MUC5AC在胃型宮頸腺癌組織中的表達及其臨床病理特征

褚小瑩，周永澤*

（1武漢大學中南醫(yī)院病理科，武漢 430071；2武漢大學病理中心，武漢 430071）

宮頸癌在全球女性死亡因素中排第4位，是一種嚴重危害女性健康的惡性腫瘤。浸潤性宮頸癌的組織學亞型主要包括鱗狀細胞癌和宮頸腺癌。宮頸癌中鱗狀細胞癌最常見，占總體發(fā)病率的80%，然而近幾年來宮頸腺癌的發(fā)病率呈明顯的逐年上升趨勢。在第5版《WHO女性生殖腫瘤分類》中關于宮頸腺癌的分類依賴于是否存在人乳頭狀瘤病毒 ( human papillomavirus, HPV ) 感染。約80%~90%的宮頸腺癌的發(fā)病與高危型HPV感染相關。在少數非HPV感染相關的宮頸腺癌中以胃型宮頸腺癌 (gastric-type endocervical adenocarcinoma, GAS ) 最為常見[1]。GAS由日本病理學家于2007年首次報道[2]，是一種侵襲性極強的惡性腫瘤，5年疾病生存率僅為30%，而HPV相關性宮頸腺癌的5年疾病生存率為77%[3]。GAS通常出現在晚期，有骨盆播散的趨勢，特別是卵巢、腹膜、大網膜和遠處轉移[4]。

GAS臨床表現較輕微，患者初期癥狀無特異性，主要以陰道排液及陰道不規(guī)則出血為首發(fā)癥狀。GAS表現出從分化良好到分化較差的腺癌組織學形態(tài)特征[5]，并與HPV相關的宮頸腺癌形態(tài)學特征重疊。大多數早期GAS患者形態(tài)學與良性病變相似，主要表現為粘液性腺體大小不均勻且數目增多，可見腺體有分支，呈角狀，有輕度異型性且出現浸潤性生長模式。因此，準確診斷宮頸腺癌變異是適當治療的關鍵。單純依靠形態(tài)學診斷GAS較為困難，其誤診率高達34%。部分患者由于病理確診時機延誤，導致影響治療并預后較差。因此，在臨床病理診斷過程中有效發(fā)現并利用免疫組織化學表型對于GAS的準確診斷至關重要。

材料與方法

1 臨床資料

本研究收集 2019 年 7 月1日至 2020 年12月31日于武漢大學中南醫(yī)院通過病理診斷為宮頸腺癌患者共82例，其中GAS癌患者5 例。回顧分析 5 例GAS癌患者的臨床首發(fā)癥狀、腫瘤標志物、HPV感染情況、TCT細胞學情況、病理形態(tài)學特征、免疫組織化學及組織化學染色等資料。經病理科兩位主治醫(yī)師在“雙盲”的前提下，根據國際宮頸腺癌標準和分類標準對82例宮頸腺癌患者的組織學切片進行重新閱片并將其分為兩組：HPV相關性宮頸腺癌和非HPV相關性宮頸腺癌。HPV相關性宮頸腺癌相對容易識別，腫瘤細胞頂部常見核分裂象和凋亡小體。GAS（包括微偏腺癌）的診斷標準包括：腫瘤細胞含有豐富胞漿, 胞漿透明、泡沫樣或輕度嗜酸，細胞邊界相對清晰。按 2009 年國際婦產科聯盟（FIGO）分期分析[6]，該5例GAS患者中Ia期患者1例，Ⅱa期患者2例（其中一例伴有盆腔淋巴結轉移），Ⅱb期患者2例。5 例GAS患者均行宮頸癌根治性手術治療。

2 試劑

p16（克隆號：1C1）、p53（克隆號：D0-7）、ER（克隆號：EP1）、PR（克隆號：EP2）、CK7（克隆號：UMAB161）、MUC6（克隆號：MRQ-20）、CEA（克隆號：12-140-10）、Ki-67（克隆號：UMAB107）、MUC5AC（克隆號：MRQ-19）、PAX8（克隆號：0TI6H8）、MUC2（克隆號：Ccp58）及CDX2（克隆號：EP25）即用型抗體均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。Envision FLEX/HRP試劑和乙二胺四乙酸（EDTA）抗原修復液購自丹麥DAKO公司。AB-PAS試劑盒購自珠海貝索生物技術有限公司。

3 EnVision法免疫組織化學染色及判讀標準

5例GAS手術標本經4%中性甲醛固定液固定后規(guī)范取材，標本經組織脫水及石蠟包埋后切3~4 μm厚組織切片；石蠟切片置于80 ℃烤箱中烘烤20 min，冷卻至室溫后二甲苯I、II中各脫蠟10 min，梯度乙醇水化；PBS沖洗3 min×3次；pH 6.0的EDTA抗原修復液中高溫高壓修復2 min；PBS沖洗3 min×3次；于DAKO全自動免疫組織化學儀（Autostainer Link 48）中進行后續(xù)操作：3% 過氧化氫孵育10 min，PBS沖洗1 min×3次；即用型一抗室溫孵育1 h，PBS沖洗1 min×3次；EnVision FLEX/HRP 室溫孵育20 min，PBS沖洗1 min×3次；DAB室溫顯色10 min。蘇木素復染，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片。

免疫組織化學結果判讀：由臨床病理診斷醫(yī)師根據陽性細胞所占百分比及細胞染色強度進行綜合分析判定（表1）。評定分數 = 表達強度評分×表達細胞數評分，得分≤4 分判定為陰性表達，＞4分判定為陽性表達。

表1 免疫組織化學檢測評分標準Tab.1 Scoring criteria for immunohistochemistry

4 AB-PAS組織化學染色

石蠟切片常規(guī)脫蠟并蒸餾水洗5 min，愛先藍（pH 2.5）作用20 min后流水沖洗，高碘酸溶液氧化10 min，蒸餾水洗2 min，浸入schiff 試劑中室溫避光染色15~20 min，流水沖洗5 min，蘇木素染液（Mayer）中染細胞核5 min，流水沖洗返藍3 min，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片。

結 果

1 GAS患者臨床病理特征

2019 年 7 月1日至 2020 年12月31日于武漢大學中南醫(yī)院通過病理診斷為宮頸腺癌患者共82例，其中GAS癌患者5 例（表2）?；颊咧形荒挲g 46歲（37~66歲）。主要臨床首發(fā)癥狀為透明狀無異味的陰道流液（3/5，60%），陰道不規(guī)則流血（2/5，40%）。腫瘤標志物有不同程度升高，HPV檢測均為陰性 (0/5，0%)。TCT均未見明顯異性細胞。陰道鏡檢查無特異性發(fā)現。5例患者中腫瘤組織最大徑2.5~4.0 cm不等，其中3例患者可見盆腔淋巴結轉移（3/5，60%）。5例患者均未見輸卵管及卵巢的受累，可見不同程度的脈管癌栓（3/5，60%）及神經侵犯（2/5，40%）。

表2 5例GAS患者臨床病理特征分析Tab.2 Analysis of clinicopathological features in five patients with GAS

2 GAS組織學特征

GAS活檢標本鏡下可見大量分化較好的黏液腺體，病理學特征與良性病變相似，因此在臨床外檢工作中對于GAS的判定存在一定困難。本研究中的5例GAS患者組織學均表現為高至中等分化的區(qū)域，部分腺體增生呈輕微異型性，腫瘤腺體大小不一，腺體形狀常呈現出分支或尖角狀，局部擁擠。另外，腺體具有浸潤性生長的特點，浸潤深度是GAS病理診斷的必要條件。腫瘤細胞形態(tài)學呈大容量蒼白的嗜酸性細胞質，細胞邊界明顯，核稍大呈圓形稍深染，且核膜不規(guī)則。高倍鏡下觀察到罕見的有絲分裂和基底細胞凋亡小體（圖1 A、B）。

3 GAS免疫組織化學表型及AB-PAS染色特征

在臨床外檢中GAS的診斷（尤其是活檢標本）存在著一定的困難，漏診及誤診率相對較高。因此GAS特征性的免疫表型對診斷有提示作用，同時也是鑒別診斷的關鍵（表3）。本研究中免疫組織化學染色結果顯示，5例患者p16（圖1C）、MUC2及CDX2均為陰性，CK7（圖1D）、MUC5AC（圖1E）、及CEA在5例患者中均呈陽性（5/5，100%）；其中4例患者MUC6（圖1F）呈現局灶陽性（4/5，80%）。5例患者Ki-67增殖指數在50%~80%不等，p53均為野生型（5/5，100%）。其余鑒別診斷指標ER（1/5，20%）、PR（1/5，20%）多為陰性，PAX8（3/5，60%）表達不穩(wěn)定（表3）。AB-PAS染色顯示，GAS黏液成分主要為中性黏液，細胞質AB-PAS染色呈紅色，而正常宮頸和其他宮頸腺癌的中性黏液和酸性黏液含量對等，呈紫色（圖2）。

圖2 GAS 組織AB-PAS組織化學表型。A，正常宮頸腺體； B，正常宮頸腺體（箭）及GAS腺體（箭頭）； C，GAS腺體；D，GAS腺體；比例尺，100 μmFig.2 AB-PAS histochemical phenotypes of the GAS tissues.A, normal cervical glands; B, normal cervical glands (arrow) and GAS glands (arrow head); C, GAS glands; D, GAS glands; scale bar, 100 μm

表3 5例GAS患者免疫組織化學與組織化學表型比較Tab.3 Comparison of immunohistochemical and histochemical phenotypes of five patients with GAS

圖1 GAS組織HE染色與免疫組織化學表型。A，GAS HE染色；B，A圖黑色方框所示區(qū)域放大圖；C，p16 ；D， CK7；E，MUC5AC；F，MUC6；箭，凋亡小體；比例尺，100 μmFig.1 HE staining and immunohistochemical phenotypes of GAS tissues.A, HE staining of GAS; B, an enlarged view of the area shown by the black box in A; C, p16; D, CK7; E, MUC5AC; F, MUC6; arrow, apoptosis body; scale bar, 100 μm

討 論

宮頸癌是危害女性健康的一種惡性腫瘤，因其逐年上升的發(fā)病率而受到人們的重視。宮頸癌的組織學類型主要分為鱗狀細胞癌和腺癌兩大類，其中鱗狀細胞癌最為多見。在WHO指南中，宮頸腺癌基于形態(tài)學和組織學類型被分類為10余種，這常讓臨床病理診斷及臨床醫(yī)生都感到困惑。第5版《WHO女性生殖腫瘤分類》在簡單的形態(tài)學標準基礎上將宮頸腺癌根據病因學因素分類后（HPV感染相關型和非HPV感染相關型），使對宮頸腺癌的認識更加深入。宮頸腺癌約占宮頸癌總發(fā)生率的20%~25%，其中80%~90%與HPV感染有關。與非HPV感染相關宮頸腺癌相比，HPV感染相關宮頸腺癌患者更為年輕化且預后較好。而非HPV感染相關宮頸腺癌患者通常年齡較大，臨床分期較高且預后較差。因此，在宮頸活檢標本檢測中有效的病理診斷起到關鍵性作用。

GAS是非HPV感染相關宮頸腺癌中較為常見的類型，約占宮頸腺癌的1%~3%。GAS 患者的診斷主要依據宮頸細胞學檢查、宮頸搔刮以及錐切，但目前針對早期 GAS的診斷仍較困難，誤診率高達34%[7]。這主要是由于GAS臨床缺乏特異性，且病檢可見大量分化較好的黏液腺體，病理學特征與良性病變相似。有文獻報道，在活檢標本中GAS常常容易被診斷為普通型宮頸腺癌或漿液性癌，主要原因是對GAS的組織學特征認識不足和/或缺乏p16指標的常規(guī)使用，或對漿液性癌p53染色的錯誤判讀[8]。在形態(tài)學上GAS腫瘤細胞診斷的關鍵特征與宮頸微偏腺癌十分相似[9]，GAS腫瘤細胞核一般較均勻且為圓形，而宮頸微偏腺癌腫瘤細胞核常常位于基底且異型性相對較大[10]。GAS具備高度侵襲性，常常在出現廣泛癌轉移后才被確診，造成治療延誤且影響預后。因此，具有較強特異性的免疫組織化學標志物對于明確診斷GAS具備潛在價值。

黏蛋白（mucins, MUC）是一種大分子量的高度糖基化蛋白質。其中， MUC2、MUC5AC及 MUC6同屬分泌型黏蛋白，三者均參與腫瘤的侵襲及轉移，它們的過表達與多種惡性腫瘤的發(fā)生有關。本研究免疫組織化學結果顯示MUC2在GAS患者癌細胞中均為陰性表達，MUC6在GAS的細胞質中多呈現局灶陽性表達，這與Honjo等的研究一致[11]。但另有其他研究發(fā)現MUC6在正常宮頸腺體和良性病變中也存在一定程度的陽性表達[12]。因此單獨用MUC6來鑒別GAS的作用有限。MUC5AC是重要的胃型分泌型黏蛋白之一，由胃腸道、呼吸道、乳腺等上皮細胞分泌，可參與腫瘤侵襲轉移等。本研究免疫組織化學結果顯示MUC5AC在5例GAS中均呈現陽性表達。MUC5AC作為胃癌診斷指標已被廣泛應用，而在胃型宮頸腺癌中的作用未見相關報道。

本研究通過免疫組織化學檢測發(fā)現MUC5AC、MUC6、p16和p53這些免疫指標的聯合應用可能對GAS的診斷起到重要的提示作用。p16是HPV相關惡性病變的重要替代標記物，是宮頸活檢中宮頸腺癌診斷的常用輔助診斷指標。在免疫組織化學結果判讀中，p16呈現出斑駁表達而通常被判讀為陰性。本研究中與非HPV感染無關的5例GAS均表現出p16陰性表達，而有學者研究證明高危HPV感染與p16連續(xù)及中強度核陽性相關[13]。以往的研究顯示GAS病例p53免疫染色常常表現為突變型表達模式，突變率40%~52%不等[2,14]，顯著高于普通宮頸腺癌38%的突變率，提示p53在GAS的發(fā)病機制中可能起作用，也可以用于與普通宮頸腺癌的鑒別診斷中。同時檢測p16和p53有助于區(qū)分GAS和其它宮頸腺癌亞型。

AB-PAS是一種特殊的組織化學染色方法，可用來鑒別黏液成分。GAS中的黏液成分以中性為主，AB-PAS染色后細胞漿呈紅色。正常宮頸及其他普通宮頸腺癌酸性和中性黏液基本對等存在，腺上皮細胞漿AB-PAS染色呈紫色。由此可見，AB-PAS可用來鑒別GAS和正常宮頸及其他普通宮頸腺癌[15,16]。

宮頸腺體的胃型上皮分化屬于良性病變，可出現胃型分化的腺體，或存在輕微細胞核異型，染色質淡染。有學者認為該良性病變和非典型葉狀宮頸腺體增生同屬于胃型癌前病變的范疇。免疫組織化學檢測顯示胃型上皮分化的宮頸腺體CK7和MUC6多為陽性表達，ER和PR常為陰性表達[17]。子宮頸小葉狀腺體增生較為少見，腺體呈現大小不一的圓形或囊狀，可見葉狀增生。細胞質有時嗜酸且呈顆粒狀，提示胃型分化[18]。免疫組織化學檢測顯示子宮頸小葉狀腺體增生HIK1083和MUC6陽性表達，ER、PR和CEA多呈陰性[17,19]。

宮頸隧道樣腺叢為常見的腺體良性增生，分為A型和B型[20]。A型隧道樣腺叢界限清晰，腺體增生呈橢圓形或多角形，常伴胃型化生，不形成小葉[19]。 B型隧道樣腺叢由增大的呈葉狀結構排列的腺體組成，腺體囊狀擴張，未伴有胃型分化[21]。免疫組織化學檢測顯示隧道樣腺叢CEA呈陰性，而在微偏腺癌中僅局灶陽性，因此不能有效的用于區(qū)分鑒別[21,22]。宮頸微偏腺癌為較少見腺癌類型，鏡下可見形態(tài)各異的彌漫性增生腺體，部分腺體拉長呈不規(guī)則分支狀。微偏腺癌常見局灶性細胞異性和促結締組織增生性反應。部分可見神經叢、血管或淋巴管侵犯，這些病理特點有助于診斷。免疫組織化學顯示CEA通常呈現局灶陽性[23]，p53多呈彌漫陽性，PAX2存在細胞核陰性表達[24]。HIK1083和/或MUC6在微偏腺癌中與胃型粘液腺癌表型一致，呈現陽性表達[19]。與非高危型HPV相關性腫瘤一樣，微偏腺癌p16呈陰性或局灶陽性[25]。

GAS缺乏顯著的臨床特征，且組織學上僅出現輕微細胞及腺體分化異常，與宮頸良性病變相似。另外GAS單次活檢的檢出率低，此外多點活檢和宮頸錐切也只有約1/2的檢出率，導致GAS易被漏診、誤診，從而延誤治療而影響患者預后，因此輔助進行免疫組織化學多指標聯合檢測必不可少。本研究發(fā)現免疫組織化學指標MUC5AC、MUC6、p16和P53的聯合應用對GAS的診斷具有顯著價值。此外，AB-PAS染色也可有效用于區(qū)分GAS與其它宮頸腺癌亞型。