有效的高靈敏度檢測方法在未來的發(fā)展空間很大。Sun等[44]通過化學(xué)發(fā)光傳感器法檢測牛奶樣品中的四環(huán)素類獸藥殘留，方法優(yōu)化后的LOD為21 fmol·L-1。Wang[45]通過電化學(xué)傳感器檢測樣品中的氯霉素殘留，該方法具有很高的靈敏度和很好的可重復(fù)性和穩(wěn)定性，并已成功用于牛奶樣品中氯霉素的檢測。生物傳感器具有試劑消耗低、靈敏度高、省時省力等優(yōu)點，但在牛、羊肉和牛、羊奶殘留檢測的應(yīng)用還不是非常廣泛，目前主要是用于檢測肉品質(zhì)和風(fēng)味等，而且由于研究歷史較短，目前還有不少問題需要解決，但隨著研究的深入，該方法在獸藥殘留檢測領(lǐng)域的應(yīng)用將成為一種趨勢。

4 總結(jié)與展望

我國牛、羊肉和牛、羊奶中的獸藥殘留問題仍然嚴(yán)峻，特別是β-受體激動劑、抗生素類和抗菌類藥物經(jīng)常被查出殘留超標(biāo)。在養(yǎng)殖過程中要嚴(yán)格按照要求科學(xué)使用獸藥，遵守休藥期的規(guī)定，并且上市前要對產(chǎn)品進(jìn)行殘留抽檢，符合國家標(biāo)準(zhǔn)才可以流通市場，避免藥物殘留超標(biāo)危害消費者健康。對于不同的樣品基質(zhì)要選擇合適的樣品前處理方法，目前在牛、羊肉和牛、羊奶的檢測中常用的樣品前處理技術(shù)主要是SPE和QuEChERS，凈化效果好，分離時間短，溶劑用量少，但在應(yīng)用時要注意規(guī)避基質(zhì)干擾。ASE法因其特有的優(yōu)點，仍有很大的發(fā)展空間。將不同的樣品前處理技術(shù)聯(lián)用可以減少單一方法的缺陷，使樣品制備更加完美，提高回收率。免疫分析法適合快速檢測對樣品進(jìn)行定性，而更加精確的定量分析則需要儀器檢測。與氣相色譜和液相色譜相比，CE分析儀器相對便宜，適合沒有色譜儀器的實驗室。HPLC-MS/MS和UPLC-MS/MS是超痕量分析最常用的方法，適用范圍廣，分析結(jié)果準(zhǔn)確可靠，且不需要衍生化反應(yīng)，未來一段時間的大部分研究也都會是以液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)為主。生物傳感器對獸藥殘留的檢測具有更高的準(zhǔn)確度、安全，更有極高的靈敏度和精密度，時效快且成本更低，雖然目前生物傳感器技術(shù)的應(yīng)用還不如傳統(tǒng)的檢測方法廣泛，但其未來發(fā)展可期。