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    熱敏蛋白TRPV1在小鼠睪丸生精小管中的表達(dá)特征

    2022-02-15 01:44:32趙妍秋劉博魏金花李臻
    關(guān)鍵詞:精母細(xì)胞生精組織化學(xué)

    趙妍秋,劉博,魏金花*,李臻*

    (1延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室,延安 716000;2空軍軍醫(yī)大學(xué)人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室,西安 710032;3中國(guó)人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)空軍醫(yī)院,大同 037000)

    正常的精子發(fā)生過(guò)程對(duì)于維持物種的繁衍穩(wěn)定至關(guān)重要,睪丸生精上皮是正常的精子發(fā)生過(guò)程的場(chǎng)所。精子的發(fā)生過(guò)程包括精原細(xì)胞的增殖分化、精母細(xì)胞的減數(shù)分裂以及精子細(xì)胞的成熟。這些過(guò)程受到激素、旁分泌因子、基因和表觀遺傳調(diào)控因子等內(nèi)在因素的參與調(diào)控[1],同時(shí)外界環(huán)境因素,例如輻射,重金屬和有害的化學(xué)物質(zhì),以及不良生活習(xí)慣也會(huì)影響精子發(fā)生過(guò)程[2]。其中,環(huán)境溫度的變化對(duì)于精子的發(fā)生過(guò)程具有重要影響[3]。睪丸的溫度通常保持低于身體核心溫度2~6 ℃,當(dāng)睪丸溫度升高或機(jī)體體溫調(diào)節(jié)障礙時(shí),導(dǎo)致精子生成減少[4],誘導(dǎo)生殖細(xì)胞凋亡和DNA損傷,影響精子質(zhì)量,造成雄性不育或者生育力降低[5]。

    瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1(transient receptor potential vanilloid receptor-1, TRPV1)是一種廣泛存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)的熱敏通道,可以被高溫(>43 °C)、細(xì)胞外酸性環(huán)境和辣椒素等配體激活[6],并且這些因素可以協(xié)同促進(jìn)TRPV1活性[7]。TRPV1屬于非選擇性陽(yáng)離子通道,對(duì)Na+和Ca2+有較高通透性,在口腔和皮膚等器官中參與炎癥和疼痛等過(guò)程[8]。除此之外,TRPV1在非感覺(jué)神經(jīng)元中有具有重要作用,廣泛參與細(xì)胞增殖、凋亡和體內(nèi)多種生理病理過(guò)程[9]。另有研究發(fā)現(xiàn)TRPV1在人和大鼠的前列腺、睪丸、陰莖和膀胱組織中有表達(dá)[10],但其在小鼠睪丸中的具體細(xì)胞定位尚無(wú)系統(tǒng)研究。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)、蛋白免疫印跡、免疫組織化學(xué)染色和免疫熒光雙重染色技術(shù),檢測(cè)TRPV1在小鼠睪丸發(fā)育階段和生精周期的表達(dá),以及其在小鼠睪丸各生精上皮中的定位情況,為今后深入研究其在睪丸熱應(yīng)激中的功能與作用提供基礎(chǔ)。

    材料與方法

    1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    出生后 7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、56 d SPF級(jí)C57小鼠各3只,體重(20±10)g成年小鼠20只,均購(gòu)自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

    2 主要試劑

    RNA提取液Trizol plus、反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeS-cript? RT reagent Kit和熒光定量試劑盒SYBR Primix Ex Taq II均購(gòu)自日本Takara公司;定量PCR所用引物由武漢奧科生物技術(shù)有限公司合成;免疫組織化學(xué)染色試劑盒VECTASTAIN ABC Kit購(gòu)自美國(guó)Vector Laboratories公司;兔抗TRPV1(ab31895)和鼠抗SYCP3(ab97672)購(gòu)自Abcam公司;鼠抗SOX9(14-9765-95)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;鼠抗PLZF(sc-28319)購(gòu)自Santa Cruz公司;鼠抗β-actin(T0022)購(gòu)自Affinity公司;山羊抗小鼠IgG(ZB-2305)購(gòu)自中杉金橋;山羊抗兔IgG(SGA10002)購(gòu)自AntiProtech公司;FITC標(biāo)記的羊抗鼠和TRITC標(biāo)記的羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Jackson ImmunoResearch 公司。

    3 動(dòng)物取材

    小鼠脫頸處死,取一側(cè)睪丸用于提取RNA和蛋白,另一側(cè)睪丸固定于4%多聚甲醛(多聚甲醛4 g,PBS溶液100 mL,加熱攪拌溶解后用10 mmol/L NaOH溶液調(diào)pH為7.4),用于免疫組織化學(xué)和免疫熒光染色。

    4 總RNA提取

    采用TRIzol法提取總RNA。收集的睪丸組織加入1 mL TRIzol溶液,充分吹打,冰上裂解5 min。加入0.2 mL氯仿,顛倒混勻,12000 r/min、4 ℃離心15 min;轉(zhuǎn)移上清到新Eppendorf管中,加入等體積的異丙醇,顛倒混勻;-20 ℃冰箱放置30 min,13500 r/min、4 ℃離心10 min;棄上清,加入1 mL 75%乙醇,顛倒混勻,13500 r/min、4 ℃離心10 min;棄上清,離心管開(kāi)蓋室溫放置直至液體完全揮發(fā);加入適量DEPC水,溶解RNA沉淀。Nano-Drop-2000分光光度計(jì)測(cè)定RNA純度和濃度,取吸光度A260/A280=1.8~2.0的樣品進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

    5 逆轉(zhuǎn)錄PCR

    瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè):用PrimeScript? RT reagent Kit試劑盒進(jìn)行RT-PCR。10 μL基因組DNA去除反應(yīng)體系如下:2 μl 5×gDNA Eraser Buffer,1 μL gDNA Eraser,2 μg RNA,RNase Free dH2O 定容;反應(yīng)條件42 °C,2 min。20 μL反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系如下:4 μL 5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time),1 μL PrimeScript RT Enzyme Mix I,1 μL RT Primer Mix,10 μL上一步反應(yīng)液,4 μL RNase Free dH2O;反應(yīng)條件:37 °C 15 min,85 °C 5 s。以 cDNA 為模板進(jìn)行目的基因的PCR擴(kuò)增,20 μL反應(yīng)體系,反應(yīng)條件為95 ℃5 min,94 ℃30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s,72 ℃ 延伸 10 min,第二步至第4步35個(gè)循環(huán);TRPV1上游引物為:5’-TCTGCTGGAATCCTCGGGTGTAG-3’,下游引物為:5’-CATGCTGGTGTCTGTGGTACTGTAC-3’,預(yù)計(jì)產(chǎn)物大小為118 bp;β-actin為內(nèi)參基因,其上游引物為 5’-GGTGGGAATGGGTCAGAAGG-3’,下游引物為 5’-GTACATGGCTGGGGTGTTGA-3’,預(yù)計(jì)產(chǎn)物大小268 bp。使用含有DNA-red核酸染料(IC-6009,CellProTM)的 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

    實(shí)時(shí)熒光定量PCR(q-PCR)檢測(cè):使用SYBR Premix Ex Taq II試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。以cDNA為模板進(jìn)行目的基因的PCR擴(kuò)增,20 μL反應(yīng)體系如下:10 μL SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (2×),0.8 μL PCR Forward Primer (10 μmol/L),0.8 μL PCR Reverse Primer (10 μmol/L),2 μL cDNA,6.4 μL RNase Free dH2O。反應(yīng)條件為 95 ℃ 3 min(1 cycle);95 ℃5 s,60 ℃ 30s(40 cycle)。通過(guò)分析擴(kuò)增曲線和融解曲線確定PCR擴(kuò)增的成功性,根據(jù)得到的CT值,運(yùn)用2-△△CT公式計(jì)算TRPV1 mRNA在各組中的相對(duì)表達(dá)量。

    6 蛋白免疫印跡

    用含苯甲基磺酰氟(終濃度1 mmol/L)的RIPA裂解液將收集的睪丸組織中充分裂解,離心得到蛋白樣品;SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì),再電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜。5%脫脂牛奶封閉1.5 h, TRPV1一抗4 °C孵育過(guò)夜,次日山羊抗兔IgG室溫孵育2 h,膜上滴加發(fā)光液(IC-8001, InCellGenE LLC, 美國(guó))后,Clinx化學(xué)發(fā)光儀(ChemiScope 6000,上海勤翔科學(xué)儀器有限公司)對(duì)膜進(jìn)行掃描成像。

    7 免疫組織化學(xué)染色

    取睪丸用4%的多聚甲醛固定過(guò)夜,梯度乙醇脫水、二甲苯透明后石蠟包埋,石蠟切片機(jī)切片。將石蠟切片在二甲苯與梯度降乙醇復(fù)水后,在10 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH 6.0)中微波修復(fù)抗原15 min,冷卻至室溫。PBS清洗后,入0.03%甲醇-0.3%過(guò)氧化氫中室溫孵育30 min;PBS清洗5 min×5次后滴加與二抗來(lái)源相同的正常血清室溫封閉30 min;抗TRPV1一抗4° C過(guò)夜孵育,次日切片取出復(fù)溫1 h,PBS清洗5 min×5次;滴加生物素標(biāo)記的二抗室溫孵育3 h,PBS清洗5 min×5次;ABC復(fù)合物孵育切片1 h,PBS清洗5 min×5次,DAB顯色;自來(lái)水沖洗切片,蘇木精復(fù)染1 min。切片脫水、透明、樹(shù)膠封片,用VS200玻片掃描儀(Olympus)成像、觀察結(jié)果。

    8 免疫熒光雙重染色

    將石蠟切片在二甲苯與梯度乙醇中復(fù)水,在10 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH 6.0)中微波修復(fù)抗原15 min,冷卻至室溫。PBS清洗5 min×2次,正常血清封閉30 min,TRPV1一抗與SOX9、PLZF和SYCP3分別混合后,滴加到組織切片上,4 °C過(guò)夜孵育。次日切片取出復(fù)溫1 h,PBS清洗5 min×5次,TRITC標(biāo)記的羊抗兔IgG和FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG混合二抗室溫避光孵育3 h,PBS清洗5 min×5次。用4,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色,用FV1000共聚焦顯微鏡(Olympu)觀察結(jié)果。

    9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    qPCR和Western blot結(jié)果使用Image J軟件進(jìn)行光密度值測(cè)量,使用GraphPad PRISM9進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,所有數(shù)據(jù)表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤,所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

    結(jié) 果

    1 TRPV1在生后發(fā)育小鼠睪丸的表達(dá)變化

    按照小鼠睪丸發(fā)育周期,提取7 d、14 d、21 d、28 d、35 d和56 d的小鼠睪丸RNA和蛋白,應(yīng)用RTPCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)TRPV1 mRNA和蛋白在小鼠睪丸不同發(fā)育周期的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,TRPV1 mRNA在小鼠睪丸發(fā)育初期即表達(dá),在出生后21 d時(shí)顯著增高,在28 d到達(dá)頂峰,之后隨著小鼠發(fā)育至成年逐漸下降(圖1A、B)。TRPV1蛋白在小鼠睪丸發(fā)育階段表達(dá)水平變化模式與mRNA一致(圖1C、D)。

    圖1 TRPV1在7—56 d小鼠睪丸的表達(dá)水平檢測(cè)。A,TRPV1 mRNA代表性RT-PCR檢測(cè)結(jié)果;B,qPCR法檢測(cè)的TRPV1 mRNA水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;C,TRPV1蛋白水平的代表性免疫印跡檢測(cè)結(jié)果;D,免疫印跡檢測(cè)的TRPV1蛋白水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。與7 d組比較: *P<0.05,**P< 0.01,***P< 0.001; n=3Fig.1 Detection of TRPV1 expression in the mouse testes during 7 d-56 d developmental stage.A, presentative RT-PCR detection results of TRPV1 mRNA; B, statistical analysis of TRPV1 mRNA level detected by qPCR; C, representative Western blot detection of TRPV1 protein level; D, statistical analysis of TRPV1 protein level detected by Western blot.Compared with 7 d group: *P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001; n=3

    2 TRPV1在成年小鼠睪丸不同生精上皮周期的定位

    為明確TRPV1在小鼠睪丸不同生精周期中的定位,我們利用免疫組織化學(xué)染色法觀察了TRPV1在成年小鼠睪丸不同生精周期的表達(dá),使用IgG抗體處理組作為陰性對(duì)照。結(jié)果顯示TRPV1在生精上皮各個(gè)周期的生精細(xì)胞和支持細(xì)胞膜上都有表達(dá),其中I-III期表達(dá)相對(duì)較弱,從IV期開(kāi)始表達(dá)相對(duì)增強(qiáng),并且在各級(jí)生精細(xì)胞中,初級(jí)精母細(xì)胞的表達(dá)相對(duì)較強(qiáng)(圖2)。

    圖2 成年小鼠睪丸生精上皮周期中TRPV1表達(dá)的免疫組織化學(xué)檢測(cè)。黑箭,支持細(xì)胞; 白箭,精原細(xì)胞;黑箭頭,初級(jí)精母細(xì)胞;白箭頭,圓形精子細(xì)胞;曲尾箭,長(zhǎng)型精子細(xì)胞。比例尺,20 μmFig.2 Immunohistochemical detection of TRPV1 expression in the seminiferous epithelia of the adult mouse testes.Black arrow, Sertoli cells; white arrow, spermatogonia; black arrow head, primary spermatocytes; white arrow head, round spermatid; curved tail arrow, elongated spermatid.Scale bar,20 μm

    3 TRPV1在成年小鼠睪丸中的細(xì)胞定位

    為進(jìn)一步明確TRPV1在生精小管的細(xì)胞定位,我們首先使用睪丸支持細(xì)胞特異性的核標(biāo)志物SOX9與TRPV1進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)染色,結(jié)果顯示TRPV1與睪丸支持細(xì)胞存在共定位(圖3A)。應(yīng)用精原干細(xì)胞特異性的核標(biāo)志物PLZF與TRPV1進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)染色顯示,TRPV1同樣在PLZF陽(yáng)性細(xì)胞上有表達(dá)(圖3B)。以減數(shù)分裂開(kāi)始的標(biāo)志物SYCP3[11]作為精母細(xì)胞特異性的核標(biāo)志物與TRPV1進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)染色發(fā)現(xiàn),TPV1與SYCP3陽(yáng)性細(xì)胞也存在共表達(dá)(圖3C)。因此,TRPV1在睪丸支持細(xì)胞、精原細(xì)胞和精母細(xì)胞膜上均有表達(dá)。

    圖3 TRPV1在成年小鼠睪丸生精上皮支持細(xì)胞(A)、精原細(xì)胞(B)和精母細(xì)胞(C)定位的免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)Fig.3 Double immunofluorescence staining for detecting the localization of TRPV1 in the Sertoli cell (A), spermatogonia (B) and spermatocyte (C) of the spermatogenic epithelia of the adult mouse testes

    討 論

    精子發(fā)生是一個(gè)高度復(fù)雜的過(guò)程,包括精原干細(xì)胞的分化、精母細(xì)胞的減數(shù)分裂以及精子的變形等過(guò)程。小鼠的生精發(fā)育周期為8.6~8.9 d,從精原細(xì)胞發(fā)育至成熟精子細(xì)胞共需39~40 d[12],精子的形成發(fā)生過(guò)程產(chǎn)生任何異常都有可能導(dǎo)致生精失敗。TRPV1作為熱敏蛋白,可以感受滲透壓、pH和電壓等外界刺激,可能參與調(diào)節(jié)精子各項(xiàng)功能,其在男性生殖中的作用需要進(jìn)一步研究探索。我們的研究系統(tǒng)的從TRPV1在小鼠睪丸的表達(dá)定位入手,為進(jìn)一步研究TRPV1在男性生殖系統(tǒng)中的功能打下基礎(chǔ)。

    本研究首先通過(guò)RT-PCR和蛋白免疫印記檢測(cè)發(fā)現(xiàn),TRPV1在7 d的小鼠睪丸就開(kāi)始有表達(dá),21~28 d表達(dá)量顯著增加,之后隨著小鼠發(fā)育至成年逐漸下降。在小鼠發(fā)育到21~28 d這個(gè)階段,睪丸中精母細(xì)胞正在進(jìn)行減數(shù)分裂,生精上皮各類(lèi)細(xì)胞中初級(jí)精母細(xì)胞的數(shù)量最多。我們進(jìn)一步的免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn),TRPV1表達(dá)于睪丸生精上皮的各個(gè)時(shí)期,從IV期開(kāi)始表達(dá)相對(duì)增加,并且在初級(jí)精母細(xì)胞的表達(dá)相對(duì)較多,由此提示TRPV1可能在精母細(xì)胞的減數(shù)分裂中發(fā)揮重要作用。精母細(xì)胞對(duì)溫度較為敏感,在睪丸溫度達(dá)到37 °C時(shí),只有小部分精母細(xì)胞可以分化達(dá)到粗線期和雙線期;而當(dāng)睪丸溫度升高到38 °C,粗線期和雙線期精母細(xì)胞均無(wú)法存活,精母細(xì)胞無(wú)法完成染色體的聯(lián)會(huì)配對(duì),最終發(fā)生凋亡[13]。Trpv1-/-小鼠在高熱環(huán)境下生殖細(xì)胞凋亡較WT小鼠少,提示TRPV1在熱激活條件下對(duì)生殖細(xì)胞起到保護(hù)作用[14]。TRPV1的熱保護(hù)作用以及其在精母細(xì)胞中的高表達(dá)提示其可能與精母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中對(duì)溫度的較高敏感性相關(guān)。此外,我們通過(guò)對(duì)成年小鼠睪丸的免疫熒光染色,發(fā)現(xiàn)TRPV1在成年小鼠睪丸支持細(xì)胞膜上也有表達(dá)。支持細(xì)胞作為生精上皮中唯一的體細(xì)胞,對(duì)生精細(xì)胞起支持和營(yíng)養(yǎng)作用,并為精子的發(fā)生提供有利的微環(huán)境[15]。有研究表明TRPV1可以調(diào)節(jié)大鼠睪丸支持細(xì)胞中的酸感應(yīng)Cl-通道(acid sensing Cl-channel, ASCC)[16],這也支持TRPV1參與精子發(fā)生過(guò)程的調(diào)節(jié)。

    除了對(duì)生殖細(xì)胞的熱保護(hù)作用,同時(shí)也有研究報(bào)道TRPV1參與生殖細(xì)胞凋亡過(guò)程。Trpv1-/-小鼠平均壽命比WT小鼠長(zhǎng)約100 d,并且老年Trpv1-/-小鼠睪丸細(xì)胞凋亡較WT小鼠少[17];TRPV1的激動(dòng)劑辣椒素(capsaicin, CAP)可以通過(guò)激活TRPV1從而引起精原干細(xì)胞凋亡[18]。TRPV1作為陽(yáng)離子通道,可以通過(guò)調(diào)節(jié)[Ca2+]i信號(hào),誘導(dǎo)線粒體釋放凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducing factor, AIF)和細(xì)胞色素c,激活半胱天冬酶,從而調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[19]。因此在不同的激活因素下,TRPV1對(duì)生殖細(xì)胞的作用可能截然不同,甚至完全相反。相較于傳統(tǒng)的細(xì)胞凋亡途徑,TRPV1在不同的激活條件下是如何發(fā)揮細(xì)胞凋亡或保護(hù)作用,以及具體的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。

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