柴胡皂苷A抑制鏈脲佐菌素聯(lián)合高脂高糖飲食誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎氧化應(yīng)激和自噬損傷

陳晨，李芳*

（1福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床營(yíng)養(yǎng)科，福州 350005；2湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院襄陽(yáng)市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科，襄陽(yáng) 441000）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy, DN）是一種常見(jiàn)的糖尿病微血管并發(fā)癥，是導(dǎo)致終末期腎病的主要病因之一[1-2]。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，預(yù)計(jì)到2040年全球?qū)⒂?億糖尿病患者[3]，其中約1/3將發(fā)展成DN[4]。足細(xì)胞即腎小囊臟層上皮細(xì)胞，其能與腎小球基底膜和血管內(nèi)皮細(xì)胞一起構(gòu)成腎小球?yàn)V過(guò)屏障。已有研究[5-6]表明，DN與糖尿病早期腎小球足細(xì)胞損傷密切相關(guān)，足突形態(tài)、數(shù)量、密度、相關(guān)蛋白表達(dá)等方面的變化是導(dǎo)致DN的發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素之一。柴胡皂苷A（saikosaponin A，SSA）是柴胡的主要活性成分，其具有包括抗氧化、抗炎和免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性[7]。最新研究[8-9]顯示，SSA能改善動(dòng)物模型的包括腎損傷在內(nèi)多種器官損傷。關(guān)于SSA在糖尿病大鼠中對(duì)腎臟的作用尚不明確。因此，本研究采用高脂高糖飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素（streptozotocin, STZ）誘導(dǎo)法構(gòu)建糖尿病大鼠模型，然后用SSA干預(yù)，旨在探討SSA在糖尿病大鼠中對(duì)腎臟的保護(hù)作用及機(jī)制。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

SSA（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，純度＞98%，貨號(hào)JOT-10071），用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9 %生理鹽水配置使用；STZ（美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)S0130）；丙二醛（malondialdehyde, MDA）比色檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)BC0020）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Cayman Chemicals公司，貨號(hào)10006270)；一氧化氮（nitric oxide, NO）和還原型谷胱甘肽（reduced glutathione, GSH）檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Cell Biolabs公司，貨號(hào)STA-800，STA-312-E）；Araldite包埋樹(shù)脂（美國(guó)Tedpella公司，貨號(hào)18060）；微管相關(guān)蛋白1-輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain3, LC3）、p62和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）的小鼠源單克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司，貨號(hào)sc-376404，sc-48402，sc-47724）；蛋白含量分析試劑盒和ECL發(fā)光底物（武漢博士德生物工程有限公司，貨號(hào)AR1172，BA1051）；威廉姆斯瘤蛋白1（Wilms tumor protein 1, WT1）兔源單克隆抗體和Alexa Fluor? 647標(biāo)記羊抗兔IgG（美國(guó)CST公司，貨號(hào)83535，4418）；HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG和FITC標(biāo)記羊抗小鼠IgG（萬(wàn)類生物科技有限公司，貨號(hào)WLA024，WLA031）。TBA-200FR NEO尿液化學(xué)分析儀（日本Toshiba公司）；電泳設(shè)備和酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；超薄切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；CellInsight CX7激光掃描共聚焦顯微鏡（美國(guó)Thermo Scientific公司）；光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司)；Oxymax/CLAMS代謝籠（美國(guó)Columbus公司）；H-7700透射電子顯微鏡（日本Hitachi公司）。

2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

18只雄性SD大鼠（清潔級(jí)，6～7周齡，體重190～220 g）購(gòu)自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK（浙）2021-0006]，置于福建醫(yī)科大學(xué)[SYXK（閩）2018-0001]屏障動(dòng)物飼養(yǎng)房飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件：室溫維持（23±2）℃，濕度維持55%~65%，明/暗周期維持12 h/12 h循環(huán)，食物充足。所有實(shí)驗(yàn)方案均得到本院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并按照其對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的研究方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3 實(shí)驗(yàn)方案

將18只SD大鼠隨機(jī)分為3組（每組6只）：對(duì)照組（Ctrl）、模型組（Model）和柴胡皂苷A組（SSA）。Ctrl組大鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程中采用標(biāo)準(zhǔn)嚙齒動(dòng)物飼料飼養(yǎng)；Model組和SSA組大鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程中均給予高脂高糖食物（54.6%標(biāo)準(zhǔn)嚙齒動(dòng)物飼料，16.9%豬油，14%蔗糖，10.2%酪蛋白，2.1%預(yù)混料為，2.2%麥芽糊精）飼養(yǎng)。在上述條件下飼養(yǎng)4周后，Model組和SSA組大鼠通過(guò)腹內(nèi)注射STZ（35 mg/kg體質(zhì)量），連續(xù)3 d，將血糖＞16.5 mmol/L 的大鼠視為糖尿病大鼠[10]，Ctrl組大鼠腹內(nèi)注射等量檸檬酸緩沖液。接著，SSA組大鼠每天灌胃給予30 mg/kg體質(zhì)量的SSA，持續(xù)8周；Ctrl和Model組灌胃等體積生理鹽水。12周時(shí)，將大鼠置于代謝籠收集24 h尿液。所有大鼠均稱體質(zhì)量，麻醉后處死，取腎和血樣，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

4 尿液分析

所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物移入代謝籠，收集24 h總尿。用TBA-200FR NEO尿液化學(xué)分析儀測(cè)量尿液樣本中微白蛋白（microalbumin, MAU）和肌酐（creatinine,Cr）水平。

5 組織病理學(xué)分析

將半腎立即在液氮中冷凍，為后續(xù)蛋白質(zhì)提取和酶化驗(yàn)做準(zhǔn)備。其余腎切成2 mm厚的橫切面，入4%多聚甲醛固定24 h。組織用石蠟包埋后，將腎橫切面橫向切為5 μm厚連續(xù)石蠟切片，按照常規(guī)程序，用HE和Masson染色，然后用光學(xué)顯微鏡觀察腎組織學(xué)形態(tài)并拍照；或用OCT包埋，切成5 μm厚連續(xù)冰凍切片，用于免疫熒光染色定位分析。

6 腎組織中MDA、NO、GSH及SOD檢測(cè)分析

取100 mg腎組織在20 mmol/L HEPES冰冷緩沖液（pH 7.2）中勻漿，1500 r/min離心5 min，用蛋白分析試劑盒測(cè)定上清蛋白濃度后，按照對(duì)應(yīng)的試劑盒方法檢測(cè)腎組織中MDA、NO和GSH水平以及SOD活性。

7 透射電子顯微鏡術(shù)

取小塊腎組織，用2.5%戊二醛固定2 h，然后用PBS清洗，1%四氧化鋨后固定2 h。丙酮梯度脫水后，將組織植入Araldite 502包埋樹(shù)脂中在60℃下固化24 h。超薄切片機(jī)切片（50 nm），切片經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛染色后透射電子顯微鏡觀察、拍照。

8 免疫熒光染色

取冰凍切片置于通風(fēng)櫥風(fēng)干，用冰丙酮固定10 min，風(fēng)干，PBS沖洗2次，然后用含5%牛血清白蛋白的0.01 mol/L PBS（pH 7.2）孵育30 min，室溫孵育WT1、LC3和p62（均1∶500稀釋）2 h；PBS洗滌后，室溫分別孵育Alexa Fluor? 647標(biāo)記的羊抗兔IgG以及FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG（均1∶1000稀釋）1 h。PBS洗滌后，5 μg/mL DAPI染核3 min，激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察。

9 蛋白質(zhì)免疫印跡

用RIPA勻漿法提取蛋白，測(cè)定蛋白定濃度后，每個(gè)樣品（40 μg）蛋白在上樣緩沖液中變性，用10%丙烯酰胺/雙丙烯酰胺凝膠電泳分離。將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST（10 mmol/L Tris，100 mmol/L NaCl，0.1% Tween 20）封閉膜上的殘余結(jié)合位點(diǎn)后，用抗LC3（1∶5000）、抗 p62（1∶5000）和抗 GAPDH（1∶5000）4 °C 孵育過(guò)夜。次日，溫育后，用TBST洗滌膜，并在室溫下用HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG孵育1 h。再次洗滌膜后，用ECL發(fā)光底物使得目的條帶顯現(xiàn)。以GAPDH用作內(nèi)部對(duì)照，用Image J軟件量化條帶光密度值。

10 統(tǒng)計(jì)分析

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s表示，采用GraphPad Prism 6軟件將實(shí)驗(yàn)中所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多組之間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為界定差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 柴胡皂苷A降低糖尿病大鼠尿液中MAU和Cr水平

與對(duì)照組比較，模型組大鼠尿液中MAU和Cr水平增高；經(jīng)柴胡皂苷A干預(yù)后，糖尿病大鼠尿液中MAU和Cr水平均降低（圖1）。

圖1 柴胡皂苷A對(duì)糖尿病大鼠MAU和Cr排泄的影響。A，尿液中MAU水平；B，尿液中Cr水平；與對(duì)照組比較：#P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.01；n=6Fig.1 Effects of saikosaponin A on secretion of MAU and Cr in diabetic rats.A, MAU levels in the urine; B, Cr level in the urine; #P＜0.01,compared with Ctrl group; *P＜0.01, compared with model group; n=6

2 柴胡皂苷A減輕糖尿病大鼠腎組織病理?yè)p害

HE染色顯示，對(duì)照組大鼠的腎小球結(jié)構(gòu)完成，基底膜完整，腎小管排列整齊且大小均勻；模型組大鼠腎小球硬化、萎縮，腎小管擴(kuò)張，間隙增大，間質(zhì)有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；柴胡皂苷A組大鼠腎小球未見(jiàn)明顯萎縮，腎小管擴(kuò)張明顯減輕。Masson染色顯示，模型組腎小球、腎小管、腎間質(zhì)出現(xiàn)藍(lán)色區(qū)域，提示腎纖維化；而經(jīng)柴胡皂苷A治療后，腎臟藍(lán)色區(qū)域明顯減少，腎小球及腎間質(zhì)僅部分染色區(qū)域。透射電子顯微鏡顯示，模型組腎小球中足細(xì)胞損傷，表現(xiàn)為基底膜增厚，足突融合或增寬；而經(jīng)柴胡皂苷A治療后，足細(xì)胞損傷減輕（圖2）。

圖2 柴胡皂苷A對(duì)糖尿病大鼠腎組織形態(tài)學(xué)影響的HE、Masson染色和透射電鏡檢測(cè)。HE染色切片比例尺 200 μm，透射電鏡照片比例尺1μmFig.2 Examination by HE and Masson staining and transmission electron microscopy for the effect of saikosaponin A on renal histomorphology of the diabetic rats.Scale bar 200 μm in HE staining slices, scale bar 1μm in TEM

3 柴胡皂苷A抑制糖尿病大鼠腎內(nèi)氧化應(yīng)激

對(duì)各組大鼠腎組織氧化應(yīng)激標(biāo)志物MDA、NO和 GSH水平及SOD活性檢測(cè)顯示：與對(duì)照組比較，模型組大鼠腎組織中MDA和NO水平均升高，而GSH水平和SOD活性均降低；經(jīng)柴胡皂苷A干預(yù)后，糖尿病大鼠腎組織中MDA和NO水平的升高、GSH水平和SOD活性的降低被顯著抑制（圖3）。

圖3 柴胡皂苷A對(duì)糖尿病大鼠腎組織中氧化應(yīng)激標(biāo)志物含量的影響。A，MDA水平；B，NO水平；C，GSH水平；D，SOD活性；與對(duì)照組比較：#P＜0.01；與模型組相比：*P＜0.05, **P＜0.01。Fig.3 Effect of saikosaponin A on oxidative stress markers in renal tissues of the diabetic rats.A, MDA level; B, NO level; C, GSH level; D, SOD activity.#P＜0.01, compared with Ctrl group; *P＜0.05, **P＜0.01, compared with model group; n=6

4 柴胡皂苷A抑制糖尿病大鼠腎組織自噬損傷

透射電鏡觀察表明：對(duì)照組腎小球足細(xì)胞分布均勻，結(jié)構(gòu)清晰，可見(jiàn)自噬泡；模型組大鼠腎小球足細(xì)胞的足突增厚，結(jié)構(gòu)模糊，足細(xì)胞的足突變形并呈現(xiàn)不同程度的融合，偶見(jiàn)自噬泡；柴胡皂苷A組足細(xì)胞足突部分融合，可觀察到自噬液泡（圖4A）。免疫熒光檢測(cè)顯示：對(duì)照組腎小球的LC3 II免疫陽(yáng)性足細(xì)胞（LC3 II與足細(xì)胞標(biāo)記物WT1共染）較多，而p62免疫陽(yáng)性足細(xì)胞較少；模型組腎小球的LC3 II免疫陽(yáng)性足細(xì)胞減少，而p62免疫陽(yáng)性足細(xì)胞增多，說(shuō)明自噬的足細(xì)胞減少；柴胡皂苷A組腎小球中自噬的足細(xì)胞較模型組增多（圖4B）。Western blot檢測(cè)顯示：相對(duì)于對(duì)照組，模型組腎組織中p62水平顯著升高，而LC3 II/LC3 I比值顯著降低；而經(jīng)柴胡皂苷A治療后，糖尿病大鼠腎組織中p62水平降低，而LC3 II/LC3 I比值升高（圖4C）。

討 論

尿MAU和Cr排泄量是衡量糖尿病腎毒性的重要指標(biāo)[11]。DN早期臨床表現(xiàn)為微白蛋白尿（尿白蛋白排泄率為20~200 mg/min），隨后隨著病情進(jìn)展出現(xiàn)大量白蛋白尿和腎功能衰竭[12]。本研究結(jié)果顯示，柴胡皂苷A能降低糖尿病大鼠尿液中MAU和Cr排泄，并改善腎臟病理改變。這些結(jié)果提示，柴胡皂苷A能減輕糖尿病大鼠腎損傷。

已有研究[13]表明，氧化應(yīng)激是高血糖腎病的常見(jiàn)現(xiàn)象。高血糖促進(jìn)ROS的生成，產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，并能進(jìn)一步導(dǎo)致與膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、尿素氮、Cr和MAU水平升高相關(guān)的腎損傷[14]。本研究發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷A可通過(guò)提高糖尿病大鼠腎組織中的GSH水平和SOD活性以及降低MDA和NO水平來(lái)增強(qiáng)其抗氧化能力。

足細(xì)胞是腎臟固有的細(xì)胞。足細(xì)胞作為腎小球最脆弱的細(xì)胞成分，通過(guò)以肌動(dòng)蛋白為主的細(xì)胞骨架系統(tǒng)和足細(xì)胞特異性表達(dá)的蛋白分子在腎小球的結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮重要作用[15]。足細(xì)胞損傷是腎病性蛋白尿和腎小球硬化的主要原因[5-6]。近期研究[16-17]表明，自噬是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、成熟、分化和死亡的重要機(jī)制，其在足細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用。在糖尿病和蛋白尿動(dòng)物模型的腎組織中發(fā)現(xiàn)明顯的腎功能障礙，且伴隨著腎小球足細(xì)胞自噬受阻和足細(xì)胞損傷[18-20]?；謴?fù)自噬能減輕上述模型的足細(xì)胞損傷和改善腎功能[19-21]。因此，自噬活性受損促進(jìn)DN的發(fā)病與進(jìn)展，而恢復(fù)自噬活性可能是防治與糖尿病相關(guān)腎損傷的潛在方案。本研究觀察到柴胡皂苷A干預(yù)后的糖尿病大鼠腎小球發(fā)生自噬的足細(xì)胞增多、LC3 II/LC3 I比值升高，p62蛋白水平降低，提示柴胡皂苷A能恢復(fù)糖尿病大鼠腎小球中足細(xì)胞的保護(hù)性自噬。

總之，本研究提示，在糖尿病腎病時(shí)，柴胡皂苷A能通過(guò)抑制氧化應(yīng)激和自噬損害而減輕腎損傷，發(fā)揮腎保護(hù)作用，由此表明柴胡皂苷A具有減緩DN發(fā)生和進(jìn)展的潛力。