向日葵葉的生藥學(xué)研究

孫保中 張家偉 李薪宇 汪小玉 張蓮英 稅丕先

摘要 [目的]對向日葵葉進(jìn)行系統(tǒng)的生藥學(xué)鑒定。[方法]對向日葵葉進(jìn)行性狀、顯微鑒別;采用薄層色譜法和HPLC法對所含綠原酸進(jìn)行鑒別和含量測定;建立小鼠耳腫脹、足腫脹炎癥模型，檢測向日葵葉醇提物對其耳、足腫脹度及抑制率的影響。[結(jié)果]獲得向日葵葉的基源、性狀、橫切面及粉末顯微特征，薄層鑒別特性及含量測定結(jié)果;向日葵葉醇提物高、中、低劑量組能顯著地抑制小鼠耳腫脹及足腫脹，抑制作用呈劑量依賴性。[結(jié)論]該研究初步建立了向日葵葉的生藥學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，可為其鑒別及進(jìn)一步研究提供理論參考。

關(guān)鍵詞 向日葵葉;生藥學(xué);綠原酸;薄層色譜法;高效液相色譜法

中圖分類號(hào) R 282文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2022）02-0182-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.02.050

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Pharmacognostic Study on the Leaves of Helianthus annuus L.

SUN Bao-zhong1，ZHANG Jia-wei2，LI Xin-yu3 et al

（1.Chongqing Kerui Nanhai Pharmaceutical Co.， Ltd.，Chongqing 409000;2.School of Pharmacy， Southwest Medical University， Luzhou，Sichuan 646000;3. The First People's Hospital of Pidu District， Chengdu， Sichuan 611730）

Abstract [Objective]To conduct systematic pharmacological identification of the leaves of Helianthus annuus. [Method] Carried out the character and microscopic identification of the leaves of Helianthus annuus;thin-layer chromatography and HPLC was used to identify and determine the chlorogenic acid content.A mouse ear swelling and foot swelling inflammation model was established， and the influence of Helianthus annuus leaf alcohol extract on the ear and foot swelling degree and inhibition rate was tested.[Result]Obtained the basic source， traits， cross section and powder microscopic characteristics of the leaves of Helianthus annuus， thin layer identification characteristics and content determination results.The leaves of Helianthus annuus alcohol extract high， medium and low dose groups could significantly inhibit ear swelling and foot swelling in mice， the inhibition effect was dose-dependent. [Conclusion]This study has initially established the pharmacological standard of the leaves of Helianthus annuus， which can provide a theoretical reference for its identification and further research.

Key words Leaves of Helianthus annuus L.;Pharmacognosy;Chlorogenic acid;TLC;HPLC

基金項(xiàng)目 2018年中醫(yī)藥公共衛(wèi)生服務(wù)補(bǔ)助專項(xiàng)“全國中藥資源普查項(xiàng)目”（財(cái)社〔2018〕43號(hào)）。

作者簡介 孫保中（1964—），男，重慶人，執(zhí)業(yè)藥師，從事藥品質(zhì)量研究。*通信作者，教授，碩士生導(dǎo)師，從事中藥資源研究。

收稿日期 2021-05-07

向日葵（Helianthus annuus L.）為菊科（Compositae）向日葵屬（Helianthus L.）一年生高大草本植物，于明朝中期傳入我國[1]。向日葵根、莖髓、葉、花盤、種子均能入藥[2]。向日葵葉可降壓、截疙、解毒，主治高血壓、疙瘩、疔瘡[3]。向日葵作為農(nóng)業(yè)栽培植物，是世界上重要的油料作物[4]，生長周期短，適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng)，在我國農(nóng)村廣泛種植，部分向日葵品種作為觀賞植物[5]。向日葵各部位都有較高的藥用價(jià)值，但向日葵葉在向日葵籽采收后成為廢品，大量被焚燒、填埋，造成污染和浪費(fèi)[6]。因此，充分地開發(fā)和利用向日葵葉，探究其藥理作用，不僅能一定程度地解決環(huán)境污染，提高藥用農(nóng)作物的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，還能擴(kuò)充中藥資源，緩解某些農(nóng)業(yè)資源浪費(fèi)、缺乏的現(xiàn)狀。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 藥材。開花期和果實(shí)成熟期向日葵葉樣品均采自河南省原陽縣太平鎮(zhèn)，經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室莊元春副教授鑒定為菊科向日葵屬植物向日葵（Helianthus annuus L.）的葉。

1.1.2 儀器。Cx40顯微鏡（寧波舜宇儀器有限公司）;LC-2030高效液相色譜儀（日本島津）;ZF-20D暗箱式紫外分析儀（上海寶山顧村電光儀器廠）;EYELA N-1300V-W旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）;DSY-9002戴生高速萬能粉碎機(jī)（山東邁德森萬能高速粉碎機(jī)廠）;ME155DU電子天平（METTLER TOLEDOHH-6）;恒溫水浴鍋、TOYN-10A超聲波清洗儀（上海喬躍電子有限公司）。

1.1.3 試劑。綠原酸（成都曼斯特生物科技有限公司，批號(hào)MUST-18030620）;硅膠H薄層板（青島海洋化工，批號(hào)20190506）;地塞米松磷酸鈉注射液[5 mg/（mL·支），太極西南藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)H50021463];角叉菜膠（sigma公司）;二甲苯（成都市科隆化學(xué)品有限公司，批號(hào)2019080801）;甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 顯微鑒別方法。對新鮮并洗凈除去雜質(zhì)的向日葵開花期葉采用石蠟切片法切片，F(xiàn)AA固定液固定，再用番紅、固綠染色劑染色，濾紙吸凈多余試劑，制成向日葵葉橫切面組織裝片。將新鮮并洗凈除去雜質(zhì)的向日葵葉干燥，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后，按照2015版中國藥典（一部）過四號(hào)篩，分別取少量粉末置載玻片上，滴加1～2滴水合氯醛并在酒精燈上加熱進(jìn)行透化1～2次，再滴加1～2滴稀甘油封藏并蓋上蓋玻片，制成向日葵葉粉末裝片[7]。

1.2.2

薄層鑒別方法。稱取向日葵開花期葉的粉末1 g，加入甲醇10 mL，超聲30 min，過濾，濃縮至1 mL，得供試品溶液。按薄層色譜鑒別法吸取綠原酸對照品溶液、向日葵葉供試品溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠H薄層板上，以乙酸丁酯∶甲酸∶水∶冰醋酸（21∶12∶7.5∶1）混合液的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。

1.2.3 綠原酸含量的測定方法。稱取向日葵葉粉末1 g加入50 mL 70%乙醇溶液，回流提取1 h，過濾，重復(fù)1次，合并2次濾液，揮干溶劑，加甲醇定容，備用。按高效液相色譜法，色譜柱為Venusil XBP C 18（L）5 μm，150 A，4.6 mm×250 mm，流動(dòng)相為乙腈∶0.4%磷酸水溶液=9∶91;流速1 mL/min;檢測波長327 nm;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量10 μL。此色譜條件下，綠原酸對照品及向日葵葉供試品的色譜峰能與其他色譜峰達(dá)到較好的基線分離。

1.2.4

向日葵葉醇提物抗炎作用的研究。取向日葵葉粉末（過四號(hào)篩）100、200、300 g，分別加入1 000、2 000、3 000 mL 70%乙醇溶液回流提取1 h，過濾，濾渣繼續(xù)分別加入等量70%乙醇溶液回流提取1 h，過濾，合并2次濾液，揮干溶劑，分別加純水定容，配制成含生藥1、2、3 g/mL的溶液，備用。

取體重為18～22 g的雄性昆明小鼠50只，隨機(jī)分為5組，每組10只，設(shè)空白組、藥物組（醇提物低、中、高劑量組）、陽性藥物對照組。空白組用純水灌胃;醇提物低、中、高劑量組按20 mL/kg的劑量分別用1、2、3 g/mL的溶液灌胃;陽性對照組按5 mg/kg的劑量用地塞米松磷酸鈉注射液腹腔注射。每天給藥1次，連續(xù)給藥7 d，最后一次給藥40 min后，在小鼠右耳正反兩面均勻涂布二甲苯20 μL致炎，左耳不做處理，20 min后處死小鼠，沿耳廓基線剪下雙耳，并用8 mm鼠耳打孔器在兩只鼠耳同一位置剪下圓片，稱定重量，進(jìn)行小鼠耳腫脹的影響研究。右耳重量減去左耳重量即為腫脹度。抑制率=[（空白組腫脹度平均值-給藥組腫脹度平均值）/空白組腫脹度平均值]×100%[8-9]。

右足重量減去足耳重量即為腫脹度，抑制率=[（空白組腫脹度平均值-給藥組腫脹度平均值）/空白組腫脹度平均值]×100%[10]。

每天給藥1次，連續(xù)給藥7 d，最后一次給藥30 min后，用30 μL 1%角叉菜膠注射小鼠右后足趾部，左足不做處理，4 h后處死小鼠，沿踝關(guān)節(jié)剪下小鼠左右后足，分別稱重，計(jì)算腫脹度及抑制率，進(jìn)行小鼠足腫脹的影響研究。

2結(jié)果與分析

2.1 性狀鑒別

向日葵葉多皺縮卷曲，有的破碎。展開后，完整的葉呈卵圓形或心狀卵圓形，長10～25 cm，寬10～20 cm，有長柄，為5～10 cm;尖端漸間或銳突，基出三脈，邊緣有粗鋸齒，兩面均有白色硬毛;表面磨砂感，質(zhì)脆，易碎;氣微，味淡，微苦。

2.2 顯微鑒別

2.2.1

葉組織橫切面顯微特征。向日葵葉上下表皮均為一層細(xì)胞，長方形，排列緊密，下表皮較上表皮小，上下表皮均可見非腺毛、氣孔分布，但下表皮氣孔較多;柵欄細(xì)胞1列，位于上表皮下方，長條狀，占整個(gè)葉肉組織的50%左右;海綿組織為薄壁細(xì)胞構(gòu)成，排列疏松，有豐富的細(xì)胞間隙，占整個(gè)葉肉組織的50%左右;主葉脈維管束外韌型，導(dǎo)管放射狀排成多列;靠近葉柄表皮處可見厚角細(xì)胞。詳見圖1。

2.2.2

葉粉末顯微特征。向日葵葉粉末深綠色。非腺毛通常由3～8個(gè)細(xì)胞組成，直徑30～70 μm;腺毛多細(xì)胞，通常為6～9個(gè)細(xì)胞組成，內(nèi)含分泌物;螺紋及環(huán)紋導(dǎo)管易見，5～55 μm;厚角細(xì)胞長條形，細(xì)胞壁增厚;上下表皮細(xì)胞表面觀呈不規(guī)則形，細(xì)胞壁波狀彎曲，上下表皮均有氣孔，為不定式氣孔，副衛(wèi)細(xì)胞常3～4個(gè)。詳見圖2。

2.3 薄層鑒別 按“1.2.2”的薄層鑒別方法，向日葵葉在對照品相應(yīng)位置有相同的熒光斑點(diǎn)，見圖3。

2.4 綠原酸含量的測定

按“1.2.3”高效液相色譜法測定，向日葵葉色譜圖見圖4。通過該色譜條件測得開花期、果實(shí)成熟期向日葵葉中綠原酸含量分別為1.25和2.34 mg/g。

2.5 向日葵葉醇提物抗炎作用研究

2.5.1 向日葵葉醇提物對小鼠耳腫脹的影響。

按“1.2.4”方法將小鼠分組給藥，向日葵葉醇提物對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響如圖5和表1所示。結(jié)果顯示，向日葵葉醇提物高、中、低劑量組對二甲苯致小鼠耳腫脹有顯著的抑制作用（P<0.01），向日葵葉醇提物高、中、低劑量組和陽性對照組（地塞米松磷酸鈉注射液組）與空白對照組比較，小鼠耳腫脹程度減小，且腫脹程度與劑量呈依賴關(guān)系。

2.5.2 向日葵葉醇提物對小鼠足腫脹的影響。

按“1.2.4”方法將小鼠分組給藥，向日葵葉醇提物對角叉菜膠致小鼠足腫脹的影響如圖6和表2所示。結(jié)果顯示，向日葵葉醇提物高、中、低劑量組對角叉菜膠致小鼠足腫脹有明顯的抑制效果（P<0.01），向日葵葉醇提物高、中、低劑量組和陽性對照組與空白對照組比較，小鼠足腫脹程度減小，且腫脹程度與劑量呈依賴關(guān)系。

3 結(jié)論與討論

向日葵葉的鑒別研究表明，葉橫切面可以腺毛、非腺毛、維管束排列類型作為鑒別特征，粉末可以表皮細(xì)胞、氣孔、腺毛、非腺毛等作為鑒別特征。以乙酸丁酯-甲酸-水-冰醋酸（21∶12∶7.5∶1）為展開劑的薄層色譜結(jié)果顯示向日葵葉與綠原酸在同一位置有一致的熒光斑點(diǎn)，證明向日葵葉中存在綠原酸。目前向日葵的價(jià)值主要集中在果實(shí)上，對向日葵葉的利用極低，向日葵葉又是其主要部位，以高效液相色譜法測定處于開花期和果實(shí)成熟期的向日葵葉中綠原酸含量，分別為1.25、2.34 mg/g。向日葵葉醇提物高、中、低劑量組對角叉菜膠致小鼠足腫脹有明顯的抑制效果，對二甲苯致小鼠耳腫脹也有顯著的抑制作用（P<0.01），且都存在劑量依賴性，因此能證明向日葵葉醇提物具有良好的抗炎效果?？梢栽撗芯繛榛A(chǔ)研發(fā)相關(guān)產(chǎn)品，使向日葵得到充分的利用，提高其經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

向日葵作為藥食兩用植物，在農(nóng)村范圍廣泛種植，不僅廉價(jià)易得，且便于儲(chǔ)存，目前主要以種子食用。向日葵作為一種新興的藥用植物，不僅療效顯著，并且安全無毒，具有良好的開發(fā)前景，在中藥資源緊缺的情況下，對向日葵藥用價(jià)值進(jìn)行研究，為中藥資源開發(fā)提供依據(jù)，有利于實(shí)現(xiàn)中藥資源的可持續(xù)發(fā)展，促進(jìn)農(nóng)村農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展。

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