不同生物藥劑防治葡萄霜霉病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定

楊波 姜彩鴿 宋雙 張華普 張怡

摘要 [目的] 篩選對(duì)葡萄霜霉病防效最佳的生物藥劑。[方法]選擇0.3%丁子香酚、0.3%苦參堿、10%多抗霉素等9種生物藥劑開(kāi)展葡萄霜霉病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定。[結(jié)果]供試藥劑對(duì)孢子囊萌發(fā)抑制效果最好的是0.3%苦參堿，其EC50值和EC90值分別為2.183 4和0.546 4 mg/L，其次是0.3%丁子香酚;而在葡萄霜霉病預(yù)防和治療的毒力測(cè)定中，預(yù)防和治療效果最好的藥劑是0.3%丁子香酚，其次藥劑效果較好的為0.3%苦參堿。[結(jié)論] 0.3%丁子香酚和0.3%苦參堿可作為生物藥劑防治葡萄霜霉病。

關(guān)鍵詞 葡萄;葡萄霜霉病;生物藥劑;毒力測(cè)定

中圖分類號(hào) S 436.631.1? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2022）01-0137-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.01.036

Toxicity Determination of Different Biological Fungicides for Controlling Grape Downy Mildew in Laboratory

YANG Bo1，2， JIANG Cai-ge1， SONG Shuang1 et al

（1. Institute of Plant Protection，Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Yinchuan， Ningxia 750002;2.Ningxia Agricultural Reclamation， Agriculture， Forestry and Animal Husbandry Technology Extension Service Center，Yinchuan， Ningxia 750021）

Abstract [Objective]To select the best biological fungicides for controlling grape downy mildew. [Method]The indoor toxicity determination of grape downy mildew were used to compare 9 kinds of biological fungicides， including 0.3% Eugenol， 0.3% Matrine and 10% Polyoxin. [Result]0.3% matrine had the best inhibition effect on sporangium germination， its EC50 and EC90 values were 2.183 4 and 0.546 4 mg/L respectively， followed by 0.3% Eugenol. In the toxicity test of grape downy mildew prevention and treatment， 0.3% Eugenol had the best prevention and treatment effect， followed by 0.3% Matrine. [Conclusion] The 0.3% Eugenol and 0.3% Matrine can be used as biological agents to control grape downy mildew.

Key words Vitis vinifera;Grape downy mildew;Biological fungicide;Toxicity determination

基金項(xiàng)目 寧夏自治區(qū)重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“寧夏釀酒葡萄病蟲(chóng)害綠色防控關(guān)鍵技術(shù)創(chuàng)新與示范”（2019BBF02013）;寧夏回族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金“農(nóng)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展和生態(tài)保護(hù)科技創(chuàng)新示范項(xiàng)目”（NGSB-2021-4-04）。

作者簡(jiǎn)介 楊波（1992—），男，寧夏中衛(wèi)人，助理農(nóng)藝師，碩士，從事植物保護(hù)研究。通信作者，研究員，碩士，從事釀酒葡萄病蟲(chóng)害防治技術(shù)研究。

收稿日期 2021-04-15

寧夏回族自治區(qū)賀蘭山東麓因日照充足、熱量豐沛、降雨稀少、晝夜溫差大等氣候特點(diǎn)，被業(yè)界公認(rèn)為葡萄種植的“黃金地帶”[1]，截至目前，賀蘭山東麓葡萄種植面積達(dá)4萬(wàn)hm2[2]。隨著葡萄種植面積的不斷增加，葡萄生產(chǎn)中病蟲(chóng)害的發(fā)生危害也日益加重，尤其是由葡萄霜霉菌[Plasmopara viticola（Berk.dt Curtis）Berl.Et de Toni]引起的霜霉病[3]，該病害在嚴(yán)重發(fā)生時(shí)，葉片呈焦枯狀早落，枝梢扭曲畸形，幼果表面布滿白色的霉層、皺縮脫落，嚴(yán)重影響葡萄的生長(zhǎng)發(fā)育以及果實(shí)的品質(zhì)和產(chǎn)量[4-6]，輕則減產(chǎn)5%～10%，重則可達(dá)60%以上[7]，對(duì)葡萄產(chǎn)業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，已成為制約葡萄產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展的重要病害。

葡萄霜霉病的綜合防治中，藥劑防治是最及時(shí)高效的防治措施，也是目前葡萄生產(chǎn)中最主要的方法。而隨著化學(xué)藥劑在田間的大量使用，藥劑的抗藥性問(wèn)題也在日益增長(zhǎng)，研究表明葡萄霜霉病菌已對(duì)甲霜靈、殺毒礬、乙磷鋁等藥劑產(chǎn)生了不同程度的抗藥性[8-10];有些化學(xué)藥劑毒副作用相對(duì)較大，藥害、污染等問(wèn)題突出，已不能適應(yīng)現(xiàn)代葡萄產(chǎn)業(yè)綠色健康發(fā)展的需求，篩選安全高效環(huán)保的殺菌劑是葡萄生產(chǎn)中的迫切需求。隨著人民物質(zhì)生活的日益改善，對(duì)無(wú)公害、綠色健康農(nóng)產(chǎn)品的需求日益迫切，為適應(yīng)當(dāng)代農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)性調(diào)整，確保農(nóng)業(yè)可持續(xù)、高質(zhì)量發(fā)展，必須重視葡萄霜霉病的藥劑防治工作。近些年，生物制劑防治葡萄霜霉病成為研究的熱點(diǎn)，根據(jù)相關(guān)研究也篩選出了一些對(duì)葡萄霜霉病有效的生物制劑[11-13]，但對(duì)于寧夏葡萄產(chǎn)業(yè)而言，防治霜霉病的藥劑仍相對(duì)單一，且化學(xué)藥劑居多，生物藥劑防治葡萄霜霉病研究明顯不足，是制約該地區(qū)葡萄產(chǎn)業(yè)綠色、健康、高質(zhì)量、可持續(xù)發(fā)展的瓶頸。

筆者選取了9種生物型藥劑，對(duì)寧夏賀蘭山東麓葡萄霜霉病進(jìn)行室內(nèi)藥劑毒力測(cè)定試驗(yàn)，通過(guò)評(píng)價(jià)其室內(nèi)防治效果，為田間藥效評(píng)價(jià)、生產(chǎn)中科學(xué)安全合理防治葡萄霜霉病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥劑

2.0%氨基寡糖水劑（大連凱飛化學(xué)股份有限公司），0.3%苦參堿水劑（桂林集琦生化有限公司），0.3%丁子香酚可溶液劑（南通神雨綠色藥業(yè)有限公司），1 000億芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑（德強(qiáng)生物股份有限公司），10%多抗霉素可濕性粉劑（日本科研制藥株式會(huì)社），100萬(wàn)孢子/g寡雄腐霉可濕性粉劑（捷克生物制劑股份有限公司），3億CFU/g哈茨木霉可濕性粉劑（美國(guó)拜沃股份有限公司），41%乙蒜素乳油（大連木春農(nóng)藥廠有限公司），有效活菌數(shù)≥1億/g木霉菌顆粒劑（上海大井生物工程有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株采集。

菌株采集于寧夏回族自治區(qū)銀川市西夏區(qū)園林場(chǎng)陽(yáng)光玫瑰品種上自然發(fā)病的新鮮葡萄霜霉病樣。

1.2.2 預(yù)試驗(yàn)。

將殺菌劑設(shè)3個(gè)濃度梯度，分別為“<推薦稀釋倍數(shù)”“推薦稀釋倍數(shù)”“>推薦稀釋倍數(shù)”，根據(jù)結(jié)果進(jìn)行濃度梯度調(diào)整，最終以5個(gè)濃度梯度作為正式試驗(yàn)，用以進(jìn)行病菌對(duì)藥劑的敏感性判斷。同時(shí)設(shè)清水對(duì)照。9種生物藥劑對(duì)葡萄霜霉菌毒力測(cè)定濃度設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

孢子懸浮液準(zhǔn)備：取田間自然發(fā)病的新鮮葡萄病葉，用自來(lái)水沖洗凈表面的孢子后，將病葉置于25 ℃條件下保濕24 h來(lái)培養(yǎng)新鮮的孢子;用干凈的毛筆將新鮮孢子刷于無(wú)菌蒸餾水中，配成孢子懸浮液;在顯微鏡下調(diào)整孢子懸浮液濃度至5×105個(gè)/mL用于試驗(yàn)測(cè)定，于4 ℃冰箱15 min低溫處理后用于接種。

1.2.3 孢子囊萌發(fā)測(cè)定。

殺菌劑溶液和孢子囊懸浮液的混合：稀釋孢子懸浮液，用凹玻片取一滴（20 μL）在顯微鏡下觀察，視野中有70～100個(gè)孢子囊時(shí)，備用。取PCR板，每孔均加入20 μL制作好的孢子囊懸浮液，再分別加入20 μL不同濃度的藥液，每種殺菌劑的每個(gè)濃度重復(fù)3次，以滅菌水作對(duì)照。用硅膠板蓋好，放入25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中。

孢子囊萌發(fā)情況的觀察和記載：每隔一段時(shí)間觀察滅菌水對(duì)照組中的孢子萌發(fā)率，當(dāng)萌發(fā)率達(dá)60%～70%則可開(kāi)始觀察試驗(yàn)組萌發(fā)率。具體方法：取20 μL混合溶液于凹玻片中，在顯微鏡下觀察，隨機(jī)觀察4個(gè)視野中孢子囊的萌發(fā)情況，用EVOS數(shù)碼大屏幕倒置顯微鏡拍照保存，統(tǒng)計(jì)每視野中的孢子囊總數(shù)以及萌發(fā)數(shù)。

1.2.4 離體葉片培養(yǎng)。

選取新生枝條上第3～5節(jié)新鮮、長(zhǎng)勢(shì)健康的葉片，分別進(jìn)行預(yù)防作用和治療作用的測(cè)定。每種濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3個(gè)葉片（即1個(gè)藥劑需5個(gè)濃度×3個(gè)重復(fù)×3個(gè)葉片=45片葉，清水對(duì)照另設(shè)）（可以1個(gè)重復(fù)的3個(gè)葉片置于一個(gè)鋪有濕潤(rùn)濾紙的大培養(yǎng)皿內(nèi)，或者同一個(gè)濃度9個(gè)葉片置于一個(gè)鋪有4層濕潤(rùn)紗布的大瓷盤(pán)中，培養(yǎng)時(shí)覆蓋保鮮膜保濕）。

預(yù)防作用：將葡萄新枝條上健康無(wú)病的4～5位葉片用微型噴霧器噴灑同等量不同濃度藥液后自然晾干，放入鋪有濾紙的大培養(yǎng)皿中，分別噴施同等量的5×105個(gè)/mL的孢子懸浮液，用沾有滅菌水的棉花包裹葉柄保濕，置于生物培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度25 ℃、濕度保持在80%左右、光照12 h/d。對(duì)照葉片噴施等量清水晾干，再噴施等量孢子懸浮液。5～7 d 后調(diào)查各重復(fù)發(fā)病情況。注意每1～2 d濕潤(rùn)包裹棉花及濾紙。

治療作用：將新鮮、干凈葉片用沾有滅菌水的棉花包裹葉柄保濕，分別噴施同等量的5×105個(gè)/mL的孢子懸浮液，放入鋪有濾紙的大培養(yǎng)皿中，置于生物培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度25 ℃、濕度保持在80%左右、光照12 h/d;培養(yǎng)24 h后分別噴灑同等量不同濃度藥液，繼續(xù)培養(yǎng)，5～7 d后調(diào)查各重復(fù)發(fā)病情況。注意每1～2 d濕潤(rùn)包裹棉花及濾紙。

調(diào)查方法：根據(jù)產(chǎn)孢面積占整個(gè)葉盤(pán)面積的百分比劃分病級(jí)。0級(jí)，無(wú)病;1級(jí)，1%～5%;3級(jí)，6%～25%;5級(jí)，26%～50%;7級(jí)，51%～75%;9級(jí)，75%以上。

1.3 數(shù)據(jù)處理

孢子囊萌發(fā)抑制率=（對(duì)照萌發(fā)率-處理萌發(fā)率）/對(duì)照萌發(fā)率×100%

病情指數(shù)=[∑（各級(jí)病葉數(shù)×相對(duì)級(jí)數(shù)值）/（調(diào)查總?cè)~數(shù)×9）]×100

抑菌率=（對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)×100%

根據(jù)上述公式計(jì)算病情指數(shù)、抑菌率及孢子囊萌發(fā)抑制率，然后利用DPS數(shù)據(jù)處理軟件，將相對(duì)抑菌率/孢子囊萌發(fā)抑制率換算成概率值，在Excel軟件中根據(jù)藥劑系列濃度的對(duì)數(shù)值及該濃度下相對(duì)抑菌率的概率值建立線性回歸分析，求出藥劑對(duì)葡萄霜霉病菌的毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)及有效抑制濃度（EC50）等。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生物藥劑對(duì)葡萄霜霉病孢子囊萌發(fā)的毒力測(cè)定

由表2可知，不同生物藥劑對(duì)葡萄霜霉病孢子囊萌發(fā)的毒力不同，藥劑EC50值是用來(lái)衡量藥劑間毒力大小的重要指標(biāo)，EC50值越小，即該藥劑對(duì)病菌的反應(yīng)越靈敏，其抑制作用越強(qiáng)，反之抑制作用越差。供試9種生物藥劑對(duì)葡萄霜霉病孢子囊萌發(fā)的敏感性存在一定差異。各藥劑對(duì)葡萄霜霉病孢子囊萌發(fā)的敏感性由大到小依次為0.3%苦參堿水劑>0.3%丁子香酚可溶液劑>10%多抗霉素可濕性粉劑>1 000億芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑>2.0%氨基寡糖水劑>100萬(wàn)孢子/g寡雄腐霉可濕性粉劑>41%乙蒜素乳油>有效活菌數(shù)≥1億/g木霉菌顆粒劑>3億CFU/g哈茨木霉可濕性粉劑，其中0.3%苦參堿水劑和0.3%丁子香酚可溶液劑2種藥劑對(duì)葡萄霜霉病孢子囊的敏感性最高，EC50分別為2.183 4和5.725 6 mg/L，EC90分別為0.546 4和0.377 5 mg/L。

2.2 不同生物藥劑對(duì)葡萄霜霉病菌預(yù)防作用的毒力測(cè)定

由表3可知，9種生物藥劑對(duì)葡萄霜霉病菌預(yù)防作用的毒力測(cè)定存在一定差異。預(yù)防作用效果最好的為0.3%丁子香酚可溶液劑，EC50值為0.932 6 mg/L，EC90值為1.961 7 mg/L，預(yù)防效果最差的藥劑為3億CFU/g哈茨木霉可濕性粉劑，EC50值和EC90值分別為1 244.297 4和2 242.971 4 mg/L。9種生物藥劑對(duì)葡萄霜霉病菌預(yù)防作用的EC50值和EC90值由小到大依次為0.3%丁子香酚可溶液劑<0.3%苦參堿水劑<10%多抗霉素可濕性粉劑<41%乙蒜素乳油<1 000億芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑<有效活菌數(shù)≥1億/g木霉菌顆粒劑<2.0%氨基寡糖水劑<100萬(wàn)孢子/g寡雄腐霉可濕性粉劑<3億CFU/g哈茨木霉可濕性粉劑。

2.3 不同生物藥劑對(duì)葡萄霜霉病菌治療作用的毒力測(cè)定

由表4可知，9種生物藥劑對(duì)葡萄霜霉病菌均有一定的治療作用，但不同藥劑間的治療作用存在明顯差異。0.3%丁子香酚可溶液劑對(duì)霜霉病菌的治療作用最強(qiáng)，EC50值1.954 8 mg/L，EC90值為5.014 3 mg/L，其次治療效果較好的是0.3%苦參堿水劑，EC50值和EC90值分別為3.393 3和4.774 5 mg/L，有效活菌數(shù)≥1億/g木霉菌顆粒劑的治療效果最差，EC50值和EC90值分別為4 158.383 2和6 876.456 1 mg/L。9種生物藥劑的EC50值和EC90值由小到大依次為0.3%丁子香酚可溶液劑<0.3%苦參堿水劑<10%多抗霉素可濕性粉劑<41%乙蒜素乳油<1 000億芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑<100萬(wàn)孢子/g寡雄腐霉可濕性粉劑<2.0%氨基寡糖水劑<3億CFU/g哈茨木霉可濕性粉劑<有效活菌數(shù)≥1億/g木霉菌顆粒劑。室內(nèi)藥劑毒力測(cè)定可為下一步田間藥效試驗(yàn)提供數(shù)據(jù)支撐。

3 結(jié)論與討論

葡萄霜霉病是葡萄上重要的病害之一，在我國(guó)葡萄產(chǎn)地均有發(fā)生，尤其以河北、山東發(fā)病較重，幾乎所有的歐洲葡萄品種都感霜霉病[14]。寧夏賀蘭山東麓葡萄產(chǎn)區(qū)霜霉病也常年發(fā)生，嚴(yán)重制約著本地葡萄產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量、可持續(xù)發(fā)展。自1882年殺菌劑波爾多液防治葡萄霜霉病以來(lái)，化學(xué)藥劑防治霜霉病始終是最直接有效的防治手段之一[15]。但隨著化學(xué)藥劑“3R”問(wèn)題的日趨嚴(yán)重，人們將防治重點(diǎn)從化學(xué)藥劑轉(zhuǎn)向生物藥劑，該試驗(yàn)以不同生物藥劑為研究對(duì)象，通過(guò)室內(nèi)毒力測(cè)定發(fā)現(xiàn)9種藥劑均有一定的抑制效果，但對(duì)孢子囊萌發(fā)抑制最好的藥劑為0.3%苦參堿水劑，其EC50值和EC90值分別為2.183 4和0.546 4 mg/L，其次是0.3%丁子香酚可溶液劑;而在葡萄霜霉病預(yù)防和治療的毒力測(cè)定中，藥劑的預(yù)防和治療效果最好的為0.3%丁子香酚可溶液劑，其EC50值和EC90值均最小，其次藥劑效果較好的為0.3%苦參堿水劑。

近些年，生物藥劑防治葡萄霜霉病已成為葡萄生產(chǎn)上熱點(diǎn)研究領(lǐng)域，包巖[16]在對(duì)幾種藥劑防治葡萄霜霉病中發(fā)現(xiàn)丁子香酚噴霧，可有效控制葡萄霜霉病的發(fā)生，與該試驗(yàn)結(jié)果相一致。曹依靜等[17]研究認(rèn)為1%苦參堿水乳劑可有效防治葡萄霜霉病的發(fā)生，防效達(dá) 92.11%，明顯高于常規(guī)化學(xué)殺菌劑;李寶燕等[18]在對(duì)葡萄霜霉病的生物藥劑防治中認(rèn)為0.3%丁子香酚和1.5%苦參堿可作為防控葡萄霜霉病的有效藥劑使用。岳憲化等[19]研究認(rèn)為哈茨木霉菌可濕性粉劑對(duì)葡萄霜霉病具有較好的防效，但在該試驗(yàn)中哈茨木霉無(wú)論是對(duì)孢子囊的抑制作用還是預(yù)防和治療作用中效果均一般，說(shuō)明藥劑的室內(nèi)毒力測(cè)定和田間藥效并非始終一致，吉沐祥等[11]在研究生物和化學(xué)殺菌劑防治葡萄霜霉病的藥效評(píng)價(jià)中發(fā)現(xiàn)，5種生物藥劑室內(nèi)測(cè)定對(duì)孢子囊萌發(fā)均有抑制效果，但田間實(shí)際防效較低，因此為解決化學(xué)藥劑防治普遍存在的抗藥性及農(nóng)藥殘留超標(biāo)等問(wèn)題，在推廣某種生物農(nóng)藥防治葡萄霜霉病時(shí)，應(yīng)結(jié)合室內(nèi)藥劑毒力測(cè)定和田間藥效試驗(yàn)，該試驗(yàn)只在室內(nèi)比較了不同生物藥劑對(duì)葡萄霜霉病孢子囊萌發(fā)、預(yù)防及治療作用的毒力測(cè)定，想要明確生物藥劑0.3%丁子香酚和0.3%苦參堿的防治效果，其田間藥效還需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

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