生髓健骨膠囊對酒精性骨質(zhì)疏松大鼠TNF-α、TGF-β1和空骨陷窩的影響

任樹軍，劉俊桐，于長江，姜 磊，譚福柱，申意偉，徐西林

（1. 黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2. 黑龍江中醫(yī)藥大學研究生院，黑龍江 哈爾濱 150040；3. 重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W校附屬中醫(yī)院，重慶 404000；4.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001）

酒精性骨質(zhì)疏松癥是指長期攝入過多的酒精后，骨的結(jié)構(gòu)退變以致骨量縮減及易于發(fā)生骨折的周身性骨骼疾病［1］。據(jù)流行病學調(diào)查結(jié)果顯示，人均年飲純酒精量高達3.6 L［2］。研究表明酒精容易導致骨的代謝失衡，影響骨小梁的分布，從而導致骨折發(fā)生風險增加，甚至引起酒精性骨病。因此，完善相關(guān)研究對于預防酒精性骨質(zhì)疏松就顯得更為重要［3］。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）調(diào)控著骨的形成，主要包括細胞的分化、增殖以及功能活動［4］，與骨的代謝過程關(guān)系十分密切，其中TNF-α 是能夠影響骨的代謝平衡并具有廣泛活性的因子，是迄今為止發(fā)現(xiàn)最強的活性因子之一［5］；TGF-β1具有調(diào)節(jié)細胞生化和生長的活性因子功能［6-8］?？展窍莞C能夠在鏡下直觀地反映骨骼被破壞的程度，空骨陷窩率是否降低是檢測修復骨破壞的重要指標［9］。

本實驗通過建立酒精性骨質(zhì)疏松癥大鼠模型，研究生髓健骨膠囊對酒精性骨質(zhì)疏松大鼠TNF-α、TGF-β1及空骨陷窩率的影響，為指導臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗中心供應(yīng)月齡平均為6 個月的成年雄性SD 大鼠（清潔級）120 只，體重（220±20）g，合格證號：SCXK（黑）20160103。

1.2 實驗藥物及器材

生髓健骨膠囊（黑龍江中醫(yī)大一院制劑室，黑藥制字Z20110036，執(zhí)行標準：黑Z-ZJ-0560-2010，規(guī)格：0.35 g/粒）；碳酸鈣片（規(guī)格：500 mg/片，吉林萬通藥業(yè)有限公司，批準文號：國藥準字H10980201）；阿法D3（Teva Pharmaceutical Industries Ltd ，批準文號國藥準字J20130162）；免疫組化試劑盒：SP Kit盒（小鼠P 物質(zhì)受體SP-RELISA Kit 試劑盒）（上海信裕生物科技有限公司，批號：SP-0023）；白酒（規(guī)格：500 mL/瓶，紅星牌55°二鍋頭白酒，北京紅星有限股份公司，批號：B1707039，執(zhí)行標準：QS1100-1501-0349）；0.9%NaCl 注射液（規(guī)格：500 mL/袋，四川太平洋藥業(yè)有限公司，批號：1706150505）；蘇木染色液及伊紅染色液（上?？茀R生物技術(shù)有限公司）；電子顯微鏡（XK-DS500A 型，深圳市西尼科光電有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗?zāi)Ｐ头纸M 在黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心飼養(yǎng)的大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，按隨機數(shù)字表法分為4 組，每組30 只，分籠喂養(yǎng)。

1.3.2 建立實驗動物模型 模型組、西藥對照組和中藥干預組：每日上午均用白酒灌胃造模，劑量以10 mL/kg（酒精量4.4 g/10 mL）為準。模型組：下午用等量0.9%NaCl 注射液灌胃。每日一次。西藥對照組：下午用碳酸鈣、阿法D3 混懸液與0.9%Na-Cl 注射液配制混懸液灌胃（碳酸鈣的用量標準為85 mg·10 mL-1·kg-1，阿法D3 的用量標準為0.05 μg·10 mL-1·kg-1）。每日一次。中藥干預組：下午用生髓健骨膠囊與0.9%NaCl 注射液配制混懸液灌胃（用量標準為4.7 g·10 mL-1·kg-1）。每日一次?？瞻捉M：用等量0.9%NaCl 注射液每日上、下午灌胃兩次。各組大鼠灌胃容量為10 mL/kg，灌胃給藥時間為16周。實驗期間，大鼠在同等條件下喂食，并根據(jù)每周的體重調(diào)整用藥的劑量［10］。

1.4 取材及檢測方法

于實驗干預后的8、12、16 周時，各組隨機抽取實驗大鼠10 只，早晨空腹（以空腹10 h 以上為標準）用脊柱脫臼法處死后取右股骨上段做免疫組化檢測，將提取的股骨組織做成玻片標本，在顯微鏡下進行試劑檢測，以酶標記的抗體與組織進行有色反應(yīng)，標記TNF-α、TGF-β1細胞因子，在電子顯微鏡下隨機選取5 個視野記錄TNF-α、TGF-β1數(shù)值。最后一次灌胃后，保持大鼠空腹狀態(tài)，12 h 后采集標本，進行檢測［11］。

解剖游離出左股骨，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，后置于15%乙二胺四乙酸中充分脫鈣。常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片厚度5 μm，行蘇木精-伊紅染色法（HE）染色。在光鏡下觀察骨小梁，骨髓腔，軟骨下各級骨細胞和骨干組織的變化及空骨陷窩。每組隨機任選10 個高倍視野，每個視野計數(shù)100 個骨陷窩，統(tǒng)計空骨陷窩數(shù)目，計算出空骨陷窩百分比，并進行顯微攝影。

1.5 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)用SPSS21.0 軟件進行處理，計量資料均數(shù)據(jù)以（±s）表示，各組間比較用單因素ANOVA 方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 TNF-α 和TGF-β1表達分析

根據(jù)造模干預8、12、16 周末檢測結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組的TNF-α 和空骨陷窩率明顯升高，TGF-β1明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），提示大量酒精攝入能夠?qū)е聦嶒灤笫蟮墓琴|(zhì)破壞以及骨代謝平衡的紊亂。與模型組相比，西藥對照組和中藥干預組的TNF-α 和空骨陷窩率明顯降低，TGF-β1明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），提示兩種方式的藥物干預能夠維持實驗大鼠的骨代謝平衡，同時骨破壞有所緩解。與西藥對照組相比，中藥干預組對指標的改善要優(yōu)于西藥對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1～3。

表1 8、12、16 周末各組大鼠股骨組織內(nèi)TNF-α 陽性細胞數(shù)比較（n=10，±s）Tab 1 Comparison of rats femoral tissue TNF-α at 8th 12th and16 weekend（n=10，±s）

表1 8、12、16 周末各組大鼠股骨組織內(nèi)TNF-α 陽性細胞數(shù)比較（n=10，±s）Tab 1 Comparison of rats femoral tissue TNF-α at 8th 12th and16 weekend（n=10，±s）

注：與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，■P＜0.01；與西藥對照組比較，□P＜0.05。

組別空白組模型組8 周末31.71±4.97 51.33±5.07*12 周末31.98±5.03 57.47±4.34*16 周末31.66±5.06 63.12±5.47*西藥對照組50.16±4.91#48.93±5.14#47.47±4.83#中藥干預組39.76±4.77■□38.27±5.34■□36.13±5.26■□FP 35.476 51.654 73.835＜0.01＜0.01＜0.01

表2 8、12、16 周末各組大鼠股骨組織內(nèi)TGF-β1陽性細胞數(shù)比較（n=10，±s）Tab 2 Comparison of rats femoral tissue TGF-β1 at 8th 12th and16 weekend（n=10，±s）

表2 8、12、16 周末各組大鼠股骨組織內(nèi)TGF-β1陽性細胞數(shù)比較（n=10，±s）Tab 2 Comparison of rats femoral tissue TGF-β1 at 8th 12th and16 weekend（n=10，±s）

注：與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，■P＜0.01；與西藥對照組比較，□P＜0.05。

組別空白組8 周末60.09±3.37 12 周末60.17±3.41 16 周末60.22±3.34模型組51.63±5.13*44.17±4.63*37.88±4.17*西藥對照組47.87±5.13#49.13±4.38#51.11±4.46#中藥干預組57.19±5.67■□56.97±4.25■□58.53±5.25■□FP 12.017 30.301 54.476＜0.01＜0.01＜0.01

表3 8、12、16 周末各組大鼠股骨組織內(nèi)空骨陷窩率比較（n=10，±s）Tab 3 Comparison of rats femoral tissue Lacuna at 8th 12th and16 weekend（n=10，±s）

表3 8、12、16 周末各組大鼠股骨組織內(nèi)空骨陷窩率比較（n=10，±s）Tab 3 Comparison of rats femoral tissue Lacuna at 8th 12th and16 weekend（n=10，±s）

注：與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，■P＜0.01；與西藥對照組比較，□P＜0.05。

組別空白組模型組8 周末13.00±1.63 20.80±1.75*12 周末13.20±1.62 22.10±2.08*16 周末12.90±1.66 23.00±1.49*西藥對照組19.70±1.64#19.20±1.55#18.10±1.91#中藥干預組18.60±1.43■□17.90±1.79■□16.20±1.55■□FP 136.307 137.389 133.282＜0.01＜0.01＜0.01

2.2 空骨陷窩結(jié)果觀察

根據(jù)8、12、16 周末實驗大鼠骨組織HE 染色光鏡觀察結(jié)果顯示：空白組骨小梁排列整齊、無斷裂。髓腔形態(tài)規(guī)整、無擴大，有大量紅骨髓存在。骨小梁上空骨陷窩數(shù)量稀少。軟骨下骨表層光滑。模型組骨小梁數(shù)量減少、變細，排列紊亂。髓腔擴大，紅骨髓減少，黃骨髓（脂肪組織）增多。骨小梁和骨干上空骨陷窩數(shù)量較空白組增多。骨干的骨細胞排列欠規(guī)整，少量細胞核固縮。西藥對照組骨小梁排列欠規(guī)整，無明顯斷裂。髓腔形態(tài)欠規(guī)整，紅骨髓比模型組增多，黃骨髓減少。骨小梁和骨干上空骨陷窩數(shù)量相對模型組減少。中藥干預組骨小梁排列較規(guī)整、無斷裂。髓腔形態(tài)無明顯擴大，有大量紅骨髓存在。骨小梁和骨干上空骨陷窩數(shù)量較模型組減少。軟骨下骨表層較光滑。軟骨下各級的骨細胞排列較整齊、均勻，成熟骨細胞相對增多。骨干的骨細胞排列較整齊，有少量核固縮。見圖1。

圖1 各組實驗大鼠骨組織HE 染色結(jié)果（×400）Fig 1 The results of HE staining in bone tissue of rats in each group（×400）

3 討論

長期攝入過量的酒精后，可造成骨皮質(zhì)變薄、骨小梁減少、骨量縮減及骨代謝改變，從而導致骨折風險增加。成骨細胞與破骨細胞的動態(tài)平衡是維持骨代謝平衡的基礎(chǔ)［12］。成骨細胞對骨生長的影響小于破骨細胞對骨吸收的影響是形成骨質(zhì)疏松的根本原因［13］。研究顯示TNF-α 在破骨細胞的前期階段能夠通過細胞表面受體的傳導，刺激并形成新的破骨細胞，間接促進破骨細胞的快速分化以及破骨細胞的增殖和功能活性。因此TNF-α 能抑制破骨細胞的凋零并導致骨吸收的增加［14］。同時TNF-α 能抑制前成骨細胞的分化，抑制新骨的形成及鈣化的過程，從而降低骨小梁數(shù)量、骨皮質(zhì)密度［15］。成骨細胞的分化過程是骨基質(zhì)的主要來源，而TGF-β1是骨基質(zhì)中含量最多的活性因子之一。所以TGF-β1能夠通過刺激成骨細胞從而促進新骨的形成和加快新骨鈣化的進程［16］。同時TGF-β1能夠促進前成骨細胞中活性因子的合成與重組，從而促進成骨細胞的生成及其功能活性的增強，并能通過抑制破骨細胞的表達從而降低其增殖和活性［17］。TGF-β1促進成骨細胞的增殖，促進其向成熟型轉(zhuǎn)化，從而降低骨吸收維持骨代謝的動態(tài)平衡。因此，TGF-β1對骨的修補和構(gòu)建有著重要作用。所以TGF-β1被認為是與骨代謝的平衡關(guān)聯(lián)十分密切的因子［18］。

中醫(yī)根據(jù)酒精性骨質(zhì)疏松癥其臨床癥狀，將其歸為“骨痿”的范疇。中醫(yī)認為腎精不足、腎氣不固是骨質(zhì)改變的根本原因［19］。所以酒精性骨質(zhì)疏松癥其病變在骨，其本在腎［20］。脾為后天之本，主肌肉，為氣血生化之源。腎虛則脾化生無力，脾虛則生化無源以資腎［21］。所以補腎益脾為治療酒精性骨質(zhì)疏松癥的主要治則。生髓健骨膠囊由《醫(yī)學正傳》中鹿角膠丸化裁而成，方中以龜板和鹿角膠為主藥，鹿角膠善于益腎養(yǎng)陽，龜板偏于益氣滋陰，兩藥同用，陰陽并補，陽得陰助而生化無窮，陰得陽升而泉源不竭，陰陽共濟故能補腎以資先天；以黃芪、熟地黃等為臣藥，黃芪長善于升陽補氣，熟地善于補血滋陰，血為氣之母。氣為血之帥，陰陽并補，故能健脾補后天，脾化生無窮［22］。前期研究顯示生髓健骨膠囊對酒精性骨質(zhì)疏松癥有良好的治療作用［23］。

文獻顯示過量飲酒可引起內(nèi)分泌紊亂，促進TNF-α 的表達，從而加速破骨細胞的形成［24］。生髓健骨膠囊具有補腎健脾、強壯筋骨的功效，能夠調(diào)節(jié)內(nèi)分泌的紊亂狀況，對成骨細胞的形成有促進作用。隨著內(nèi)分泌紊亂的糾正，抑制了TNF-α 的表達。生髓健骨膠囊調(diào)節(jié)大鼠的體內(nèi)代謝，保證Wnt/BMP-2 通路的正常，促進骨細胞分泌TGF-β1。同時抑制成骨細胞的凋亡，促進成骨細胞分泌TGF-β1，并可以使IGF-1 促生長因子自身磷酸化從而促進TGF-β1表達。髖關(guān)節(jié)是主要的負重關(guān)節(jié)，正常情況下股骨頭內(nèi)骨小梁排列緊密，在股骨受壓應(yīng)力和剪切力集中區(qū)如股骨距，骨小梁明顯增粗增多，這是長期演化的結(jié)果。但當某種致病因素打破骨代謝的平衡，破骨細胞活性增強，成骨細胞活性減弱，新骨生成減少而骨細胞壞死增加，繼而出現(xiàn)空骨陷窩數(shù)增加，即空骨陷窩率升高［25］，導致骨質(zhì)疏松。正常股骨頭空骨陷窩率小于13%，空骨陷窩是骨細胞死亡的直接證據(jù)，直觀地反映了骨壞死的程度［26］。生髓健骨膠囊通過調(diào)整骨代謝能夠降低空骨陷窩率，提示對酒精性骨質(zhì)疏松大鼠的骨破壞有一定的修復作用。

本課題實驗結(jié)果顯示生髓健骨膠囊能減弱酒精性骨質(zhì)疏松大鼠骨組織中TNF-α 的表達，增強TGF-β1的表達，降低空骨陷窩率，維持骨代謝過程的動態(tài)平衡并對骨壞死具有一定的修復作用，達到防治酒精性骨質(zhì)疏松的目的，為臨床治療提供依據(jù)和參考。

作者貢獻度說明：

任樹軍：統(tǒng)籌實驗，協(xié)調(diào)實驗室與設(shè)備；劉俊桐、于長江：論文撰寫；姜磊、譚福柱：記錄及統(tǒng)計實驗數(shù)據(jù)；徐西林、申意偉：實驗室的日常維護及耗材的更新。