消渴健脾膠囊質(zhì)量標準研究*

丁然然，朱曉東，張麗娟，庫德熱提·阿吉，趙 媛，楊明霞△

（1.新疆醫(yī)科大學，新疆 烏魯木齊830000；2.新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市中醫(yī)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000）

消渴健脾膠囊是新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市中醫(yī)醫(yī)院院內(nèi)制劑，臨床療效確切［1?2］，由蒼術(shù)、白術(shù)、梔子等13味中藥材組方，具有燥濕健脾、行氣和胃、祛濁化郁功效，常用于脾虛濕盛型2型糖尿病的治療［3］，主要用于糖尿病及其并發(fā)癥的治療［4］，特別適用于西北地區(qū)的人群體質(zhì)、氣候因素及生活飲食習慣。但原質(zhì)量標準中藥味鑒別項較少，且無含量測定項，已不適用制劑的質(zhì)量控制［5］。梔子具有明顯的降糖活性，有效成分梔子苷是其發(fā)揮降糖活性的主要成分［6?7］，且含量較高，性質(zhì)穩(wěn)定。本研究中以梔子苷為定量評價指標，建立了消渴健脾膠囊的質(zhì)量標準，為提高其質(zhì)量和保證臨床療效提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；KQ?500DE型超聲儀（江蘇昆山超聲儀有限公司，功率為300 W，頻率為50 kHz）；WP?UP?IV?10 Water Purifier型超純水機（四川沃特爾科技有限公司）；硅膠G薄層板（青島海洋化工廠）；BX50?32H01型生物顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.2 試藥

落新婦苷對照品（上海中藥標準化研究中心，批號為30?2017，純度為98%）；梔子苷對照品（批號為120986?201610，純度為98.8%），梔子對照藥材（批號為120986?201510），大黃酚對照品（批號為110758?201507，純度為98.5%），大黃對照藥材（批號為120902?201311），茯苓對照藥材（批號為121117?201608），芥子堿硫氰酸鹽對照品（批號為111702?201605，純度為98.3%），萊菔子對照藥材（批號為121074?201402），葛根對照藥材（批號為121551?201103），葛根素對照品（批號為110752?201813，純度為98%），均購自中國食品藥品檢定研究院；消渴健脾膠囊（新疆華世丹藥業(yè)股份有限公司，批號分別為190102，190103，190104，180422，180423，180424，180425，180426，180427，180428）；乙腈（色譜純，美國Fisher公司）；其余試劑均為分析純，購自天津致遠化學試劑有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜（TLC）鑒別

土茯苓：取本品內(nèi)容物3 g，置25 mL具塞錐形瓶中，加甲醇15 mL，超聲（功率為300 W，頻率為50 kHz）處理40 min，過濾，取濾液作為供試品溶液。取除土茯苓以外的其他藥材，按處方工藝和供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。取落新婦苷對照品，加甲醇制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對照品溶液。按2015年版《中國藥典（一部）》通則0502 TLC法［8］19，吸取對照品溶液5 μL，供試品溶液和陰性對照品溶液各10 μL，依次點樣，以甲苯?乙酸乙酯?甲酸（13∶32∶9，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以新配制的三氯化鋁試液，5 min后置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置顯相同顏色的熒光斑點，且陰性對照無干擾。詳見圖1 A。

梔子：取本品內(nèi)容物5 g，置100 mL具塞錐形瓶中，加甲醇50 mL，加熱回流40 min，濾過，濾液蒸干，加水20 mL溶解殘渣，再用飽和的正丁醇溶液提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，加5 mL甲醇溶解殘留物，即得供試品溶液。取梔子對照藥材，按供試品溶液制備方法制備梔子對照藥材溶液。取除梔子以外的其他藥材，按處方和供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。取梔子苷對照品，加乙醇制成質(zhì)量濃度為4 mg/mL的對照品溶液。按按2015年版《中國藥典（一部）》通則0502 TLC法［8］284，取對照品溶液、對照藥材溶液各3μL，供試品溶液、陰性對照品溶液各6 μL，依次點樣，以乙酸乙酯?甲酸?冰醋酸?水（10∶0.5∶0.5∶1，V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%香草醛硫酸溶液，晾干至斑點顯色清晰。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液、對照藥材溶液色譜對應位置顯相同顏色的斑點，且陰性對照無干擾。詳見圖1 B。

大黃：取本品內(nèi)容物7 g，置50 mL具塞錐形瓶中，加甲醇30 mL，超聲（功率為300 W，頻率為50 kHz）處理30 min，濾過，取5 mL，濾液水浴蒸干，加10 mL水、1 mL鹽酸溶液溶解殘留物，加熱回流30 min后放至室溫，加20 mL乙醚提取2次，合并2次提取液，水浴蒸干，加2 mL三氯甲烷溶解殘留物，即得供試品溶液。取大黃對照藥材，按供試品溶液制備方法制備對照藥材溶液。取除大黃以外的其他藥材，按處方工藝和供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。取大黃酚對照品，加甲醇制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對照品溶液。按按2015年版《中國藥典（一部）》通則0502 TLC法［8］24，取對照藥材溶液、對照品溶液各4μL，供試品溶液、陰性對照品溶液各6μL，依次點樣，用石油醚（30～60℃）?甲酸乙酯?甲酸（15∶5∶1，V/V/V）上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液、對照藥材溶液色譜相應位置顯相同顏色的熒光斑點，且陰性對照無干擾。詳見圖1 C。

1.對照品溶液2.對照藥材溶液3?5.供試品溶液6.陰性對照品溶液A.土茯苓（365 nm）B.梔子（日光）C.大黃（365 nm）D.茯苓（365 nm）E.萊菔子（365 nm）F.葛根（365 nm）圖1薄層色譜圖1.Reference solution 2.Reference medicinal material solution 3?5.Test solution 6.Negative reference solutionA.Smilacis Glabrae Rhizoma（365 nm）B.Gardeniae Fructus（sunlight）C.Rhei Radix et Rhizoma（365 nm）D.Poria（365 nm）E.Raphani Semen（365 nm）F.Puerariae Lobatae Radix（365 nm）Fig.1 TLC chromatograms

茯苓：取本品內(nèi)容物3 g，置100 mL具塞錐形瓶中，加70%乙醇50 mL，超聲處理（功率為300 W，頻率為50 kHz）10 min，濾過，濾液蒸干，加2 mL甲醇溶解殘留物，即得供試品溶液。取茯苓對照藥材，按供試品溶液制備方法制備茯苓對照藥材溶液。取除茯苓以外的其他藥材，按處方工藝和供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。按按2015年版《中國藥典（一部）》通則0502 TLC法［8］251，取對照藥材溶液5 μL，供試品溶液、陰性對照品溶液各10 μL，依次點樣，以甲苯?乙酸乙酯?甲酸（20∶5∶0.5，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相對應位置顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾。詳見圖1 D。

萊菔子：取本品內(nèi)容物3 g，置100 mL具塞錐形瓶中，加乙醚60 mL，加熱回流60 min，揮去乙醚，加20 mL甲醇溶液，加熱回流60 min，濾過，蒸干，加2 mL甲醇溶解殘渣，即得供試品溶液。取萊菔子對照藥材，按供試品溶液制備方法制備對照藥材溶液。取除萊菔子以外的其他藥材，按處方工藝和供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。取芥子堿硫氰酸鹽對照品，加甲醇制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對照品。按按2015年版《中國藥典（一部）》通則0502 TLC法［8］284，取對照品溶液、對照藥材溶液各5 μL，供試品、陰性對照品溶液各10 μL，依次點樣，以乙酸乙酯?甲酸?水（10∶2∶3，V/V/V）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液、對照藥材溶液色譜相應位置顯相同顏色的熒光斑點，且陰性對照無干擾。詳見圖1 E。

葛根：取本品內(nèi)容物3 g，加甲醇25 mL，超聲（功率為300 W，頻率為50 kHz）處理20 min，濾過，蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，即得供試品溶液。取葛根對照藥材，按供試品溶液制備方法制備對照藥材溶液。取除葛根以外的其他藥材，按處方工藝和供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。取葛根素對照品，加甲醇制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對照品溶液。按2015年版《中國藥典（一部）》通則0502 TLC法［8］347，取對照品溶液、對照藥材溶液各5μL，供試品溶液、陰性對照品溶液各10μL，依次點樣，以二氯甲烷?甲醇?水（7∶2.5∶0.25，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液、對照藥材溶液色譜相應位置顯相同顏色的熒光斑點，且陰性對照無干擾。詳見圖1 F。

2.2 顯微鑒別

取膠囊內(nèi)容物適量，研成粉末，經(jīng)水合氯醛透化，加稀甘油1滴、間苯三酚1滴，幾分鐘后加濃硫酸1滴，經(jīng)顯微鑒別其特征性結(jié)構(gòu)?？梢?，藥物粉末纖維木化，呈長梭形，黃色，多成束（白術(shù)），草酸鈣方晶（葛根），草酸鈣簇晶（大黃），不規(guī)則顆粒狀團塊（茯苓），種皮內(nèi)表皮細胞類長方形（車前子）。詳見圖2。

2.3 梔子苷含量測定

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Cosmosil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈?水（9∶91，V/V）；流速：1 mL/min；柱溫：35℃；檢測波長：238 nm；進樣量：10μL。理論板數(shù)按梔子苷峰計應不低于2 000。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相同保留時間處有相應色譜峰出現(xiàn)，且陰性對照無干擾。色譜圖見圖3。

1.梔子苷A.對照品溶液B.供試品溶液C.陰性對照品溶液圖3系統(tǒng)適用性試驗高效液相色譜圖1.GeniposideA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.3 HPLC chromatograms of the system suitability test

A.白術(shù)B.葛根C.大黃D.茯苓E.車前子圖2顯微鑒別特征（×100）A.Atractylodis Macrocephalae Rhizoma B.Puerariae Lobatae Radix C.Rhei Radix et Rhizoma D.Poria E.Plantaginis SemenFig.2 Microscopic identification characteristics（×100）

2.3.2 溶液制備

取對照品8.652 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容，制成梔子苷質(zhì)量濃度為0.865 2 mg/mL的對照品貯備液；取2.5 mL置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，即得質(zhì)量濃度為0.216 3 mg/mL的對照品溶液。取膠囊內(nèi)容物，研成粉末，取粉末0.5 g，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲處理15 min，冷卻，加甲醇稀釋并定容，混勻，吸取上層澄清溶液，用微孔濾膜（0.45μm）濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按處方工藝取缺梔子藥材的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3.3 方法學考察

線性關(guān)系考察：精密量取質(zhì)量濃度為0.865 2 mg/mL的對照品溶液5 mL，置25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，得梔子苷質(zhì)量濃度為173.04μg/mL的溶液。分別精密吸取對照品溶液0.5，1.0，2.0，4.0，5.0 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，充分混勻。分別精密量取上述溶液10μL，按2.3.1項下色譜條件進樣分析。以質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=14.125X+7.112 6（r=0.999 6，n=5）。結(jié)果表明，梔子苷質(zhì)量濃度在8.652～173.040μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：取梔子苷對照品溶液，按2.3.1項下色譜條件進樣分析6次。結(jié)果峰面積的RSD小于0.66%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取同一批（批號為190102）樣品，研細，取0.5 g，精密稱定，共6份，依法制備供試品溶液，按2.3.1項下色譜條件進樣分析，計算梔子苷的含量。結(jié)果梔子苷的平均質(zhì)量濃度為1.69 mg/g，RSD小于2.13%（n=6），表明方法重復性良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一批（批號為190102）樣品，依法制備供試品溶液，按2.3.1項下色譜條件分別于0，3，6，12，18，24 h時進樣分析，記錄峰面積。結(jié)果峰面積的RSD為1.34%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗：采用標準加入法，取重復性試驗項下樣品粉末0.25 g（梔子苷含量為3.289 mg/g），精密稱定，共6份。按樣品含量的100%加入梔子苷對照品溶液，依法制備供試品溶液，按2.3.1項下色譜條件進樣測定，計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 梔子苷加樣回收試驗結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of the recovery rate of geniposide（n=6）

2.3.4 樣品含量測定

取10批樣品，依法制備供試品溶液，按2.3.1項下色譜條件平行檢測3次，各批樣品中梔子苷平均含量為3.292 mg/g。結(jié)果見表2。制劑中指標性成分的含量按80%設(shè)限［9］，初步擬訂消渴健脾膠囊中梔子苷的平均含量不得少于2.633 mg/g，各批樣品含量均符合要求。

表2 樣品含量測定結(jié)果（mg/g，n=3）Tab.2 Results of the content determination of geniposide in the samples（mg/g，n=3）

3 討論

3.1 TLC鑒別條件選擇

本研究中對消渴健脾膠囊中大黃、萊菔子等6味藥材進行了鑒別，所建立的TLC方法顯色清楚，分離良好，專屬性較強，無明顯拖尾，陰性對照無干擾，能快速實現(xiàn)對各藥材的鑒別。土茯苓、萊菔子的鑒定采用了2015年版《國家藥典（一部）》收錄的方法。梔子的鑒別參考文獻［10?11］，以甲醇作溶劑，梔子苷的提取率較高；以乙酸乙酯?甲酸?乙酸?純水（10∶0.5∶0.5∶1，V/V/V/V）為展開劑展開，比移值適中且分離度良好。茯苓鑒別參考文獻［12］，以75%乙醇處理樣品，雜質(zhì)較少，可排除干擾因素，調(diào)整展開條件［13］為石油醚（60～90℃）?乙醚（1∶1，V/V），分離效果較好。大黃的鑒別以大黃酚為對照品，結(jié)果供試品溶液、對照品溶液斑點清晰，指標性成分分離良好。葛根展開條件、顯色條件參考文獻［14?15］，將展開劑三氯甲烷?甲醇?水更改為二氯甲烷，并更改各相比例。因三氯甲烷屬危險化學品，具有致癌可能，綜合考慮后選擇二氯甲烷?甲醇?水作為展開劑。

3.2 色譜條件和提取條件選擇

消渴健脾膠囊成分復雜，干擾多。故考察了不同流動相［甲醇?0.2%磷酸水溶液［16］、甲醇?水（30∶70，V/V）［17］、乙腈?水（13∶87，V/V）［18］和乙腈?水（9∶91，V/V）］的洗脫狀況，考察指標定為色譜峰的峰形和分離度。采用乙腈?水（9∶91，V/V）流動相洗脫時，梔子苷色譜峰分離度大于1.5，對稱性良好，故流動相選用此系統(tǒng)。分別考察了超聲波處理和加熱冷凝回流處理樣品，發(fā)現(xiàn)超聲處理操作簡便，梔子苷的提取率更高，故選擇超聲處理。

3.3 方法評價

本研究中所建立的方法操作簡單，重復性好，結(jié)果準確，可用于控制消渴健脾膠囊的質(zhì)量。