基于網(wǎng)絡藥理學探討龜鹿二仙膠治療骨質(zhì)疏松癥的作用機制

劉 朋，楊鶇祥，于冬冬，王秀婷

（1.遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 沈陽 110847；2.遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110032）

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是一種以骨量降低、骨組織微結(jié)構(gòu)破壞，致使骨脆性增加，易發(fā)生骨折為特點的全身性骨骼疾?。?］。據(jù)統(tǒng)計，全世界60 歲以上人群中，超過2 億女性患有OP，且每年約有900 多萬人因為OP 導致骨折［2］。OP 發(fā)病機制較為復雜，與年齡、性別及生活方式等密切相關。目前對于OP 發(fā)病機制的研究主要集中在細胞分化與凋亡、成骨/破骨相關信號通路和基因多態(tài)性等方面［3］。西醫(yī)治療主要采用骨吸收抑制劑、骨形成促進劑及骨礦化藥物等，許多藥物副反應和藥物間的相互影響較多，如長期應用激素類藥物可增加乳腺癌及心血管事件的發(fā)生風險［4］。因此，對于OP 的臨床治療與管理方案有待進一步優(yōu)化。

根據(jù)OP 的臨床表現(xiàn)，可將其歸屬于中醫(yī)“骨痿”、“骨痹”、“骨枯”等范疇?！端貑枴ゐ粽撈诽岬健澳I主身之骨髓……腎氣熱，則腰脊不舉，骨枯而髓減，發(fā)為骨痿”；《靈樞·經(jīng)脈》曰：“足少陰氣絕，則骨枯”。因此OP 的發(fā)病機制與腎精虧虛密切相關。龜鹿二仙膠原載于明代王三才所著的《醫(yī)便》，方中人參大補元氣、枸杞子補腎益精，鹿、龜二膠既能補氣生精、滋腎陰、壯腎陽，又能補后天脾胃以助“氣血生化之源”，全方共奏補腎填精、益氣壯骨之功效。齊鵬坤等［5］采用龜鹿二仙湯合阿侖膦酸鈉治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥，治療6 個月后患者骨密度及腰背疼痛VAS 評分均明顯改善，且效果優(yōu)于單純西藥治療。王欣燕等［6］研究發(fā)現(xiàn)龜鹿二仙膠可以提高患者血清骨硬化素水平并降低血清β 膠聯(lián)降解產(chǎn)物、骨鈣素和總I 型原膠原N 端前肽水平，從而減少骨吸收并提高骨骼質(zhì)量。

網(wǎng)絡藥理學最早是由Hop-kins 提出的研究方法，該方法首先通過公共數(shù)據(jù)庫及文獻檢索，結(jié)合生物信息學技術篩選出已知藥物成分及特定疾病的靶點信息，然后利用網(wǎng)絡可視化工具構(gòu)建“活性成分-靶點-通路-疾病“的網(wǎng)絡模型，最后通過多層次分析找出活性成分與疾病相關聯(lián)的關鍵節(jié)點，從而預測藥物防治疾病的藥理學機制［7］，體現(xiàn)了中藥復方”多成分、多靶點、多途徑“的特點，符合中醫(yī)藥對疾病本質(zhì)的認識。本研究采用網(wǎng)絡藥理學的研究方法，探討龜鹿二仙膠治療OP 可能的作用靶點及相關信號通路，以期對龜鹿二仙膠的臨床應用及OP 的后續(xù)研究提供相應的思路及依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 龜鹿二仙膠化合物及活性成分篩選

利用中藥系統(tǒng)藥理學技術平臺（TCMSP，http：//tcmspw. com/tcmsp. php）、ETCM 數(shù)據(jù)庫（http：//www.tcmip.cn/）、化學專業(yè)數(shù)據(jù)庫（http：//www.organchem.csdb.cn/）和DrugBank 數(shù)據(jù)庫（https：//www.drugbank.ca/）檢索龜鹿二仙膠中龜甲膠、鹿角膠、人參、枸杞子所含有的化合物。其中人參、枸杞子含有的化合物在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中檢索，龜甲膠、鹿角膠含有的化合物在TCMSP 中檢索不到，故在ETCM 數(shù)據(jù)庫、化學專業(yè)數(shù)據(jù)庫和Drug-Bank 數(shù)據(jù)庫中檢索。依據(jù)藥物ADME（absorption，distribution，metabolism，excretion）特性，以口服生物利用度（oralbioavailability，OB）和類藥性（druglikeness，DL）作為篩選指標，篩選閾值為OB≥30%，DL≥0.18，篩選出符合條件的活性成分，龜甲膠和鹿角膠含有的化合物雖然不符合ADME 篩選標準，但通過查閱文獻發(fā)現(xiàn)，龜甲中含有能促進MSCs 向成骨細胞分化的化合物［8］，鹿角膠中含有多種氨基酸，有能促進鈣吸收及骨礦化的化合物［9］，因此將這些化合物作為龜甲膠和鹿角膠的活性成分納入進行分析。

1.2 龜鹿二仙膠潛在靶點和OP 相關疾病靶點的篩選

基于TCMSP 數(shù)據(jù)庫，將龜甲膠、鹿角膠、人參、枸杞子的活性成分逐一配對潛在靶點，利用Uniprot數(shù)據(jù)庫中UniprotKB 搜索功能（http：//www.uniprot.org/）輸入蛋白名稱并限定物種為“human”，將檢索得到的所有蛋白校正為其官方名稱，即為活性成分的預測作用靶點。

OP 已知治療靶點獲取以“osteoporosis”為關鍵詞分別從OMIM（https：//www.omim.org/）和Genecards（https：//www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫中檢索，所得靶點即為OP 已知治療靶點。

1.3 龜鹿二仙膠活性成分靶點與OP 相關治療靶點相互作用網(wǎng)絡

將得到的龜鹿二仙膠的活性成分基因和OP 疾病基因結(jié)果輸入在線韋恩圖平臺（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）獲得交集基因和韋恩圖，并利用Cytoscape3.8.0 軟件構(gòu)建可視化圖片。 利用STRING 平臺（https：//string-db.rog/），將OP 的已知治療靶點映射到龜鹿二仙膠活性成分的靶點上，物種選擇Homosapiens，隱藏游離蛋白，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡（proteinproteininteraction，PPI），并下載PPI 蛋白互作關系圖，篩選前30 個PPI 網(wǎng)絡核心基因，構(gòu)建柱狀圖。

1.4 GO 功能和KEGG 通路富集分析

采用R 4.0.2 的Bioconductor 生物學數(shù)據(jù)包進行基因GO 功能和KEGG 通路富集分析，據(jù)統(tǒng)計學意義，設置P值為0.05，q 值為0.05 進行GO 生物學富集分析和KEGG 通路富集分析，輸出結(jié)果并繪制barplot 柱狀圖和氣泡圖，最后分析結(jié)果討論龜鹿二仙膠對于OP 的治療機制。

2 結(jié)果

2.1 龜鹿二仙膠化合物、活性成分及潛在靶點的收集與篩選

利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫按照OB≥30%，DL≥0.18 的標準進行篩選，獲得人參22 個活性成分，枸杞子45 個活性成分，龜甲膠15 個活性成分，鹿角膠14 個活性成分，全方共得到活性化合物96 個，剔除重復成分后剩余87 個活性成分。基于TCMSP 數(shù)據(jù)庫將活性成分逐一與潛在靶點配對，剔除無靶點活性成分，最后人參748 個靶點，枸杞子1 202 個靶點，龜甲膠-鹿角膠761 個靶點，全方共2 711 個靶點。通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫將靶點名校正為官方名稱并剔除重復，最終龜鹿二仙膠共有87 個活性成分，2 305 個靶點。

2.2 骨質(zhì)疏松癥的已知疾病靶點篩選

從OMIM，Genecards 數(shù)據(jù)庫中共檢索到4 278個OP 有關的已知治療靶點，刪除重復項后共4 141個靶點。

2.3 龜鹿二仙膠活性成分靶點與骨質(zhì)疏松癥靶點交集基因

將龜鹿二仙膠活性成分靶點與OP 的靶點基因?qū)隕xcel 中獲得龜鹿二仙膠-骨質(zhì)疏松癥的共同靶點，利用在線韋恩圖平臺繪制韋恩圖，記錄共同靶點所對應的骨質(zhì)疏松癥關鍵化合物，剔除無關化合物。最終得到與龜鹿二仙膠-骨質(zhì)疏松癥相關化合物50 個，共同靶點71 個。見表1、圖1。

圖1 龜鹿二仙膠－骨質(zhì)疏松癥交集基因韋恩圖Fig 1 Venny map of Guilu Erxian Gum-osteoporosis intersection gene

表1 龜鹿二仙膠治療骨質(zhì)疏松癥交集基因Tab 1 Intersection gene of Guilu Erxian Gum in the treatment of osteoporosis

2.4 龜鹿二仙膠-骨質(zhì)疏松癥靶點可視化網(wǎng)絡構(gòu)建

將獲得的交集基因?qū)隒ytoscape3.8.0 軟件中，構(gòu)建龜鹿二仙膠-骨質(zhì)疏松癥可視化網(wǎng)絡（圖2），網(wǎng)絡中共123 個節(jié)點（71 個基因，50 個關鍵化合物，1 個疾病名稱，1 個藥物名稱），其中紅色矩形表明50 種關鍵活性成分，活性成分括甾體類、黃酮類等。藍色菱形代表71 個交集基因。根據(jù)節(jié)點度數(shù)進行排序，排名前四位的化學成分分別是：槲皮素quercetin（54）、β-谷甾醇beta-sitosterol（11）、甘氨酸glycine（11）、豆甾醇Stigmasterol（9），排名前四位的靶點分別是PGR、PTGS1、NCOA2、GABRA1。

圖2 龜鹿二仙膠-骨質(zhì)疏松癥可視化網(wǎng)絡Fig 2 Guilu Erxian Gum-osteoporosis visualization network

2.5 PPI 網(wǎng)絡構(gòu)建

將獲得的71 個交集基因輸入STRING 軟件中得到圖3，其中每個節(jié)點代表相關蛋白，每條邊代表蛋白與蛋白相互作用關系，其邊數(shù)數(shù)量與相關蛋白核心程度呈正相關，選取排名靠前的30 個蛋白構(gòu)建柱狀圖（圖4），前30 個蛋白名稱分別為：ALB、IL-6、VEGFA、CASP3、MAPK8、EGFR、ESR1、MYC、CCND1、FOS、AR、CTNNB1、ERBB2、PPARG、RELA、CASP8、AHR、NOS3、PGR、HIF1A、ICAM1、CASP9、CAV1、CCNB1、ESR2、RB1、VCAM1、PARP1、HSPB1、NFKBIA。這些蛋白對于骨質(zhì)疏松癥的治療起關鍵作用。

圖3 龜鹿二仙膠－骨質(zhì)疏松癥蛋白相互作用核心網(wǎng)絡Fig 3 Core net work of interaction between Guilu Erxian Gum and osteoporosis protein

圖4 核心蛋白柱狀圖Fig 4 Core protein histogram

2.6 GO 富集分析

龜鹿二仙膠治療OP 核心靶點基因的GO 功能富集分析結(jié)果見圖5。龜鹿二仙膠治療OP 的核心靶點基因的GO 功能主要涉及核受體活性、配體激活轉(zhuǎn)錄因子活性、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA 聚合酶Ⅱ特異性DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活物活性、類固醇激素受體結(jié)合、核激素受體結(jié)合、雌激素受體結(jié)合等。

圖5 龜鹿二仙膠活性成分治療骨質(zhì)疏松癥關鍵靶點的GO 生物學過程富集分析barplot 柱狀圖Fig 5 Barplot histogram of GO richment analysis of key targets of Guilu Erxian Gum in the treatment of osteoporosis

2.7 KEGG 通路富集分析

龜鹿二仙膠治療OP 核心靶點基因的KEGG 通路富集分析結(jié)果見圖6，龜鹿二仙膠治療OP 的核心靶點基因的KEGG 功能主要涉及：TNF 信號通路、細胞凋亡信號通路、IL-17 信號通路、內(nèi)分泌抵抗、p53 信號通路、NF-κB 信號通路、HIF-1 信號通路、MAPK 信號通路、PI3K-Akt 信號通路、Toll 樣受體信號通路、C 型凝集素受體信號通路、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥、破骨細胞分化、VEGF 信號通路等，按照P值由大到小進行排序，選取前15 條關鍵通路得到表2。

表2 龜鹿二仙膠治療骨質(zhì)疏松癥的關鍵信號通路Tab 2 Key signaling pathways of Guilu Erxian Gum in the treatment of osteoporosis

圖6 龜鹿二仙膠治療骨質(zhì)疏松癥關鍵靶點富集信號通路barplot 柱狀圖Fig 6 Barplot histogram of signaling pathway of key target enrichment of Guilu Erxian Gum in the treatment of osteoporosis

3 討論

OP 的發(fā)病是以腎精虧虛為根本［10］。龜鹿二仙膠是補腎的經(jīng)典方藥，具有補腎填精、益氣壯骨之功效，對于改善骨代謝、提高骨密度具有重要作用［11］。藥理研究表明［12］，龜鹿二仙膠含藥血清對骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）增殖及向成骨細胞分化具有明顯促進作用。龜甲、鹿角膠中含有的膠原蛋白、多肽及氨基酸等多種化學成分物具有顯著的強骨作用［13-15］。但目前尚缺乏龜鹿二仙膠治療OP 的相關實驗研究，故運用網(wǎng)絡藥理學進行初步探討。

本研究共篩選出龜鹿二仙膠治療OP 的活性成分50 個，關鍵靶點71 個。經(jīng)“藥物-活性成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡分析可知，槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇及甘氨酸等可能是龜鹿二仙膠治療OP 的關鍵活性成分。既往實驗表明［16］，槲皮素能夠通過上調(diào)BMP2和Smad4 表達從而促進成骨分化，發(fā)揮抗OP 的治療作用。除此之外，體外實驗［17］也證明槲皮素能促進BMSCs 的增殖及成骨分化，增加堿性磷酸酶（ALP）活性和礦化結(jié)節(jié)數(shù)目；β-谷甾醇可通過刺激卵巢顆粒細胞分泌雌二醇并升高成骨細胞骨保護因子（OPG）與破骨細胞分化因子比值，從而加強成骨作用［18］；鹿骨粉中甘氨酸等多種氨基酸成分可以提升OP 大鼠骨密度，改善尿鈣/尿肌酐比值及血清ALP 水平［19］。對于豆甾醇，可能是龜鹿二仙膠治療OP 的一種重要有效成分，目前暫無相關實驗研究，有待進一步驗證。

本研究表明，龜鹿二仙膠的主要有效成分可通過多個靶點基因影響OP 的發(fā)病。龜鹿二仙膠治療OP 的核心靶點基因主要有血清白蛋白（ALB）、白介素-6（IL-6）、VEGFA、胱冬酶3（CASP3）、促分裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）等，這些基因可通過介導骨吸收和骨形成來調(diào)控OP 的發(fā)生。目前認為營養(yǎng)不良是OP 發(fā)病的重要危險因素［20］，而ALB 是衡量機體營養(yǎng)狀況的重要指標，臨床及實驗研究顯示［21，22］，血清中ALB 水平減低與骨密度下降呈明顯正相關，提示了低ALB 水平與OP 的發(fā)病密切相關。胱冬酶3（CASP3）是細胞線粒體凋亡通路中的關鍵蛋白，正常情況下以非活化的形式存在，當細胞凋亡程序啟動時，CASP3 在蛋白水解酶的作用下被激活并與下游蛋白發(fā)生級聯(lián)反應，使凋亡發(fā)生［23］，因此調(diào)節(jié)成骨細胞和破骨細胞凋亡是許多中藥治療OP 的重要作用機制［24］。IL-6 與OP 的發(fā)病密切相關，血清IL-6 的升高是OP 發(fā)病的重要危險因素［25］，IL-6 能促進成骨細胞釋放IL-1、前列腺素E2等下游信號分子，降低OPG 表達并升高RANKL表達，從而促進破骨細胞形成，增強骨吸收活動［26］。徐俊［27］報道稱，防風多糖能夠通過調(diào)節(jié)細胞因子，降低去勢大鼠血清IL-6、腫瘤壞死因子-α 水平，從而減少OP 大鼠的骨吸收。血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）是VEGF 家族中誘導血管生成、增加血管通透性的關鍵細胞因子，也是傳統(tǒng)意義上的VEGF。研究發(fā)現(xiàn)［28］，正常健康人群體內(nèi)VEGF 表達較OP 人群中高的多，提示了其在維持骨代謝中有重要的作用。MAPK8 是MAPKs 家族的重要成員之一，其可通過磷酸化并活化激活蛋白-1，從而活化下游基因的表達，在細胞增殖、分化、存亡過程中起著重要調(diào)節(jié)作用［29］，目前研究發(fā)現(xiàn)其主要與癌癥的發(fā)病密切相關，但是針對MAPK8 在骨代謝方面研究較少。因此，需要進一步的研究來證實MAPK8 在OP 發(fā)病及治療中的潛在作用。

龜鹿二仙膠治療OP 的核心靶點基因的KEGG通路眾多，通過上述通路分析可知，龜鹿二仙膠治療OP 的相關途徑主要涉及：（1）調(diào)節(jié)炎性因子：研究發(fā)現(xiàn)［30］，Th17 細胞可以分泌IL-17，IL-22 等炎性因子，促進破骨細胞形成，加速骨吸收。IL-17 可通過上調(diào)組織蛋白酶k、基質(zhì)金屬蛋白酶9 的表達，強化破骨細胞降解骨基質(zhì)的能力［31］。劉金勇等［32］觀察龜鹿補骨方治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥臨床療效，并探究其對Th17/Treg 細胞因子的影響，實驗結(jié)果表明，龜鹿補骨方可以通過逆轉(zhuǎn)Th17/Treg 失衡、降低IL-17，IL-22 等促炎因子，從而減少骨量丟失，提高骨密度。（2）調(diào)節(jié)成骨/破骨細胞分化：PI3K/Akt信號通路與骨代謝關系密切，是調(diào)控骨骼組成細胞的重要通路［33］。研究發(fā)現(xiàn)［34］，應用LY294002 靶向抑制PI3K，可以明顯減少破骨細胞分化數(shù)量，并下調(diào)p38MAPK 通路中的原癌基因（c-fos）蛋白和基因表達水平，從而降低破骨細胞吸收功能；NF-κB 信號通路對成骨和破骨細胞分化、成熟有著重要調(diào)控作用［35］。研究發(fā)現(xiàn)［36］，通過敲除小鼠NF-κB1 和NF-κB2 基因可以使破骨細胞前體細胞向破骨細胞分化的能力明顯減弱，同時抑制破骨相關因子抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）、降鈣素受體等表達。張玉卓等［37］發(fā)現(xiàn)，龜甲水提取液可以明顯促進MC3T3-E1 向成骨細胞分化，并降低分化過程中NF-κBp65、NF-κBp105 和IL-6 的表達，提示其促進成骨分化機制與抑制NF-κB 信號通路及降低炎癥反應有關；研究發(fā)現(xiàn)［38］，去勢小鼠破骨細胞中HIF-1α 水平及骨吸收指標CTX-1 升高，通過HIF-1α 抑制劑干預后可以可以明顯逆轉(zhuǎn)這一情況，說明OP的發(fā)生與HIF-1 信號通路密切相關，抑制該通路可以起到抗OP 的治療作用。（3）改善微循環(huán)：VEGF具有很強的誘導血管生成的能力，是調(diào)節(jié)血管-成骨耦聯(lián)的重要細胞因子，其一方面可以可以直接促進成骨活動并減少骨吸收，另一方面還通過與VEGFR-2 及VEGFR-1 相互協(xié)同來調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞活動，促進骨內(nèi)血管網(wǎng)生成，從而改善骨代謝，增加骨密度［39］。王曉燕等［40］研究發(fā)現(xiàn)，大鼠去勢后骨髓微循環(huán)灌注及血管內(nèi)皮標志物CD31、VEGF 表達明顯減低，通過青娥丸干預后可有效改善這一情況，證明了青娥丸可通過改善骨髓內(nèi)微循環(huán)治療OP。（4）促進破骨細胞凋亡：于冬冬等［41］研究發(fā)現(xiàn)，鹿角膠丸能通過促進AKT 磷酸化、調(diào)節(jié)Bcl-2-Bax 復合體、增加Caspase-3 裂解，從而促進破骨細胞凋亡，且該作用機制能被PI3K/Akt 通路抑制劑所逆轉(zhuǎn)，提示鹿角膠丸促進破骨細胞凋亡與PI3-K/Akt 信號通路密切相關。

綜上所述，龜鹿二仙膠主要通過抑制炎癥反應、調(diào)控成骨/破骨細胞分化、改善骨內(nèi)微循環(huán)、促進破骨細胞凋亡等途徑調(diào)節(jié)骨代謝，從而治療OP。龜鹿二仙膠生物網(wǎng)絡復雜龐大，本研究通過構(gòu)建“活性成分-靶標”網(wǎng)絡對龜鹿二仙膠的核心活性成分以及作用靶標進行了預測，并進行生物信息學的數(shù)據(jù)分析，預測龜鹿二仙膠治療OP 的相關機制，引證現(xiàn)有研究結(jié)果，為后續(xù)的龜鹿二仙膠藥理機制研究提供了新的思路。