薏米和芡實(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠腸道菌群的影響

邢志青 丁海燕 王金龍 任國領(lǐng) 胡敏 張奕婷 邵小強(qiáng) 于波

摘 要：為探究薏米、芡實(shí)對(duì)小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，將小鼠分薏米、芡實(shí)、對(duì)照3組喂養(yǎng)，喂食15d，觀察3組小鼠狀況、體重和腸道菌群的變化，取喂養(yǎng)15d的小鼠糞便為實(shí)驗(yàn)材料，16s基因測序法對(duì)腸道菌群多樣性檢測。結(jié)果表明，薏米、芡實(shí)均可以使小鼠體內(nèi)的乳酸菌增多，大腸桿菌減少，喂食薏米和芡實(shí)15d均使小鼠腸道菌群的多樣性降低。

關(guān)鍵詞：腸道菌群;微生態(tài)調(diào)節(jié);薏米;芡實(shí)

中圖分類號(hào) R285 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2022）02-0048-03

Abstract： In order to explore the regulatory effect of Coix seed and Gordon euryale seed on intestinal microflora of mice， the mice were divided into coix seed， Gordon euryale seed and control group and fed for 15 days. The body weight and intestinal microflora of the mice in the three groups were observed. Feces of mice fed for 15 days were used as experimental materials， and the diversity of intestinal flora was detected by 16S gene sequencing method. The results showed that coix seed and Euryale seed could increase lactobacillus and decrease escherichia coli in mice. Feeding coix seed and Euryale seed for 15 days reduced the diversity of intestinal flora in mice.

Key words： Intestinal flora; Microecological regulation; Coix seed; Gordon euryale seed

薏米、芡實(shí)是中藥，也是生活中常食用的保健糧食。薏米有許多藥用價(jià)值，常食薏米可促進(jìn)新陳代謝和血液循環(huán);芡實(shí)具有益腎固精、補(bǔ)脾止瀉、祛濕止帶的功效。近年來，隨著微生態(tài)學(xué)的理論、研究方法及與中藥學(xué)的研究相結(jié)合，許多研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)中藥藥理有著維持腸道內(nèi)菌群平衡的作用[1]。中藥從消化、營養(yǎng)吸收、脂肪代謝、免疫調(diào)節(jié)、藥物代謝等諸多方面影響著人和動(dòng)物的健康狀況[2]。腸道正常菌群因環(huán)境、餌料、宿主行為和基因型等的不同而有所差異，但總體上處于相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)。通過改變飲食習(xí)慣，改變腸道內(nèi)的微觀環(huán)境，同時(shí)腸道微生物可通過還原反應(yīng)、水解反應(yīng)等方式對(duì)中藥進(jìn)行代謝轉(zhuǎn)化[3]。經(jīng)過一系列反應(yīng)后被人體吸收，從而達(dá)到治療效果。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，目前已經(jīng)有小鼠的腸道菌群代謝產(chǎn)物研究，腸道菌群多樣性影響因素研究等[4]。王廣在黨參多糖對(duì)腸道菌群失調(diào)小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，黨參多糖對(duì)雙歧桿菌有促進(jìn)生長的作用[5]。黨參多糖能夠?qū)δc道一些致病菌發(fā)揮生物拮抗作用[6]。鄢偉倫研究證實(shí)，白術(shù)高劑量組的雙歧桿菌和乳桿菌的數(shù)量增多，腸桿菌減少[7]。郭麗雙等對(duì)腸道菌群失調(diào)小鼠模型灌胃后，結(jié)果顯示，長期灌胃山藥多糖對(duì)小鼠的腸道菌群有著顯著影響[8]。小鼠腸道腸桿菌、腸球菌水平受抑制，而雙歧桿菌、類桿菌水平明顯升高[9]。此外，諸多清熱解毒中藥也具有調(diào)節(jié)腸道菌群的能力[10]。

在腸道微生態(tài)系統(tǒng)中，各種微生物與宿主經(jīng)過長期的協(xié)同進(jìn)化，在調(diào)節(jié)宿主生理生化反應(yīng)、介導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答和抵制宿主疾病發(fā)生等方面發(fā)揮著重要的作用，以至于被認(rèn)為是動(dòng)物額外的器官。動(dòng)物腸道內(nèi)生活著大量的微生物，包括真核微生物、細(xì)菌、古菌和病毒等。這些與腸道聯(lián)系緊密的共生菌群，與宿主相互作用，共同維系整個(gè)腸道生態(tài)系統(tǒng)平衡與穩(wěn)定。中藥的單一成分、或不同劑量均可影響腸道菌群的數(shù)量和組成結(jié)構(gòu)，不同種類和不同濃度的中藥對(duì)腸道菌群的影響也不盡相同。為此，筆者通過薏米、芡實(shí)對(duì)小鼠腸道微生物的影響研究，以期為探索飲食對(duì)人體腸道微生態(tài)的調(diào)控及影響關(guān)系提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)小白鼠 購于長春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，微生物等級(jí)為SPF級(jí)。

1.1.2 試劑 常規(guī)鼠糧、薏米鼠糧、芡實(shí)鼠糧、DNA提取試劑盒等。

1.2 方法

1.2.1 鼠糧制備 將400g薏米打成粉加水100mL，揉捏成短棒狀與小鼠常規(guī)鼠糧一樣大小，放入100℃烘箱烘3h;取芡實(shí)400g也打成粉狀，加水100mL揉捏成短棒狀，與薏米一同放入烘箱烘干。

1.2.2 小鼠處理 將小鼠分成3組，即薏米組、芡實(shí)組、對(duì)照組，各5只。薏米組小鼠每只每天喂食4g薏米+4g鼠糧;芡實(shí)組小鼠每只每天喂食4g芡實(shí)+4g鼠糧;對(duì)照組每天每只喂食8g鼠糧。給予15只小鼠每天充足的自來水。每天觀察小鼠活動(dòng)狀態(tài)，2～3d更換1次墊料，喂食15d[11]。

1.2.3 收集小鼠糞便 將吸水紙裁成鼠籠底部大小。將鑷子、凍存管、吸水紙于高壓滅菌鍋121℃滅菌15min，將滅菌后晾干的吸水紙鋪在清潔好的鼠籠內(nèi)底部，將小鼠放入，用滅過菌的鑷子收集其排在紙上的糞便迅速放入凍存管中。

1.2.4 16SrDNA高通量測序 樣本基因組DNA的提取與質(zhì)檢，16S/18S/ITS rDNA可變區(qū)擴(kuò)增與測序文庫構(gòu)建，高通量測序，在金維智生物公司完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)小鼠體重的影響 由表1可知，喂食芡實(shí)和薏米的小鼠的體重都比喂食正常鼠糧的小鼠增長得快，其中喂食芡實(shí)的小鼠體重增長最快。

2.2 16SrDNA檢測結(jié)果分析

2.2.1 樣本物種 喂食不同鼠糧對(duì)小鼠腸道菌群的影響，各樣本在不同分列水平下物種數(shù)目統(tǒng)計(jì)見表2。表中的數(shù)字代表各樣本在其水平上有多少個(gè)物種，薏米在綱水平上的物種數(shù)有12種，芡實(shí)和對(duì)照在綱水平上的物種數(shù)有14種;薏米在屬水平上的物種數(shù)有26種，芡實(shí)在屬水平上的物種數(shù)有28種，對(duì)照組在屬水平上的物種數(shù)有32種。

根據(jù)各樣本在不同水平下（門、綱、目、科、屬、種）Top30的物種分布繪制為聚類熱圖，通過熱圖顏色差異可直觀顯示各物種豐度的相似性與差異性，以不同分類水平各樣本的菌種分布繪制熱圖展示如圖1所示。

在上圖中第一列S1為薏米組物種分布，S2為芡實(shí)組的物種分布，S3為對(duì)照組的物種分布。S1中排在前5位的優(yōu)勢菌群分別有Unclassified（未歸類的）、Faecalibaculum（糞便細(xì)菌）、uncultured bacterium Unclassified（未培養(yǎng)細(xì)菌）、Ambiguous taxa unclassified（模糊的分散群）、uncultured bacteroidales bacterium Unclassified（未分類培養(yǎng)的擬桿菌），在S2中排在前5位的優(yōu)勢菌群有Unclassified（未歸類的）、Faecalibaculum unclassified（未分類的糞便細(xì)菌）、Akkermansia unclassified（杜爾氏菌屬）、Bacteroides（類桿菌屬）、Lactobacillus reuteri（羅伊氏乳桿菌），S3中排在前5位的優(yōu)勢菌群有Unclassified（未歸類的）、Bacteroides（類桿菌屬）、uncultured bacterium Unclassified（未培養(yǎng)細(xì)菌）、Helicobacter bilis（膽汁螺桿菌）、Rikenellaceae（理研菌科）。

各樣本在屬水平序列數(shù)統(tǒng)計(jì)排在前5位的詳見表3。由表3可知，薏米組乳酸桿菌序列數(shù)為6020，芡實(shí)組乳酸桿菌序列數(shù)為5936，對(duì)照組乳酸桿菌序列數(shù)為794個(gè)，所以薏米、芡實(shí)使小鼠腸道內(nèi)的乳酸桿菌數(shù)量明顯高于對(duì)照組，且二者均抑制類桿菌屬生長。薏米組的雙歧桿菌的序列數(shù)是對(duì)照組的20多倍。

2.2.2 物種相對(duì)豐度分析 如圖2所示，不同顏色的圈表示不同的樣本，數(shù)字分別代表了每個(gè)樣本特有或共有的OTU數(shù)目。個(gè)OTU即代表個(gè)菌群。圖中S3是對(duì)照組綠色的圓圈，包含84個(gè)OTU，個(gè)OTU可視為個(gè)菌群，即84個(gè)群落，其中有58個(gè)OTU為3個(gè)樣本共有，S2是芡實(shí)組紅色的圓圈，包含66個(gè)OTU，其中有65個(gè)OTU與對(duì)照組相同，僅有1個(gè)與對(duì)照組不同，S1是薏米組藍(lán)色的圓圈，包含69個(gè)OTU，有3個(gè)不同于對(duì)照組的OTU。從菌群的種類數(shù)上看，薏米和芡實(shí)組的菌群豐度明顯低于對(duì)照組。

2.2.3 菌群β多樣性分析 β多樣性值為2個(gè)樣本間的相異系數(shù)，反映不同樣本間的多樣性的差異，利用各樣本序列間的進(jìn)化和豐度信息計(jì)算樣本間的距離，反映樣本間是否有顯著的微生物群落差異，可通過UniFrac分析實(shí)現(xiàn)。在圖3，距離矩陣熱圖中顏色深淺代表了樣本兩兩之間的相異程度，顏色越淺表示2個(gè)樣本相異系數(shù)越小，物種多樣性的差異越小。由圖3可知，S1薏米組和S3對(duì)照組的微生物群落差距呈黃色在0.2以上，S2芡實(shí)組和S3對(duì)照組差異較小呈淺黃色在0.1～0.2。

2.2.4 菌群α多樣性分析 群落生態(tài)學(xué)中，α多樣性可以反映微生物群落中物種的數(shù)目，通過一系列統(tǒng)計(jì)學(xué)指數(shù)的分析來估計(jì)環(huán)境群落的物種豐度和多樣性。表4為α多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)表。其中ACE和Chao是生態(tài)學(xué)中用來估計(jì)物種總數(shù)的常用指數(shù)，其數(shù)值越高表示其菌群豐度越高，其中Shannon和Simpson是生態(tài)學(xué)中用來描述微生物多樣性。從表4中可以看出，喂食薏米和芡實(shí)均會(huì)影響小鼠腸道菌群的豐度，喂食薏米和芡實(shí)這2種食用型中藥會(huì)使腸道菌群豐度降低，腸道菌群多樣性也比對(duì)照組略低。

3 討論

薏米和芡實(shí)喂量對(duì)菌群的影響，小鼠每天食用的鼠糧是一定的，但是中藥和鼠糧的比例對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定影響[12-13]，本次實(shí)驗(yàn)選擇中藥與鼠糧1∶1的比例進(jìn)行喂食，2∶1或者1∶2等其他比例喂食對(duì)腸道菌群有什么樣的影響還有待研究。薏米、芡實(shí)均可以使小鼠體內(nèi)的乳酸菌增多，大腸桿菌減少，喂食薏米和芡實(shí)15d均使小鼠腸道菌群多樣性降低，薏米和芡實(shí)對(duì)脾胃的調(diào)理作用的機(jī)制可能與它們影響腸道菌群的微生態(tài)有關(guān)。

參考文獻(xiàn)

[1]王瑤，季宇彬，陳明蒼.中藥與腸道菌群相互作用的研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012，9（02）：12-13.

[2]李偉.幾種常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人腸道主要菌群多樣性比較[D].重慶：西南大學(xué)，2011：4-5.

[3]李寒冰，吳宿慧，張顏語，等.中藥與腸道菌相互作用研究進(jìn)展[J].中成藥，2016，38（01）：147-151.

[4]丁碩.九種健脾胃中草藥對(duì)三種典型益生菌體外生長及潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的影響[D].保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013：2-4.

[5]Savage. Microbial Ecology of the Gastrointestinal Tract[J]. Annual Review of Microbiology，1977，31：107-133.

[6]王廣.黨參多糖對(duì)腸道菌群失調(diào)小鼠的調(diào)整作用機(jī)制的初步研究[D].佳木斯：佳木斯大學(xué)，2010：8-9.

[7]羅瑞靜，柴維漢.中草藥對(duì)腸道菌群影響的研究進(jìn)展[D].上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，30：86，89.

[8]高啟禹，趙英政，張凌波，等.山藥多糖對(duì)昆明種小鼠生長性能及腸道菌群的影響.中國老年學(xué)雜志，2015，10：5685-5687.

[9]郭蕾.乳酸菌對(duì)小鼠腸道菌群失衡的調(diào)節(jié)作用研究[D].揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2017：6-7.

[10]Yamashiro.Gut Microbiota in Health and Disease[J].Annals of Nutrition &Metabolism，2018，71（3-4）：242-246.

[11]姜美娟，梁冰.人體腸道菌群定量技術(shù)研究進(jìn)展[J].航空航天醫(yī)學(xué)雜志，2011，22（03）：281-283.

[12]靳志敏，張宏博，劉夏煒，等.不同劑量植物乳桿菌對(duì)小鼠腸道菌群的影響[J].食品工業(yè)科技，2014，11（36-37）：342-345.

[13]張迪，田曄，胡昀昭，等.中藥對(duì)腸道菌群的影響探討[D].淮南：安徽理工大學(xué)，2018：2-3.

（責(zé)編：張宏民）