金櫻根質(zhì)量控制方法提升研究及等級(jí)評(píng)價(jià)體系的建立

白璐 郭靜 伍實(shí)花 趙毅 吳夢(mèng)瑤 陳燦 龔云 李春 張鵬

〔摘要〕 目的 提升金櫻根藥材的質(zhì)量控制方法，對(duì)其進(jìn)行安全性分析與等級(jí)評(píng)價(jià)。方法 對(duì)現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行總結(jié)，改進(jìn)薄層鑒別方法，建立特征圖譜，并對(duì)含量測(cè)定方法進(jìn)行研究;采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定其鉛、鎘、砷、汞、銅的殘留量;利用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)其進(jìn)行聚類(lèi)分析。結(jié)果 TLC鑒別方法各斑點(diǎn)清晰，分離度良好，可以區(qū)分真?zhèn)?，建立的特征圖譜有5個(gè)特征峰，指認(rèn)1個(gè)特征峰;不同產(chǎn)地金櫻根5種重金屬平均含量分別為鉛0.7 mg/kg、鎘0.1 mg/kg、砷0.1 mg/kg、銅5.0 mg/kg，汞低于0.01 mg/kg;30批樣品分為3類(lèi)：1批特級(jí)，9批優(yōu)質(zhì)，20批合格。結(jié)論 本方法結(jié)果準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、客觀、重復(fù)性好，可用于藥材的質(zhì)量控制;不同產(chǎn)地重金屬含量均在中國(guó)《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定范圍內(nèi)，處于安全水平;本研究所提出的3個(gè)等級(jí)規(guī)格藥材的不同等級(jí)特性區(qū)分明顯，實(shí)踐中容易掌握，對(duì)藥材的采收加工、銷(xiāo)售流通及臨床應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)和實(shí)踐意義。

〔關(guān)鍵詞〕 金櫻根;薄層色譜;特征圖譜;含量測(cè)定;安全性評(píng)價(jià);等級(jí)評(píng)價(jià)

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R284.1? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.02.007

Improvement of quality control method and establishment of grade evaluation

system for Rose cymosa

BAI Lu1， GUO Jing1， WU Shihua1， ZHAO Yi1， WU Mengyao1， CHEN Can1， GONG Yun1， LI Chun2， ZHANG Peng1*

（1. Zhuzhou Qianjin Pharmaceutical Co.， Ltd.， Zhuzhou， Hunan 412007， China; 2. Institute of Chinese

Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

〔Abstract〕 Objective To improve the quality control method of Rose cymosa， and to carry out safety evalution and grade evaluation. Methods The statutory standard of Rose cymosa were summarized. The thin-layer chromatography （TLC） identification method was improved， the characteristic map was established， and the content determination method was studied. The residues of lead， cadmium， arsenic， mercury and copper in Rose cymosa were determined by inductively coupled plasma mass spectrometry （ICP-MS）. Cluster analysis of Rose cymosa was carried out using SPSS statistical software. Results The spots on TLC plate were clear and well-separated， which can be used to identify the authenticity. The established characteristic spectrum identified 5 characteristic peaks and identified 1 components. The average content of lead， cadmium， arsenic and copper was 0.7， 0.1， 0.1， 5.0 mg/kg， respectively， and mercury was less than 0.01 mg/kg. The 30 batches of samples were divided into 3 categories， 1 batch of super grade， 9 batches of high quality and 20 batches of qualified. Conclusion The proposed methods are accurate， simple， and objective， and can be used for quality control of Rose cymosa. The content of heavy metals in Rose cymosa from different areas was all within the limit prescribed in China’s Green Thade Standards Importing & Exporting Medicinal plants & Preparation， which was at a safe level. This research proposes three ranks of medicinal materials specifications for different features to distinguish clearly， and easy to master in practice， which has certain guidance and practical significance for the collection， processing， sales， circulation and clinical application of medicinal materials.

〔Keywords〕 Rose cymosa; thin-layer chromatography; characteristic spectrum; content determination; safety evaluation; grade evaluation

金櫻根為我國(guó)西南瑤族、苗族、壯藥、土家族等多個(gè)少數(shù)民族的常用藥材[1-5]，應(yīng)用廣泛，具有清熱利濕、解毒消腫、活血止血、收斂固澀的功效。本品為薔薇科植物金櫻子Rosa laevigata Michaux、小果薔薇Rosa cymosa Tratt.和粉團(tuán)薔薇R. multiflora var. cathayenisis Rehder & E. H. Wilson的干燥根和莖[6]。金櫻根中主要含有三萜、黃酮、鞣質(zhì)類(lèi)成分，可治療遺精、遺尿、痢疾泄瀉、崩漏帶下、子宮脫垂、痔瘡、燙傷等，為婦科千金片、金雞膠囊及廣東涼茶等常用中藥[7-9]。

金櫻根的不同現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)來(lái)源基本一致，僅湖南省和廣西省標(biāo)準(zhǔn)收載了3個(gè)基原，藥用部位分別為根及莖與根及根莖。其余地方標(biāo)準(zhǔn)僅收載了薔薇科植物金櫻子的干燥根一個(gè)來(lái)源，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)在各現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中僅有顯微鑒別與以金櫻根對(duì)照藥材為對(duì)照的薄層色譜鑒別。本研究從定性、定量和安全性等方面全面提升了金櫻根的質(zhì)控方法，為金櫻根的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1? 主要儀器

ATS 4薄層色譜全自動(dòng)點(diǎn)樣儀（瑞士CAMAG公司）;ADC 2薄層色譜全自動(dòng)展開(kāi)儀（瑞士CAMAG公司）;Derivatizer薄層色譜全自動(dòng)噴霧系統(tǒng)（瑞士CAMAG公司）;Visualizer 2薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)（瑞士CAMAG公司）;TH-II薄層色譜顯色加熱器（上?？普苌萍加邢薰荆?Waters e2695高效液相色譜儀、Waters 2998 PDA檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司）;iCAP RQ ICP-MS電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司）;AB204-S電子天平、AB135-S電子天平（瑞士梅特勒公司）;KQ300DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;A11分析型研磨儀（德國(guó)IKA公司）。

1.2? 試藥

金櫻根對(duì)照藥材（批號(hào)：12115-201306）購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院;薔薇酸（Y-176-180516）購(gòu)于成都瑞芬思生物科技有限公司;乙醇（批號(hào)：P1433419）、甲醇（批號(hào)：P1441123）、二氯甲烷（批號(hào)：P1454839）均購(gòu)于General-Reagent公司;乙腈（批號(hào)：177798）購(gòu)于Fisher公司;磷酸（批號(hào)20171008）購(gòu)于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;其他所用試劑均為分析純。金櫻根藥材為株洲千金藥業(yè)股份有限公司提供，共計(jì)30份，其標(biāo)準(zhǔn)收載情況及實(shí)驗(yàn)樣品信息見(jiàn)表1和表2。

2 方法與結(jié)果

2.1? 薄層鑒別

2.1.1? 供試品溶液的制備? 取本品粉末（過(guò)二號(hào)篩）1 g，置具塞錐形瓶，加95%乙醇10 mL，密閉，超聲處理15 min，過(guò)濾，濾液作為供試品溶液。

2.1.2? 對(duì)照品溶液的制備? 取金櫻根對(duì)照藥材，同法制成對(duì)照藥材溶液。取薔薇酸對(duì)照品適量，加二氯甲烷-甲醇（1∶1）制成1 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.1.3? 薄層色譜? 依據(jù)薄層色譜法（中華人民共和國(guó)藥典2015年版四部通則0502）試驗(yàn)，分別吸取對(duì)照品溶液1 μL、供試品溶液3 μL、對(duì)照藥材溶液3 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷∶甲醇∶水（9∶1∶0.1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)劑蒸汽飽和20 min后展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇（m/V），在105 ℃加熱5 min，在365 nm下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材、對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。采用上述色譜法對(duì)24批不同產(chǎn)地（S1～S20）不同基原（S31～S33）和偽品（S35）藥材進(jìn)行薄層鑒別，結(jié)果樣品中斑點(diǎn)清晰，比移值（Rf）合適，不同基原樣品具有良好的一致性，可以達(dá)到區(qū)分偽品的目的。結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2? 特征圖譜與含量測(cè)定

2.2.1? 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性? 分別選用ACE Excel 3 C18-PFP色譜柱（4.6 mm×150 mm，3 μm）、Waters Xselect HSS PFP（4.6 mm×150 mm，3.5 μm），甲醇（A）-乙腈（B）-0.1%磷酸水溶液（C）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0～10 min，5% A，15%～23% B，80%～72% C;10～23 min，5%A， 23% B，72% C;23～55 min，5%A， 23%～35% B，72%～60% C;55～62 min，5%A， 35%～39% B，60%～56%C;62～65 min，5% A， 39%～43% B，56%～52% C;65～80 min，5% A， 43%～55% B，52%～40% C;80～90 min，5% A， 55%～70% B，40%～25% C）;體積流量為1.0 mL·min-1;柱溫為 30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm;進(jìn)樣量為10 μL。理論塔板數(shù)按薔薇酸計(jì)算應(yīng)不低于5000。供試品色譜中共呈現(xiàn)5個(gè)特征峰，與參照物峰相應(yīng)的峰為S峰，計(jì)算各特征峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間，其相對(duì)保留時(shí)間應(yīng)在規(guī)定值的±10%范圍以?xún)?nèi)。規(guī)定值為0.37（峰1）、0.43（峰2）、0.67（峰3）、1.00（峰4/S）、1.02（峰5）。檢測(cè)結(jié)果與圖譜見(jiàn)表3-4，圖2。

2.2.2? 參照物溶液的制備? 取薔薇酸對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每 mL含薔薇酸0.15 mg溶液，即得。

2.2.3? 供試品溶液的制備? 取金櫻根樣品（批號(hào)S32、S33、S34），粉碎，過(guò)三號(hào)篩，約1.0 g，精密稱(chēng)定，置125 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱(chēng)定重量，加熱回流1 h，放冷，用甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)對(duì)金櫻根缺少成分質(zhì)控，僅以薄層鑒別作為定性鑒別，有學(xué)者采用ACE Excel 3 C18-PFP色譜柱建立了基于同一色譜條件的金櫻根指紋圖譜和含量測(cè)定[15]，但專(zhuān)屬色譜柱耐用性窄，且實(shí)測(cè)過(guò)程中柱壓過(guò)高，此次采用其他廠家色譜柱進(jìn)行試驗(yàn)，擴(kuò)充了色譜柱耐用性，新增了特征圖譜檢測(cè)，結(jié)果顯示色譜柱耐用性良好，可提高檢測(cè)效率，節(jié)約質(zhì)量控制成本。

2.3? 樣品測(cè)定

取30批金櫻根藥材，按照藥典通則及上述特征圖譜和含量測(cè)定方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如下表5-7。

結(jié)果顯示，30批金櫻根重金屬及有害元素的含量中鉛的含量在0.2～1.8 mg/kg、鎘的含量在0.03～0.3 mg/kg、砷的含量在0.03～0.3 mg/kg、銅的含量在2.2～7.3 mg/kg、汞的含量均未超過(guò)0.01 mg/kg。均在中國(guó)《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》[16]規(guī)定限度內(nèi)，處于安全水平。

薔薇酸是金櫻根的有效成分之一，也是金櫻根質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)。通過(guò)對(duì)不同產(chǎn)地金櫻根進(jìn)行薔薇酸的含量測(cè)定，結(jié)果表明金櫻根薔薇酸含量在0.25%～0.63%，說(shuō)明不同產(chǎn)地的薔薇酸含量存在差異。

30批金櫻根直徑范圍1.1～5.9 cm，變異系數(shù)達(dá)到47.2%，說(shuō)明不同產(chǎn)地金櫻根直徑大小存在較在差異，可通過(guò)感官鑒別可直接分辨大小。醇溶性浸出物的含量在12%～28%，均符合《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（2009年版）對(duì)金櫻根浸出物規(guī)定的限量標(biāo)準(zhǔn)（不少于10%）。

2.4? 金櫻根藥材等級(jí)建立的研究

2.4.1? 聚類(lèi)指標(biāo)的擬定與分級(jí)? 考慮到傳統(tǒng)藥材采用“辨狀論質(zhì)”的原則，再結(jié)合藥材關(guān)鍵質(zhì)量屬性，故選擇直徑、醇溶性浸出物、薔薇酸含量作為金櫻根藥材分級(jí)指標(biāo)。

2.4.2? 分級(jí)? 將每份金櫻根樣品的直徑、浸出物、含量作為聚類(lèi)指標(biāo)，運(yùn)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)30批金櫻根樣品進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可以看出，可將30批金櫻根樣品分為3類(lèi)：樣品S16聚為一類(lèi)，為一等品;樣品S1、S3、S6、S12、S17、S21、S25、S26、S29聚為一類(lèi)，為二等品;其他20份樣品聚為一類(lèi)，為統(tǒng)貨樣品。匯總分析見(jiàn)表8。

同時(shí)結(jié)合各樣品產(chǎn)地及含量結(jié)果情況分析，一等品1批，分布產(chǎn)地為湖南吉首（1批）;二等品共9批，分布產(chǎn)地為湖南吉首（6批）、湖南張家界（1批）、廣西桂林（1批）、貴州銅仁（1批）;二等品等級(jí)以上產(chǎn)地主要分布在湖南省、廣西省、貴州省。

3 討論

金櫻根為常見(jiàn)藥材，但在各省收載的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)簡(jiǎn)單，多以性狀鑒別為主，僅少量含有薄層鑒別[6，10]，不僅方法的前處理過(guò)程較為復(fù)雜、耗時(shí)，而且不環(huán)保，本研究從提取溶劑、提取方式、展開(kāi)劑方面對(duì)薄層鑒別方法作了優(yōu)化篩選，且增加活性成分薔薇酸作為對(duì)照，對(duì)影響薄層鑒別的主要因素如不同薄層板的比較、展開(kāi)溫度、濕度等進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)薄層板的種類(lèi)、溫濕度對(duì)分離效果影響均較小，優(yōu)化后的方法展開(kāi)斑點(diǎn)數(shù)目較多且清晰，分離效果好，Rf值重復(fù)性好，可以區(qū)分偽品，對(duì)金櫻根藥材具有較好的鑒別效果。

金櫻根主要含三萜、黃酮、鞣質(zhì)類(lèi)成分，其中質(zhì)控成分薔薇酸與委陵菜酸同為三萜類(lèi)同分異構(gòu)體，較難分開(kāi)，故文獻(xiàn)采用五氟苯基混合鍵合在超高純堿基去活硅膠基的PFP-C18柱[15]，兼顧C(jī)18與五氟苯基的雙重特點(diǎn)，具有獨(dú)特的選擇性，相對(duì)于其他普通C18柱有明顯的優(yōu)勢(shì)，但專(zhuān)用色譜柱柱壓高，檢驗(yàn)成本高，實(shí)驗(yàn)中嘗試不同廠家不同規(guī)格PFP色譜柱，包含SHIMADZU Shim-pack Scepter PFPP-120 （150 mm×4.6 mm，3 μm）、菲羅門(mén) Titank F5（150 mm×4.6 mm，3 μm）、Waters Xselect HSS PFP（250 mm×4.6 mm，5 μm）、CAPCELL PAK PFP （250 mm×4.6 mm，5 μm），經(jīng)過(guò)多批次多基原樣品測(cè)定，最終確定Waters Xselect HSS PFP（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）色譜柱檢測(cè)結(jié)果與文獻(xiàn)[15]報(bào)道色譜柱結(jié)果一致，拓展了色譜柱的耐用性，所測(cè)定結(jié)果均一致，并根據(jù)實(shí)測(cè)結(jié)果建立金櫻根藥材的特征圖譜，在一定程度上豐富了金櫻根藥材的鑒別方法，為其質(zhì)量控制提供參考，提高了金櫻根的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。將不同產(chǎn)地金櫻根按照提升后的質(zhì)控方法進(jìn)行檢驗(yàn)，采用聚類(lèi)分析法對(duì)30批金櫻根藥材進(jìn)行等級(jí)評(píng)價(jià)，對(duì)中藥材的等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行有益嘗試，結(jié)果顯示，不同省份的不同批次樣品質(zhì)量波動(dòng)較大，而湖南省樣品優(yōu)質(zhì)且不同批次質(zhì)量較穩(wěn)定。

本研究從藥材的特征性成分出發(fā)，分別從定性和定量?jī)蓚€(gè)方面對(duì)金櫻根藥材進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，結(jié)合傳統(tǒng)的中藥材分級(jí)方法和現(xiàn)代科學(xué)方法，制定一套金櫻根藥材完整的評(píng)價(jià)方法，達(dá)到提升該藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的目的。本方法結(jié)果準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、客觀，重復(fù)性好，可用于藥材的質(zhì)量控制;不同產(chǎn)地重金屬含量均在中國(guó)《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定范圍內(nèi)，處于安全水平。本研究所提出的3個(gè)等級(jí)規(guī)格藥材的不同等級(jí)特性區(qū)分明顯，實(shí)踐中容易掌握，對(duì)藥材的采收加工、銷(xiāo)售流通及臨床應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)和實(shí)踐意義。

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